雷 浪(綜述),雷友香,馮 瓊(審校)

(1.南昌大學(xué)a.研究生院醫(yī)學(xué)部2007級;b.第二附屬醫(yī)院病理科,南昌 330006;2.南昌市精神病院護理部,南昌 330002)

腦損傷具有高致殘率和死亡率,主要原因為腦損傷后繼發(fā)性腦損傷。繼發(fā)性腦損傷可由腦灌注壓不足、腦組織氧代謝障礙、腦內(nèi)過度炎性反應(yīng)、受損腦組織對繼發(fā)性損傷的敏感性增強、腦損傷后致傷因子的釋放增加等多種原因引起,可通過不同途徑加重腦損傷后的病理生理改變,其實質(zhì)是腦組織缺血低氧[1]。通過對熱休克蛋白家族幾十年的研究發(fā)現(xiàn),熱休克蛋白家族與腦損傷程度,損傷形成時間以及腦損傷的預(yù)后密切相關(guān),其中HSP70族在腦損傷中的作用日益受到人們關(guān)注。

1 熱休克蛋白家族概況

熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)也被稱為應(yīng)激蛋白,是生物體在受熱、缺血、缺氧或代謝性毒物等因素刺激時細胞內(nèi)迅速增加的一組蛋白質(zhì),按其分子量大小,可分為 HSP30族、HSP60族、HSP70族、HSP90族等。不同家族的HSPs的亞細胞定位有所區(qū)別。其中人類HSP70家族包括至少12名成員。大致可以分為4類[2]:Hsp72,通常在正常細胞中并不表達或表達量很少。但是在熱應(yīng)激或其它應(yīng)激原的作用下,則表達迅速增加,屬于誘導(dǎo)型HSP70;Hsp73,是哺乳動物細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白,在所有的細胞內(nèi)均能表達,并且受熱誘導(dǎo),屬于結(jié)構(gòu)型HSP70;Grp78(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78,glucose-regulated protein 78),這種蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi);Hsp75,也稱為mtHsp70,主要位于線粒體內(nèi),Grp78和Hsp75在應(yīng)激時稍有表達,它們在細胞內(nèi)以分子伴侶的形式發(fā)揮作用。值得注意的是:正常情況下誘導(dǎo)型HSP70位于細胞漿內(nèi),當(dāng)細胞受到應(yīng)激刺激時,細胞核內(nèi)誘導(dǎo)型HSP70迅速增加,細胞漿內(nèi)只有少量存在,細胞處于恢復(fù)階段時,細胞核內(nèi)的誘導(dǎo)型HSP70消失,細胞漿內(nèi)仍有低水平誘導(dǎo)型HSP70表達[3]。

2 誘導(dǎo)型HSP70與腦損傷細胞凋亡

誘導(dǎo)型HSP70已經(jīng)被證明具有神經(jīng)保護作用,最初認(rèn)為這是作為分子伴侶的保護機制。但是最新研究顯示,誘導(dǎo)型HSP70能直接干擾細胞凋亡和壞死信號通路,并且可能參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[4]。

2.1 誘導(dǎo)型HSP70抑制線粒體凋亡通路的激活

線粒體凋亡通路的啟動始于線粒體釋放促凋亡因子進入胞漿。正常情況下這些促凋亡因子包括細胞色素C(cytochrome C,Cyt C)、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor)、Smac/DIABLO(second mitochondrial delived activator of caspases/direct IAP-binding protein with a low isoelectric point)、核酸內(nèi)切酶G(endonuclease G)等,其中Cyt C是一重要因子。Cyt C從線粒體釋放到胞漿后,和CED-4同源物,凋亡酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1),三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)相互作用形成“凋亡體”(apoptosome)并且激活caspase-9,從而啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)。caspase-9激活caspase-3,caspase-3激活脫氧核糖核酸酶(DNase),導(dǎo)致細胞凋亡[5]。劉華等[6]采用重物自由落體造成大鼠急性腦干損傷模型,通過酶聯(lián)免疫的方法檢測急性腦干損傷組織神經(jīng)元胞漿Cyt C的含量較非腦干損傷組為高。誘導(dǎo)型HSP70能通過抑制Cyt C的釋放,并且抑制凋亡誘導(dǎo)因子易位到核上,最終減輕缺血性腦損傷。轉(zhuǎn)基因老鼠過度表達誘導(dǎo)型HSP70后,誘導(dǎo)型 HSP70具有明顯保護腦缺血損傷的作用,作用機制是誘導(dǎo)型HSP70干擾apoptosome的生成以及隔絕凋亡誘導(dǎo)因子[7]。Jiang B.等[8]通過免疫印跡和間接免疫熒光分析的方法觀察到Smac/DIABLO能夠從肌細胞線粒體中釋放,而誘導(dǎo)型 HSP70能夠抑制Smac/DIABLO的釋放并達到減少肌細胞凋亡的作用。

