錢若文軒，楊柳青，石子晴，陳子彥，胡漢寅，鄒尚樸，朱恒延，潘巍巍

(嘉興學院醫(yī)學院生物教研室， 浙江 嘉興 314001)

I型膠原蛋白α1鏈(collagen type I alpha 1 chain, COL1A1)，由COL1A1基因編碼，它可以構成膠原纖維，同時也作為骨髓的有效成分，參與細胞增殖、浸潤、轉移和血管生成，并且與多種類型腫瘤有關[1-3]。研究表明，在以I型膠原蛋白為支架材料進行人卵巢癌細胞HO-8910 PM體外三維培養(yǎng)時，細胞在I型膠原蛋白基質大部分存活，并且能夠募集成簇，正常生長，通過觀察I型膠原蛋白基質中細胞的形態(tài)、活力和增殖情況，表明I型膠原蛋白所形成的黏性交叉網絡狀結構能夠充分支持卵巢癌細胞的生長[4]。Ⅰ型膠原蛋白基因缺乏可促進乳腺癌細胞轉移[5]，在腦腫瘤中Ⅰ型膠原蛋白是腫瘤微環(huán)境的重要成分[6]。Want3a/β-catenin通路中MRTF-A沉默可降低乙?；M蛋白H3K9和RNA聚合酶在COL1A1啟動子上結合，減少COL1A1的表達，而轉錄因子osterix能夠直接與COL1A1的啟動子相結合，上調COL1A1表達量[7]。

在本研究中，我們通過CRISRP/Cas9技術構建COL1A1基因敲除的人卵巢癌ES-2細胞，通過細胞增殖、克隆形成和細胞遷移研究COL1A1缺失在卵巢癌中的作用，為進一步篩選卵巢癌治療的分子靶標提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

TaKaRa 高保真酶、5×Buffer、T4 DNA連接酶、氨芐青霉素、cDNA逆轉錄試劑盒和qPCR試劑盒均購自大連寶生物公司；T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)和BbsI購自NEB；DL10000 DNA Marker、PCR產物回收試劑盒、 DNA膠回收純化試劑盒和質粒提取試劑盒均購自Axygen BioSciences； Lipofectamine 3000轉染試劑購自Invitrogen； DH5α感受態(tài)細胞由本實驗室保存； Polybrene購自Sigma； PolyJetTM轉染試劑購自SignaGen； FBS購自Gibco；DMEM/FI2 和RPIM-1640細胞培養(yǎng)液、PBS、胰蛋白酶和青鏈霉素購自HyClone；TRIzol均購自Invitrogen； β-actin抗體購自Cell Signaling Technology; COL1A1抗體購自Santa Cruz;各種II抗購自 Jackson Labs。PX459質粒由美國加州大學圣地亞哥分校管坤良教授贈送。

2 動物和細胞

ES-2卵巢癌細胞由購自中科院上海細胞所。 ES-2細胞使用DMEM/F12細胞培養(yǎng)液(含有10% FBS和1%青鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞1 ∶ 3的比例傳代，每1～2 d換液以供后繼實驗使用。6～8周齡BALB/c 雌性裸鼠，SPF級，體重20～30 g，10只購自浙江省實驗動物中心(合格證編號為20130016009052)，裸鼠飼養(yǎng)在嘉興學院醫(yī)學院實驗動物中心，SPF級。

3 主要方法

3.1脂質體轉染和COL1A1敲除的卵巢癌細胞篩選COL1A1基因的sgRNA序列連接參照文獻[8]。COL1A1-1: GACGGGACAGCACTCGCCCT;COL1A1-2: GCAGGAGATTACCTCGACGC。1×105個卵巢癌ES-2細胞接種于6孔板，使用Lipofectamine 3000轉染試劑將構建好的PX459空載體、PX459-COL1A1-1和 PX459-COL1A1-2質粒轉染到ES-2細胞。轉染 8 h后給細胞換成正常培養(yǎng)液。24 h后給細胞加嘌呤霉素(2 mg/L)篩選 3 d， 獲得穩(wěn)定敲除COL1A1基因的細胞系。

3.2細胞計數 血細胞計數板計數，每孔分別取1×105個對照細胞(WT)與COL1A1基因敲除的卵巢癌細胞ES-2(COL1A1 KO)接種于6孔板過夜培養(yǎng)，換成新鮮培養(yǎng)液或無血清培養(yǎng)液連續(xù)3 d計數，每天計數前用倒置熒光顯微鏡拍照。

3.3TRIzol法提取細胞總RNA和定量PCR 卵巢癌細胞用TRIzol法提取細胞總RNA，過程詳見試劑說明，使用核酸定量分析儀測 RNA濃度。逆轉錄過程如下：65 ℃保溫5 min，冰上迅速冷卻，98 ℃ 10 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，45個循環(huán)。將cDNA以1 ∶5比例用DEPC水稀釋，對照組cDNA和實驗組cDNA用以實時熒光定量PCR檢測，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1. The sequences of the primers

MMP-13: matrix metalloproteinase-13; TIMP-1: tissue inhibitor of metalloproteinase-1; BMP2: bone morphogenetic protein 2.

