張 敏，孫 玉，唐平靜，張文君，王漢琴△

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院 1轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心， 2麻醉科， 湖北 隨州 441300； 3十堰市太和醫(yī)院超聲影像科， 湖北 十堰 442000)

一氧化氮(nitric oxide, NO)的產(chǎn)生由內(nèi)皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)介導(dǎo)。蛋白激酶B(Akt)/eNOS通路是流體切應(yīng)力調(diào)節(jié)內(nèi)皮NO分泌的經(jīng)典途徑[1]。研究表明，切應(yīng)力對eNOS的活化不僅可由Akt介導(dǎo)，也可以通過激活蛋白激酶A[2]、接頭蛋白Gab1[3]及核心蛋白glypican-1[4]等而誘導(dǎo)eNOS的活化。

Pim(proviral integration of MMLV)家族是一組編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase)的原癌基因。血管內(nèi)皮生長因子可通過Pim1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞eNOS磷酸化，在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的血管生成中起作用[5]。Pim1和Akt同屬絲/蘇氨酸蛋白激酶，二者能夠直接磷酸化相同底物共同調(diào)控細胞生長[6-7]。前期工作我們利用平行平板流動腔系統(tǒng)，顯示Pim1對切應(yīng)力敏感，動脈大小的層流切應(yīng)力可以誘導(dǎo)其表達[8]。因此，我們提出這樣一個假設(shè)，切應(yīng)力是否也可以通過Pim1調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞NO分泌？

本研究利用平行平板流動腔系統(tǒng)，對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)施加15 dyn/cm2層流切應(yīng)力(laminar shear stress)后，檢測Pim1基因的表達，探討Pim1是否在切應(yīng)力調(diào)節(jié)NO的分泌中起作用，從力學(xué)生物學(xué)角度了解血管eNOS/NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

胎牛血清和M199培養(yǎng)基購自Gibco；EGMTM-2內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)液(Lonza)購自Allendale；TRIzol購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo。SYBR Green Supermix購自Bio-Rad;兔抗Pim1多克隆抗體購自Millipore；兔抗eNOS和p-eNOS (Ser1177)多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；小鼠抗GAPDH單克隆抗體購自碧云天；堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG和馬抗小鼠IgG購自鼎國昌盛生物技術(shù)公司；LipofectamineTM3000購自Invitrogen;其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。BioTek Epoch酶標儀；Bio-Rad熒光定量PCR儀(CFX ConnectTMReal-Time PCR Detection System);平行平板流動腔加載裝置購自上海泉眾機電科技有限公司。

2 方法

2.1HUVECs的培養(yǎng)及鑒定 取新鮮新生兒臍帶(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院產(chǎn)科提供，標本采集經(jīng)過患者家屬知情同意及醫(yī)院倫理委員會通過)，根據(jù)臍帶解剖結(jié)構(gòu)找到臍靜脈后用0.125%胰酶消化，注意讓胰酶充分與血管內(nèi)皮層接觸，持續(xù)消化10 min，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，低速離心細胞懸液，再將懸浮液接種在用0.1 g/L多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，EGMTM-2內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，1～2 d左右換液1次，大約7 d長至融合狀態(tài)。胰酶消化后傳代，免疫熒光鑒定，取第2～4代用于實驗。

2.2流體切應(yīng)力加載 平行平板流動腔系統(tǒng)用于流體切應(yīng)力加載。該系統(tǒng)包括蠕動泵、儲液瓶、管道及流室。流室流道高度0.03 cm、寬度2.4 cm。細胞沿中軸方向種植于7.5 cm×2.4 cm×0.01 cm(長×寬×高)、經(jīng)過0.1g/L多聚賴氨酸包被的玻璃載玻片上。通過此裝置，細胞可接受到穩(wěn)定的層切應(yīng)力刺激。采用τ=6μQ/wh2計算切應(yīng)力強度。本實驗通過調(diào)節(jié)恒流泵大小改變Q值，調(diào)整切應(yīng)力強度以達到實驗所需值。

2.4siRNA干擾實驗 依據(jù)GenBank中人Pmi1基因全長cDNA序列，委托上海生工合成特異性靶向Pim1基因的siRNA片段。待HUVECs生長融合至80%時，用LipofectamineTM3000介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染，實驗方法按說明書進行，轉(zhuǎn)染36 h后，real-time PCR檢測。陰性對照RNA(scrambled siRNA，siScr)序列正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。篩選出最佳siPim1序列正義鏈為5’-GCCCUGAGACCAUCAGAUATT-3’，反義鏈為5’-UAUCUGAUGGUCUCAGGGCTT-3’。未轉(zhuǎn)染組作為空白對照。

