張青槐　龐宇舟　藍毓營　韋露秋　陳秋霞　田照　高慧

【摘 要】 目的：探究壯藥龍鉆通痹方對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠（CIA）血清Th22的作用機制。方法：通過牛Ⅱ膠原蛋白與弗氏不完全佐劑混合液誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎樣的大鼠模型，60只雄性Wistar大鼠隨機分為正常組，模型組、甲氨蝶呤組（MTX組），壯藥龍鉆通痹方（簡稱壯方）低劑量組1.35g/（kg·d），壯方中劑量組2.7g/（kg·d），壯方高劑量組5.4g/（kg·d），每組各10只。以足跖容積檢測儀檢測足跖容積變化情況， 流式細胞儀檢測和酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測Th22、IL-22表達水平，HE染色觀察滑膜形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：壯藥龍鉆通痹方高劑量組顯著減小膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型大鼠的足跖容積（P﹤0.05），降低踝關(guān)節(jié)炎癥細胞浸潤，下調(diào)Th22蛋白與其效應(yīng)因子IL-22的表達水平（P﹤0.05）。結(jié)論：壯藥龍鉆通痹方對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠具有較好的治療作用，其作用機制可能與抑制Th22蛋白與其效應(yīng)因子IL-22的表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;壯藥龍鉆通痹方;Th22;IL-22

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2020）23-0011-04

Study on the Regulation Mechanism of Zhuang Yao Long Zuan Tong Bi Recipe on Th22/IL-22 in Collagen-induced Arthritis Rats

ZHANG Qinghuai PANG Yuzhou LAN Yuying WEI Luqiu CHEN Qiuxia TIAN Zhao GAO Hui*

Guangxi University of TCM，Nanning 530001，China

Abstract：Objective To explore the mechanism of Zhuang Yao Long Zuan Tong Bi Fang on serum Th22 in collagen-induced arthritis rats （CIA）. Methods A rheumatoid arthritis-like rat model was induced by a mixture of bovine Ⅱ collagen and Freunds incomplete adjuvant. Sixty male Wistar rats were randomly divided into a normal group， a model group， and a methotrexate group （MTX group） ）， Zhuang medicine Long Zuan Tong Bi Fang （referred to as Zhuang Fang） low-dose group 1.35g/（kg·d）， Zhuang Fang middle-dose group 2.7g/（kg·d）， Zhuang Fang high-dose group 5.4g/（kg·d）， 10 animals in each group. The foot and plantar volume detector was used to detect the changes of foot and plantar volume. Flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect the expression levels of Th22 and IL-22. HE staining was used to observe the changes of synovial morphology.Results The high-dose group of Zhuang Yao Long Zuan Tong Bi Fang significantly reduced the plantar volume of collagen-induced arthritis model rats （P﹤0.05）， reduced the infiltration of inflammatory cells of the ankle joint， and down-regulated the Th22 protein and its effector IL-22 Expression level （P﹤0.05）. Conclusion Zhuang Yao Long Zuan Tong Bi Recipe has a good therapeutic effect on collagen-induced arthritis rats， and its mechanism may be related to the inhibition of the expression of Th22 protein and its effector IL-22.

Keywords：Rheumatoid Arthritis; Zhuang Medicine Long Zuan Tong Bi Fang; Th22; IL-22

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以對稱性關(guān)節(jié)滑膜病理改變和慢性炎癥為主要特征的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)晨僵、腫脹、疼痛、嚴重者表現(xiàn)為關(guān)節(jié)畸形，其發(fā)病率在我國約為0.32%～0.36%，已成為人群致殘的主要疾病之一[1-2]。課題組前期研究表明[3-5]，壯藥龍鉆通痹方可提高 IL-4、IL-10 的水平，能下調(diào)關(guān)節(jié)炎大鼠血清 IFN-γ、TNF-α、MMP-13 水平，提示這可能是其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機理之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細胞亞群失衡與RA的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，CD4+T 細胞功能亞群中的Th22細胞及其分泌的白細胞介素-22（IL-22）是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)[6]，Th22細胞水平與其效應(yīng)因子IL-22在RA患者的滑膜組織表達水平中有上調(diào)作用[7]。本病屬于壯醫(yī)“發(fā)旺”范疇，壯藥龍鉆通痹方是廣西中醫(yī)藥大學(xué)龐宇舟教授治療活動期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗方，該方能明顯降低RA患者的血沉，臨床治療有效率可達85.0%[8]，為進一步的臨床應(yīng)用提供客觀實驗依據(jù)。筆者通過分析膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清Th22和LI-22的表達水平，探討壯藥龍鉆通痹方對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的調(diào)控機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與分組 SPF級雄性Wistar大鼠60只，體重約170～230g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。飼養(yǎng)于本單位SPF級動物實驗房，溫度20～25℃，濕度40%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機分為正常組、模型組、甲氨蝶呤組（MTX組），壯藥龍鉆通痹方（簡稱壯方）低劑量組、壯方中劑量組、壯方高劑量組，每組10只。