3.4Western blo實驗 將對照細胞與COL1A1敲除的卵巢癌ES-2細胞過夜培養(yǎng)，計數，分別收集5×105個對照細胞與COL1A1敲除的卵巢癌細胞于1.5 mL的離心管中，收集細胞，提取細胞總蛋白，取100 μg總蛋白做SDS-PAGE，轉至PVDF膜上， 5%脫脂奶粉中封閉過夜, TBST洗膜3次， 每次10 min，與抗β-actin和COL1A1抗體4℃孵育過液，TBST洗膜3次， 每次10 min，加入II抗孵育TBST洗膜3次， 每次10 min，雜交反應后應用ECL Western blot化學發(fā)光試劑盒暗房顯影。

3.5PI-Annexin V染色檢測細胞凋亡 將對照細胞與COL1A1敲除的卵巢癌細胞ES-2過夜培養(yǎng)，計數，分別收集1×106個細胞于15 mL的離心管中，用預冷1×PBS補足至2 mL， 離心5 min棄上清，再用預冷的2 mL 1×PBS洗滌2次,用1 mL 1× binding buffer重懸細胞，取1×105個細胞(即100 μL液體)放置到1.5 mL 離心管中， PI-Annexin V染色按照試劑盒說明操作，設置對照，室溫避光放置15 min, 用流式細胞術檢測細胞凋亡。

3.6軟瓊脂集落形成實驗 配制0.5%下層膠，取1.5 mL混合液于6孔板，配制底層膠，室溫靜置15 min待膠凝固。將對照細胞與COL1A1 KO的細胞用培養(yǎng)液將細胞吹打成單細胞懸液，血細胞計數板計數，與 0.35%頂層膠混合，接種于6孔板，細胞數為每孔2 500。室溫靜置15 min待膠凝固，在上層放入 2 mL新鮮DMEM培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)14～20 d，用臺盼藍染色后計算集落數(每個集落的細胞數目大于50), 每組設3個重復，實驗重復3次。

3.7細胞劃痕實驗 將對照細胞與COL1A1基因敲除的卵巢癌細胞ES-2接種于6孔板過夜培養(yǎng)，待細胞密度達到 80%用200 μL吸頭在細胞表面劃過，使細胞形成劃痕，給細胞換成無血清培養(yǎng)液，分別在0 h、10 h和20 h在同一位置照相,觀察細胞的遷移。

3.8免疫熒光 分別取1×105個對照細胞與COL1A1基因敲除的ES-2細胞,接種于放置玻片的24孔板，細胞過夜培養(yǎng)，PBS洗1次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗3次，用含5%BSA的PBST封閉液室溫封閉1 h, 棄封閉液加入 p-histone H3、p-H2AX、cleaved caspase-3和Ki-67 I抗(1 ∶200)室溫1 h，PBS洗3次， 加入150 μL II抗，室溫避光孵育1 h，DAPI 復染5 min，PBS洗3遍，封片，觀察。

3.9PI染色檢測細胞周期 分別收集1×106個WT和COL1A1基因敲除ES-2細胞于1.5 mL離心管中，離心去上清，加入1 mL預冷的PBS洗滌，離心，去上清，再加入300 μL預冷的PBS，重懸細胞。再將重懸液緩慢滴入700 μL預冷的無水乙醇中，固定過夜。第2天將1.5 mL的固定液轉移至15 mL離心管中，補加2 mL PBST，離心去上清。用2 mL預冷的PBST緩慢重懸細胞，離心去上清，操作同上一步，2次。用500 μL染色液重懸細胞，轉移至1.5 mL離心管中，避光30～60 min,用流式細胞儀檢測細胞周期。

3.10裸鼠荷瘤模型 6～8周齡BALB/c 雌性裸鼠，SPF級，體重20～30 g，共10只，分成2組，每組5只。在無菌條件下，每只裸鼠兩側各注射5×105個細胞，第1組注射WT ES-2細胞,第2組注射COL1A1基因敲除ES-2細胞。1周后用游標卡尺測量腫瘤大小，待腫瘤直徑≥15 mm，深度麻醉后處死小鼠取腫瘤并稱重。

4 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 COL1A1敲除抑制卵巢癌ES-2細胞增殖、集落形成和遷移