2.5實驗分組 本實驗切應(yīng)力大小為15 dyn/cm2層流切應(yīng)力，加載時間為15 min。實驗分2組，切應(yīng)力加載(shear)組和靜止對照(static)組。HUVECs分別轉(zhuǎn)染siScr和siPim1后，再移入平行平板流動腔，切應(yīng)力加載組siScr+shear和 siPim1+shear為實驗組，靜止組siScr+static和siPim1+static為平行對照。

2.6RT-qPCR實驗 采用TRIzol提取細胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。Real-time PCR檢測Pim1表達，Pim1上游引物序列為5’-GCAAATAGCAGCCTTTCTGG-3’，下游引物序列為5’-CCTAGGACCCCTGGAGAGTC-3’；GAPDH上游引物序列為5’-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3’，下游引物序列為5’-CGCCCCACTTGATTTTGG-3’。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，反應(yīng)總體系為20 μL，PCR條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，61.4 ℃ 30 s，40個循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt方法計算mRNA相對表達量。

2.7Western blot檢測 各組HUVECs用PBS清洗1次，加入含蛋白酶抑制劑的1×loading buffer，超聲波粉碎細胞后變性備用；用12%的SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后用5%BSA室溫封閉2 h；Ⅰ抗(抗Pim1、eNOS、p-eNOS (Ser1177)和GAPDH抗體，1∶1 000比例稀釋)4 ℃搖床孵育過夜；Ⅱ抗(堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG和堿性磷酸酶標記的馬抗小鼠IgG，1∶800比例稀釋)，室溫孵育2 h；TBST清洗膜后加入NBT/BCIP顯色液顯色。以GAPDH作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均值±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析。兩組間均數(shù)比較采用Student’st檢驗;多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 切應(yīng)力對HUVECs中Pim1表達和NO分泌的影響

Western blot結(jié)果顯示，與static組相比，shear組HUVECs中Pim1蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖1A。NO分泌檢測結(jié)果顯示，shear組HUVECs NO的分泌量也顯著高于static組(P<0.05)，見圖1B。

Figure 1. Shear stress increased Pim1 expression (A) and NO release (B) in HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsstatic group.
圖1 切應(yīng)力誘導(dǎo)HUVECs中 Pim1表達及NO分泌

2 切應(yīng)力對HUVECs中eNOS 磷酸化的影響

Western blot結(jié)果顯示，與靜止對照組相比較，切應(yīng)力作用5 min，磷酸化eNOS-Ser1177水平即顯著增高(P<0.05)，而且可以持續(xù)到30 min，見圖2。

Figure 2. Shear stress induced phosphorylation of eNOS at Ser1177 in HUVECs. Western blot was used to analyze p-eNOS (Ser1177) and total eNOS protein levels. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsstatic group.
圖2 切應(yīng)力誘導(dǎo)HUVECs中eNOS-Ser1177的磷酸化

3 siPim1轉(zhuǎn)染對切應(yīng)力誘導(dǎo)的Pim1表達的影響

HUVECs分別轉(zhuǎn)染siPim1和siScr后，RT-qPCR檢測Pim1 mRNA表達水平，評估siPim1的抑制效果，結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組和siScr組Pim1 mRNA表達無差異，而siPim1組Pim1 mRNA表達水平顯著低于siScr組(P<0.05)，見圖3A。將轉(zhuǎn)染后的細胞移入平行平板流動腔，Western blot結(jié)果表明，與siScr+static組比較，siScr+shear組Pim1蛋白表達顯著增加(P<0.05)；而與siScr+shear組比較，siPim1+shear組Pim1蛋白表達顯著被抑制(P<0.05)，見圖3B。

Figure 3.Pim1knockdown inhibited shear stress-induced Pim1 expression in HUVECs. A: the mRNA expression le-vel of Pim1; B: the protein level of Pim1 was analyzed by Western blot. Mean±SD.n=3.△P<0.05vssiScr group;*P<0.05vssiScr+static group;#P<0.05vssiScr+shear.
圖3 沉默Pim1抑制切應(yīng)力誘導(dǎo)的Pim1表達