2.2 誘導(dǎo)型HSP70對Bcl-2家族的調(diào)節(jié)

Bcl-2家族蛋白成員在細胞凋亡中起重要作用,它們共同構(gòu)成一個非常復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò),調(diào)控細胞凋亡。Bcl-2家族成員之間可形成同源二聚體或異源二聚體,調(diào)節(jié)細胞死亡和存活信號的平衡狀態(tài),是決定細胞存亡的關(guān)鍵。細胞凋亡的線粒體途徑通過Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)。主要的的抗凋亡成員Bcl-2和Bcl-xL在線粒體外膜發(fā)揮作用,以維持膜的完整性。相反,主要的促凋亡成員Bax和Bak通過破壞線粒體膜的完整性發(fā)揮作用。Bcl-2能阻斷Cyt C和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放,減少caspase的激活,最終起到抗凋亡作用[9]。在腦細胞中,通過病毒介導(dǎo)使得誘導(dǎo)型HSP70過度表達之后,Bcl-2蛋白的水平明顯增高。轉(zhuǎn)基因后Bcl-2過度表達,局灶性腦缺血的梗死灶明顯縮小了;相反,Bcl-2基因敲除后的老鼠,梗死灶的范圍將增加[10]。也就是說,增加誘導(dǎo)型HSP70的表達或者直接通過增加Bcl-2水平可以減少細胞凋亡。誘導(dǎo)型HSP70通過抑制Bax的易位,阻礙線粒體中促凋亡因子的釋放,達到抗細胞凋亡作用。

2.3 誘導(dǎo)型HSP70對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)細胞死亡中起關(guān)鍵作用。誘導(dǎo)型HSP70能夠干擾細胞信號傳導(dǎo)通路導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的活化。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)級聯(lián)是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是 MAPK家族中的重要成員。Kitamura C.等[11]在研究大鼠牙髓細胞凋亡中發(fā)現(xiàn),c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路是導(dǎo)致創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞凋亡的重要途徑之一,而誘導(dǎo)型HSP70是其中的一種抑制分子:誘導(dǎo)型HSP70能夠抑制JNK的脫磷酸化,阻礙其激活從而起到抗牙髓細胞凋亡的作用。研究表明,誘導(dǎo)型HSP70能夠抑制JNK的脫磷酸化,阻礙其激活?；罨腏NK能夠使轉(zhuǎn)錄因子c-Jun磷酸化,從而使一系列特殊的蛋白表達上調(diào)。JNK在神經(jīng)系統(tǒng)中不僅僅是促進細胞凋亡。在正常生理功能下,神經(jīng)系統(tǒng)中JNK的基礎(chǔ)水平比其他組織中更高。誘導(dǎo)型HSP70還能和拓撲異構(gòu)酶1相互作用從而調(diào)節(jié)細胞凋亡。這種機制被證明是不受ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域的影響。誘導(dǎo)型HSP70作為抗凋亡促存活激酶AKt/PKB的重要效應(yīng)物 ,與 κ B(cnuclear factor-kappaB,NFκ B)作用,從而較少它的活化[12]。