通過CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除人卵巢癌ES-2細胞中COL1A1基因，如圖1A所示，ES-2細胞中COL1A1基因出現了大片段堿基順序紊亂；Western blot結果顯示COL1A1基因敲除組COL1A1蛋白表達量顯著降低,見圖1B。這些結果表明我們通過CRISPR/Cas9基因編輯技術在卵巢癌ES-2細胞中成功敲除COL1A1基因。我們連續(xù)3 d對野生型ES-2細胞和COL1A1基因敲除ES-2細胞進行計數，結果顯示無論在有血清還是無血清的培養(yǎng)液里ES-2野生型ES-2細胞增殖率均明顯高于Col1a1基因敲除ES-2細胞 (P<0.01),見圖1C。免疫熒光檢測表明在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中增殖相關蛋白Ki-67表達顯著降低，見圖3B, Western blot檢測p-histone H3蛋白的表達量在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中明顯增加，見圖4B。軟瓊脂集落形成實驗結果顯示COL1A1敲除顯著抑制細胞集落形成能力(P<0.01)，見圖1D。細胞劃痕實驗結果顯示COL1A1敲除抑制了卵巢癌細胞的遷移(P<0.01)，見圖1E。

Figure 1.COL1A1gene deletion inhibited the proliferation, colony formation and migration of human ovarian cancer ES-2 cells. A: genomic sequencing ofCOL1A1deletion in ES-2 cells; B: COL1A1 protein expression in ES-2 cells was detected by Wes-tern blot； C： the proliferation of ES-2 cells with or without fetal bovine serum (FBS) was determined by Trypan blue staining; D: the number of colonies formed by ES-2 cells was counted after Trypan blue staining; E: the migration of ES-2 cells was determined by wound-healing assay (×10). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.
圖1COL1A1基因敲除抑制卵巢癌細胞增殖、集落形成和遷移

2 COL1A1敲除將卵巢癌細胞周期阻滯在G2期

COL1A1敲除的卵巢癌細胞G1和S期細胞減少，G2期細胞顯著增加(P<0.01)，見圖2A。實時定量PCR檢測細胞周期相關基因p53下游基因Noxa和p16的表達在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中顯著增加(P<0.01)，見圖2B。

Figure 2. Deletion ofCOL1A1affected ES-2 cell cycle. A: the cell cycle was measured by flow cytometry； B: Noxa and p16 mRNA expression was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsWT group.
圖2COL1A1缺失影響ES-2細胞周期

3 COL1A1敲除促進細胞凋亡和DNA損傷

PI-Annexin V細胞凋亡實驗表明COL1A1敲除的卵巢癌細胞凋亡顯著增多(P<0.01),見圖3A。免疫熒光檢測細胞增殖相關蛋白Ki-67在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中低表達，凋亡相關蛋白cleaved caspase-3和DNA損傷相關蛋白p-H2AX在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中高表達,見圖3B。Western blot結果表明COL1A1敲除還促進凋亡相關蛋白cleaved PARP蛋白表達增加,圖4B。

Figure 3. Deletion ofCOL1A1promoted apoptosis and DNA damage of ES-2 cells. A: the cell apoptosis was detected by PI-Annexin V staining and flow cytometry; B: immunofluorescence was used to detect the expression and distribution of Ki-67, cleaved caspase-3 and p-H2AX (green). DAPI for DNA (blue). The scar bar=30 μm. *: cleaved caspase-3 staining positive cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.
圖3COL1A1缺失促進ES-2細胞凋亡和DNA損傷

4 COL1A1敲除通過影響多種分子表達而抑制卵巢癌細胞增殖

RT-qPCR檢測結果顯示，在COL1A1敲除的細胞中osterix和MMP13的mRNA表達量顯著減少(P<0.01)，aggrecanase-1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (bone morphogenetic protein 2, BMP2)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)表達量顯著增多(P<0.01)，而金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metallopro teinase 1, TIMP1)mRNA表達無顯著差異(P>0.05); Western blot檢測結果表明，COL1A1敲除的細胞中p-ERK1/2和Akt表達量明顯增加，見圖4。

Figure 4. Effects ofCOL1A1deletion on the expression of various molecules in ES-2 cells. A: the mRNA expression of osterix, MMP-13, aggrecanase-1, aggrecan, TIMP1 and BMP2 was detected by RT-qPCR; B: the protein levels of ERK1/2, p-ERK1/2, p-histone H3, PARP, cleaved PARP and Akt were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsWT group.
圖4COL1A1缺失對多種分子表達的影響

5 COL1A1敲除抑制卵巢癌細胞在裸鼠體內增殖

為了進一步驗證COL1A1缺失在體內的作用，給裸鼠分別注射了WT和COL1A1敲除ES-2細胞,并記錄裸鼠腫瘤的大小及稱重。結果顯示，COL1A1敲除在體內明顯抑制腫瘤生長，見圖5A、B。Western blot結果顯示，COL1A1敲除的腫瘤組織中p-ERK1/2表達增加，p-histone H3表達降低(圖5C)。RT-qPCR檢測結果顯示， osterix和MMP-13在COL1A1敲除的腫瘤組織中低表達，而aggrecanase-1在COL1A1敲除的腫瘤中高表達,見圖5D。