1.2 藥物與試劑 壯藥龍鉆通痹方由主藥飛龍掌血、大鉆，幫藥八角楓、兩面針、青風(fēng)藤、九龍?zhí)?、五指毛桃、雞血藤等組成，壯醫(yī)龍鉆通痹顆粒由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬百年樂制藥廠生產(chǎn)（批號：20180508）;甲氨蝶呤片由通化茂祥制藥有限公司生產(chǎn)（MTX，2.5mg/片，生產(chǎn)批號：國藥準字H2202267）;牛Ⅱ膠原蛋白、弗氏不完全佐劑（IFA）購自Sigma公司，流式抗體（CD4和IL-22）（美國Invitrogen公司），IL-22 ELISA 試劑盒（R&D公司）。

1.3 主要儀器設(shè)備 多功能酶標儀（瑞士TEACAN ，M200） ;足跖容積檢測儀（成都泰盟，PV-200）;高冷凍離心機（德國 Sigma，3K15）;倒置顯微鏡（德國萊卡，DM18） 等。

2 實驗方法

2.1 動物模型制備 除正常組外，其余50只按照參考文獻[9]所述方法造成CIA大鼠模型，即牛Ⅱ型膠原溶于0.1mol/L的冰醋酸，最終濃度為 2mg/mL后放置在4℃冰箱中過夜，次日將其與等量的弗氏不完全佐劑完全乳化。在大鼠左后跖底部注射乳劑0.2mL/只，7d后再次免疫，即尾根部注射乳劑0.2mL，進而誘發(fā)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型。大鼠足爪紅腫，足墊增厚，行動遲緩，踝關(guān)節(jié)炎癥細胞浸潤，病理切片提示滑膜增厚，表示造模成功。模型制備成功后第7天開始給藥，模型組予生理鹽水2mL/100g灌胃，每天1次;陽性對照組灌服甲氨蝶呤藥液2.7mg/kg（成人臨床用藥的3倍），每只灌服約0.405mg，每周灌服1次;壯藥龍鉆通痹方成人標準用量為30g/d，龍鉆通痹方高、中、低劑量組分別以龍鉆通痹方（含生藥16、8、4g/kg）2mL/100g，每日分2次灌胃。正常對照組自由飲水，6組大鼠共喂養(yǎng)21d。

2.2 足跖容積測量 使用足跖容積檢測儀測量各組大鼠的足跖容積，測量前在大鼠踝關(guān)節(jié)做標記，以確保測量的準確性，在灌胃后的第7天、第14天、第21天的下午3點進行測量，動態(tài)觀察大鼠足跖容積變化情況。

2.3 流式細胞儀檢測血清Th22水平、ELISA法檢測血清IL-22表達水平 采集大鼠血清2mL，通過靜置離心后得到血清樣本，各步驟按照產(chǎn)品說明書進行，采用流式細胞儀檢測血清Th22表達水平;ELISA法檢測血清IL-22表達水平。

2.4 HE 染色法觀察踝關(guān)節(jié)滑膜病理增厚程度 踝關(guān)節(jié)組織放入4%的多聚甲醛溶液中固定24h后轉(zhuǎn)移至脫鈣中，經(jīng)過包埋、切片、烘干、 脫蠟、HE染色等步驟后，于光鏡下觀察各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜病理切片情況。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 研究數(shù)據(jù)運用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)加減標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗和校正t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠足跖容積變化情況比較 與正常組相比，模型組大鼠的足跖容積明顯大于正常組，在第14天、第21天差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明造模成功;與模型組相比，壯方高劑量組與甲氨蝶呤組足跖容積減小（P<0.05），說明壯藥龍鉆通痹方能夠緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度;結(jié)果見表1。

3.2 各組大鼠血清中Th22、IL-22表達水平比較 與正常組相比，Th22細胞在RA大鼠全血中表達顯著高于正常大鼠，模型組大鼠血清中IL-22顯著升高;與模型組相比，甲氨蝶呤組和壯藥龍鉆通痹方不同劑量組干預(yù)后血清中IL-22水平均有降低，但甲氨蝶呤組和壯方高劑量組降低更顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。結(jié)果見表2。

3.3各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜病理形態(tài)比較 HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜無炎癥細胞浸潤，滑膜表面光滑;模型組滑膜細胞增殖明顯，充滿炎性物質(zhì)，層次不清;與模型組相比，壯藥龍鉆通痹方高劑量劑量組效果明顯，炎癥細胞較少，表面光滑，滑膜增生得到一定緩解，中劑量組次之，低劑量組與模型組無顯著性差異。甲氨蝶呤組和壯方高劑量組效果更好，如圖1所示。