4 siPim1轉(zhuǎn)染對切應(yīng)力誘導(dǎo)的HUVECs eNOS磷酸化和NO分泌的影響

Western blot及NO分泌檢測顯示，與siScr+static組比較，siScr+shear組HUVECs磷酸化eNOS-Ser1177水平及NO分泌量都顯著增加(P<0.05)；而與siScr+shear組比較，siPim1+shear組HUVECs磷酸化eNOS-Ser1177水平及NO分泌量都顯著被抑制(P<0.05),見圖4。

Figure 4.Pim1silencing attenuates phosphorylation of eNOS at Ser1177 and NO production in HUVECs. A: Western blot was used to analyze p-eNOS (Ser1177) and total eNOS protein levels; B: NO in cell culture medium was determined. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiScr+static group;#P<0.05vssiScr+shear group.
圖4 沉默Pim1抑制切應(yīng)力誘導(dǎo)的eNOS磷酸化及NO產(chǎn)生

討 論

流體切應(yīng)力是作用于血管內(nèi)皮細胞最直接的一種力學(xué)刺激，在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。人動脈平均切應(yīng)力大小在10 dyn/cm2～30 dyn/cm2之間，這種強度的切應(yīng)力作用于血管內(nèi)膜，可以刺激內(nèi)皮細胞抗動脈粥樣硬化(anti-atherogenic)基因的表達，促進NO產(chǎn)生，使內(nèi)膜保持抗動脈粥樣硬化表型[9]。本研究選擇15 dyn/cm2的層流切應(yīng)力，觀察到在短時相15 min，HUVECs的Pim1蛋白表達就顯著上調(diào)。研究報道，血管內(nèi)皮生長因子孵育HUVECs 20 min就顯著上調(diào)Pim1 mRNA表達水平[10]。我們用血小板源性生長因子刺激血管平滑肌細胞，在30 min時點，也觀察到Pim1 mRNA表達水平顯著上調(diào)[11]。這些結(jié)果可能和Pim1屬于“立早反應(yīng)(immediate early response)”基因有關(guān)[12]?？赡苁羌毎愋筒灰粯?，刺激方式不一樣，Pim1表達發(fā)生改變的時間點有差別。

Pim1蛋白在結(jié)構(gòu)上缺乏調(diào)節(jié)亞基，Pim1功能被認為與其表達量相一致[13]。本實驗我們首先檢測到加載切應(yīng)力可上調(diào)Pim1蛋白表達，同時HUVECs的NO分泌量也升高，這提示Pim1可能在NO的分泌調(diào)節(jié)中起作用。為了進一步驗證這個假設(shè)，用小干擾RNA轉(zhuǎn)染HUVECs敲低Pim1表達，結(jié)果顯示切應(yīng)力上調(diào)的Pim1 蛋白表達也被抑制，同時NO分泌平行降低。為此，我們初步認為在切應(yīng)力作用下Pim1參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞 NO分泌。

Dimmeler 等[1]在1999年首先發(fā)現(xiàn)切應(yīng)力通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路激活eNOS 在絲氨酸第1 177 位點的磷酸化，增加血管內(nèi)皮細胞NO合成和分泌。因此，我們還需要探討Pim1是否可以和Akt一樣，通過eNOS-Ser1177途徑調(diào)節(jié)NO產(chǎn)生。我們先重復(fù)了已有的研究，觀察了在切應(yīng)力作用下HUVECs中的eNOS磷酸化水平，也證實切應(yīng)力可以持續(xù)激活HUVECs中eNOS-Ser1177的磷酸化。然后，敲減HUVECs中Pim1表達，結(jié)果eNOS-Ser1177磷酸化也被抑制。這就說明切應(yīng)力可能通過Pim1調(diào)節(jié)eNOS活性。當(dāng)然，Pim1與Akt之間是否存在相互聯(lián)系，相關(guān)實驗仍在進行中。

綜上所述，切應(yīng)力可短時相內(nèi)增加HUVECs Pim1表達水平，同時伴隨eNOS-Ser1177磷酸化水平增加和NO的分泌增加。本研究初步證實了Pim1可通過eNOS信號參與切應(yīng)力調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞NO分泌，這可能是切應(yīng)力調(diào)控內(nèi)皮細胞NO分泌的信號途徑之一，但還需要更多研究進一步證實。