Figure 5.COL1A1deletion inhibited tumor growth in vivo. The WT andCOL1A1-deficient ES-2 cells (5×105cells per injection) were subcutaneously implanted into nude mice. A: the tumor growth curve; B: the tumor size and weight at the end of the experiment; C: the protein levels of COL1A1, ERK1/2, p-ERK1/2 and p-histone H3 in the tumor with COL1A1 deletion; D: the mRNA expression of MMP-13, osterix and agrecanase-1 was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3～5.**P<0.01vsWT group.
圖5COL1A1缺失抑制裸鼠體內腫瘤形成

討 論

COL1A1基因編碼I型膠原的pro-α1鏈，I型膠原蛋白的三螺旋包含2條α1鏈和1條α2鏈[9]。I型膠原蛋白是形成原纖維的膠原蛋白。COL1A1作為原癌基因與腫瘤發(fā)生密切相關[10-12]。Mori等[13]研究發(fā)現COL1A1在人膀胱癌分化和轉移中具有重要作用。Liu等[14]證實COL1A1能夠介導乳腺癌轉移，可以作為乳腺癌潛在的治療靶點。此外，COL1A1還作為肝癌發(fā)生和發(fā)展的一個重要標志物[15]，但COL1A1在卵巢癌中的作用研究較少。

本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯方法檢測卵巢癌細胞中COL1A1的功能，該基因編輯方法是在引導RNA指導下與目的核酸片段進行靶向結合并切割， DNA片段可以是有編碼功能也可以是沒有編碼功能的。另外，研究表明CRISPR/Cas9體系的脫靶效應要遠低于RNA干擾。最為重要的是利用CRISPR/Cas9體系編輯的細胞單克隆表型長時間內較穩(wěn)定，可以用于動物體內研究，因此本研究采用CRISPR/Cas9基因編輯方法進行相關研究[16]。實驗結果顯示,COL1A1基因敲除可在體外抑制細胞的增長與遷移，在體內可減慢腫瘤的生長速度。COL1A1敲除的卵巢癌細胞被阻滯在G2期，促凋亡基因Noxa和調控細胞周期的p16基因表達增多。此外，細胞增殖相關蛋白Ki-67和p-histone H3在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中低表達，而凋亡相關蛋白cleaved caspase-3和cleaved PARP在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中高表達。這些結果表明，在卵巢癌細胞中敲除COL1A1可以影響細胞周期、抑制細胞增殖，通過影響caspase-3蛋白的表達從而影響細胞凋亡。為了尋找分子機制，我們查閱文獻發(fā)現COL1A1敲除影響多種靶基因表達。osterix能夠直接與COL1A1的啟動子結合誘導COL1A1基因表達[17]。RT-qPCR驗證顯示無論在體內還是體外COL1A1敲除的卵巢癌細胞osterix和MMP-13表達減少，agrecanase-1表達上升。

基質金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類具有鋅離子依賴性的內源性蛋白水解酶，可介導腫瘤新生血管的形成，調節(jié)腫瘤細胞與基質的黏附，激活具有潛在活性的蛋白來影響腫瘤轉移。研究表明，MMP-1和MMP-9與胃癌發(fā)展和轉移有著密切聯系[18]。MMP-13即膠原酶3在各種生理和病理條件下降解ECM，作用于膠原纖維Ⅳ型和Ⅴ型軟骨膠元質，層粘蛋白等，與胃癌、非小細胞肺癌等的浸潤與轉移有關[19-20]。Li等[21]結果顯示MMP-13基因啟動子區(qū)功能多態(tài)性與上皮性卵巢癌的發(fā)病有關。本研究結果顯示在COL1A1敲除的卵巢癌細胞中，MMP-13表達減少，可猜測COL1A1能抑制MMP-13表達從而減少卵巢癌細胞的增殖轉移。而aggrecanase-1表達上升,可能與其聚集作用相關，增加細胞外基質合成，抑制卵巢癌細胞轉移。

MAPK信號通路參與多種腫瘤細胞增殖，分化，凋亡和遷移等生物學過程[22]。有研究顯示p38 或 ERK1/2 MAPK信號通路可以影響COL1A1的轉錄[15]。本研究顯示COL1A1敲除的卵巢癌細胞p-ERK1/2表達量增加，這表明在卵巢癌細胞中ERK1/2 MAPK信號通路也與COL1A1的表達有關。

綜上所述，COL1A1可以通過影響不同基因轉錄及信號通路蛋白表達，從而調控卵巢癌細胞增殖、凋亡、遷移和DNA損傷。因此，COL1A1可以作為卵巢癌治療的分子靶點，來減緩腫瘤發(fā)展速度。