4 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種由遺傳、感染、內(nèi)分泌、免疫等多種因素引起的自身免疫性疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療多以改善病情的抗風(fēng)濕藥（DMARDs）或生物制劑來減輕炎性反應(yīng)、控制疾病進程，但副作用較大，不易被接受[10]。RA屬于中醫(yī)“痹證”的范疇，《素問·痹論》云：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風(fēng)氣盛者為行痹;寒氣盛者為痛痹;濕氣盛者為著痹也”[11]。而壯醫(yī)認為RA的病機實質(zhì)是“網(wǎng)絡(luò)阻滯致痹”， 多由風(fēng)、寒、濕、熱等毒邪乘虛侵入人體阻滯于“龍路”、“火路”干線及網(wǎng)絡(luò)而成，氣血運行不暢，導(dǎo)致筋骨肌肉關(guān)節(jié)疼痛，其壯醫(yī)病名為“滾克”， 屬于壯醫(yī)“發(fā)旺”的范疇，治療當(dāng)以“祛邪解毒、疏通兩路”為法，使人體三氣同步，達到“陰陽和”的健康狀態(tài)[12]。

壯藥龍鉆通痹方是龐宇舟教授研制出治療RA的壯藥制劑，壯藥龍鉆通痹方由飛龍掌血、大鉆、八角楓、兩面針、青風(fēng)藤、九龍?zhí)佟㈦u血藤、五指毛桃根等藥物組成。方中飛龍掌血、大鉆通調(diào)龍路、火路，祛風(fēng)毒，除濕毒，共為主藥;八角楓祛風(fēng)除濕，散瘀止痛;兩面針疏通龍路、火路，清熱毒，消腫痛;青風(fēng)藤調(diào)火路，祛風(fēng)毒，通小便;九龍?zhí)偻埪罚{(diào)谷道，祛風(fēng)除濕;雞血藤補血虛，除濕毒，活血通絡(luò);五指毛桃健脾化濕，舒筋活絡(luò);諸藥合用，共奏通調(diào)龍路、火路，祛邪解毒，舒筋通絡(luò)之功?，F(xiàn)代藥理研究表明，飛龍掌血[13]的有效成分是香豆素類（如Cp.5）和生物堿類（如Cp.9），根部醇提物和水提物具有強大的鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛機理可能與抑制PGE2疼痛介質(zhì)表達有關(guān);大鉆[14]的有效成分是木脂素類（如聯(lián)苯環(huán)二辛烯型木脂萜）和三萜類，具有抗炎作用，能夠減低AA大鼠模型足趾腫脹程度;八角楓[15]主要有效成分是生物堿、酚苷及蒽醌，ZHAI K F等研究發(fā)現(xiàn)八角楓中的水楊酸具有抗炎作用，作用機理可能與抑制金屬蛋白酶-1、-3的表達有關(guān)，青風(fēng)藤[16]富含青藤堿、乙基青藤堿等生物堿類物質(zhì)，主要有鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。由此可見，龍鉆通痹方主要是通過抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等作用來治療RA的。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制復(fù)雜，免疫紊亂相關(guān)研究是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎當(dāng)前研究熱點，新進研究表明Th22在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中起到重要作用，Th22分泌的效應(yīng)因子IL-22可能導(dǎo)致RA的炎癥反應(yīng)而發(fā)病[17]。本研究通過構(gòu)建膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠模型，進一步觀察壯藥龍鉆通痹方干預(yù)RA大鼠模型的足跖容積變化，踝關(guān)節(jié)組織病理改變和對Th22細胞水平與其效應(yīng)因子IL-22的影響。結(jié)果顯示：壯藥龍鉆通痹方高劑量組顯著減小膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型大鼠的足跖容積，降低踝關(guān)節(jié)炎癥細胞浸潤，下調(diào)膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型大鼠Th22細胞水平與其效應(yīng)因子IL-22的表達水平。初步結(jié)果顯示，壯藥龍鉆通痹方可能通過抑制Th22細胞以及Th22細胞分泌因子IL-22的產(chǎn)生水平治療RA，然而具體機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2020-07-02 編輯：程鵬飛）

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（編號：81973976）;廣西中醫(yī)藥大學(xué)校級科研項目（編號：2017MS021）;廣西本科高校特色專業(yè)及實驗實訓(xùn)教學(xué)基地（中心）建設(shè)項目（壯醫(yī)學(xué)專業(yè)）（編號：桂教高教[2018]52號） 。

作者簡介：張青槐（1980-），男，漢族，碩士，副教授，研究方向為壯醫(yī)藥基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。E-mail：57382826@qq.com

通信作者：高慧（1986-），女，漢族，博士，講師，研究方向為中醫(yī)、壯醫(yī)藥基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。E-mail：qhghzsybd@163.com