3 誘導(dǎo)型HSP70與炎癥

腦缺血后,白細胞浸潤所致的炎癥反應(yīng),在缺血性腦損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。炎癥能加重中風(fēng)造成的損傷。炎癥反應(yīng)包括固有小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活以及促進周邊炎性細胞聚集。在腦缺血造成的炎癥反應(yīng)中,誘導(dǎo)型HSP70也發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。細胞內(nèi)誘導(dǎo)型HSP70參與了一系列的抗炎反應(yīng)。它能阻斷炎癥因子的反應(yīng),例如腫瘤壞死因子α(TNFα)和白介素1(IL-1)。高劑量TNF刺激的老鼠受到了誘導(dǎo)型HSP70的保護后,避免了感染性休克致死。然而丟失hsp70-1基因的老鼠確沒有得到這種保護機制[13]。炎癥通過激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NOS,iNOS)和NADPH氧化酶來產(chǎn)生活性氧化物,而誘導(dǎo)型HSP70能通過幾條路徑限制活性氧化物的產(chǎn)生。有研究顯示:在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中,iNOS的激活是受細菌內(nèi)毒素和/或前炎癥細胞因子刺激誘導(dǎo)的,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)能夠誘導(dǎo) NFκ B轉(zhuǎn)錄到核上,而誘導(dǎo)型HSP70能夠通過干擾NFκ B的激活最終達到抑制iNOS的激活以減少過氧化物的產(chǎn)生[14]。誘導(dǎo)型HSP70能降低中性粒細胞中NADPH氧化酶的活性,并且增加過氧化物歧化酶,以減少巨噬細胞中的過氧化物產(chǎn)生[15]。在星形膠質(zhì)細胞中,低氧低血糖刺激下,誘導(dǎo)型HSP70的過度表達能夠減少活性氧化物的產(chǎn)生,穩(wěn)定線粒體膜電位,維持其正常生理功能,保護大腦對局灶性腦缺血的損傷[16]。在心肌細胞中,誘導(dǎo)型HSP70的過度表達能夠增加線粒體錳過氧化物歧化酶的活性,從而達到保護線粒體和減少心肌細胞凋亡的作用[17]。誘導(dǎo)型HSP70是通過調(diào)節(jié)NFκ B途徑來完成它的炎癥調(diào)節(jié)功能。NFκ B是免疫一炎癥反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子。NFκ B通常與抑制蛋白家族Iκ B相結(jié)合,以無活性的三聚體形式存在于胞漿中。感染、缺血/氧、組織損傷等刺激作用下,Iκ B 被 IKK(Iκ B kinase)磷酸化,繼而發(fā)生泛素化,最后被265蛋白酶體降解,游離出的NFκ B轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi),與靶基因調(diào)控元件中的κ B序列特異性結(jié)合,單獨作用或與其它轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用,調(diào)節(jié)靶基因表達。包括TNF、IL-1、iNOS和基質(zhì)金屬蛋白酶-9[18]。誘導(dǎo)型HSP70能夠抑制NFκ B轉(zhuǎn)導(dǎo)到核內(nèi)。在腦中風(fēng)大鼠模型中,誘導(dǎo)型 HSP70的過度表達能夠減少NFκ B的激活。誘導(dǎo)型HSP70的這種功能是通過與NFκ B蛋白直接作用或者和NFκ B調(diào)節(jié)通路中其他蛋白作用來完成的[19]。

4 誘導(dǎo)型HSP70在腦損傷研究中的臨床以及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景

Mikawa S.等[20]用落體撞擊法復(fù)制小鼠閉合性顱腦損傷模型,并且分1、4、24和48 h等4組,用原位雜交技術(shù)觀察了誘導(dǎo)型HSP70 mRNA的表達情況,發(fā)現(xiàn)損傷后1 h組沒有明顯改變,損傷后4 h和24 h組HSP70 mRNA在腦損傷灶周圍有明顯表達,損傷后48 h組恢復(fù)正常水平。大鼠腦部液體沖壓傷(2.2～2.4 atm)后2 h,通過原位雜交技術(shù)觀察到誘導(dǎo)型HSP70 mRNA的表達局限于挫傷區(qū)域的周圍皮質(zhì);傷后6 h,誘導(dǎo)型HSP70 mRNA在深部皮質(zhì)層和最大損傷區(qū)域的上部皮質(zhì)層中持續(xù)表達;傷后24 h,大腦所有區(qū)域的HSP70 mRNA均降至與對照組相當(dāng)?shù)乃絒21]。Allen G.V.等[22]對小腦局灶性砸傷的大鼠的研究發(fā)現(xiàn),在重度砸傷后,誘導(dǎo)型HSP70主要集中表達于創(chuàng)傷區(qū)域的顆粒細胞和同側(cè)深部小腦核;輕度砸傷,誘導(dǎo)型HSP70則僅表達于顆粒細胞層。由此可以看出,誘導(dǎo)型HSP70表達與腦損傷程度有關(guān)。有研究顯示:在小鼠閉合性顱腦損傷模型上,誘導(dǎo)型HSP70 mRNA水平僅在大腦皮層短暫性增高,峰值則出現(xiàn)在傷后1 h(6倍于對照組)[23]。裘天侖等[24]通過免疫組化的方法檢測了誘導(dǎo)型HSP70在人腦挫傷組織的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)挫傷腦組織誘導(dǎo)型HSP70陽性細胞的比例在6～24 h最多,隨著時間的推移,逐漸減少,但誘導(dǎo)型HSP70表達時間較長,最長至7 d時仍有少量表達。誘導(dǎo)型HSP70與腦損傷程度明顯相關(guān),創(chuàng)傷越重,挫傷腦細胞的誘導(dǎo)型HSP70表達越高。但當(dāng)腦組織受到不可逆損傷時(GCS評分3～5),誘導(dǎo)型HSP70的表達急劇下降。朱金龍等[25]用落體撞擊法復(fù)制大鼠彌漫性腦損傷模型,傷后分0.5、1、3、6、12 h,1、3、7 d及 10 d共 9組分別與小腦腦干部冠狀切面和距大腦交界處2 mm作冠狀切面取材(1 cm×1 cm),然后制作免疫組化染色,結(jié)果顯示傷后3 h及6 h誘導(dǎo)型HSP70表達明顯增多,傷后12 h達到高峰,傷后1 d陽性細胞數(shù)量開始減少,傷后3 d開始恢復(fù),傷后7 d基本恢復(fù)正常。

在對敗血癥患者的報道中,其外周血淋巴細胞的誘導(dǎo)型 HSP70的表達明顯下降。血清誘導(dǎo)型HSP70高濃度水平能夠改善創(chuàng)傷和嚴(yán)重的敗血癥患者的預(yù)后[26]。有研究表明,心肌梗死和心臟搭橋手術(shù)后,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)型HSP70表達大量增加[27]。因此,高水平的HSPs表達可以提示組織損傷,同時也表明應(yīng)激反應(yīng)越多,相關(guān)組織就會得到更加良好的保護和更好的預(yù)后。誘導(dǎo)型HSP70對于危重病患者和圍手術(shù)期患者的器官功能障礙起到了防止作用?；虔煼ê突瘜W(xué)誘導(dǎo)應(yīng)激療法目前正被視為一種全新療法應(yīng)用于多器官缺血的治療,包括使用谷氨酰胺來增加誘導(dǎo)型HSP70而達到治療病?；颊遊28]。

誘導(dǎo)型HSP70在各種類型腦損傷中的表達不僅是細胞受損的標(biāo)志,而且是腦損傷病情惡化的預(yù)測指標(biāo)[29]。誘導(dǎo)型 HSP70是重要的神經(jīng)保護因子,有著防止遲發(fā)性神經(jīng)元死亡、對抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等作用,它在防止細胞損害和促使受損細胞恢復(fù)方面的作用已得到公認(rèn)。但是國內(nèi)外尚未對誘導(dǎo)型HSP70的表達和腦損傷程度的相關(guān)性上做更為深入的研究,隨著基因技術(shù)、生物工程的發(fā)展,誘導(dǎo)型HSP70在腦損傷程度的法醫(yī)鑒定中將會有廣闊的前景。

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