趙 玲，張 娟，蘇健裕

（1.廣東產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗研究院，廣東 順德 528300；2.華南理工大學 輕工與食品學院，廣東 廣州 510640）

我國水果資源種類繁多，生產(chǎn)量不斷增加，為了延長其保存期，水果加工品的品種也在不斷的擴大。其中，色澤鮮艷、甜美爽口的果汁符合當前人們對飲料營養(yǎng)和健康的迫切需求，已得到各年齡段人群的認可，同時可作冷飲和熱飲、方便攜帶，在生活中隨處可見，在飲料工業(yè)中占有較大的市場份額[1-2]。由于巨大的經(jīng)濟利益驅使，果汁行業(yè)出現(xiàn)了以次充好、摻偽造假的問題，且隨著科技的快速發(fā)展，層出不窮的摻假手段使果汁鑒偽工作的開展難以進行，給我國的出口貿易和食品行業(yè)的安全帶來了很大影響，降低了人們對我國產(chǎn)品質量的信心[3-4]。為杜絕這種違反市場秩序的行為，世界各國致力于果汁鑒偽技術的研究，從單一組分到多組分、單一性狀到多性狀，建立了一系列標準法規(guī)來檢驗和鑒定果汁的真假[5]。本文闡述了目前果汁摻假常用的手段和檢測技術，綜合考慮現(xiàn)代分子生物技術在產(chǎn)品原料和特性成分檢測中的優(yōu)勢，從基因水平出發(fā)，對果汁中植物源性成分等摻假鑒定的研究現(xiàn)狀進行總結，包括聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術、實時熒光PCR（real-time PCR，RT-PCR）技術、數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術、環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）條形碼方法、代謝組學等，對存在的問題進行剖析，以期為廣大相關研究者提供參考。

1 果汁摻假及標準現(xiàn)狀

果汁摻假現(xiàn)象伴隨果汁行業(yè)的出現(xiàn)而存在，隨著果汁市場的發(fā)展，果汁摻假手段更是層出不窮，總結常用摻假方式，包括（1）摻入水；（2）摻入酸；（3）摻入糖；（4）摻入低價水果汁；（5）摻入果渣提取物；（6）摻入膠體物質；（7）假冒果汁產(chǎn)地；（8）以濃縮果汁代替非濃縮果汁或鮮榨果汁；（9）摻入微生物等。隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展，單一摻假方式不能滿足非法商家的需要，一般采用幾種方式組合使用，甚至根據(jù)原水果汁的特征圖譜進行調和，使果汁鑒偽工作越來越困難[5]。

據(jù)統(tǒng)計，國際上果汁摻假現(xiàn)象普遍存在，甚至高達80%，為了打擊擾亂市場秩序和侵害公民經(jīng)濟利益和權益的違法行為，世界各國及組織紛紛出臺了一系列檢測標準及法規(guī)來改善這一現(xiàn)狀[5]。自20世紀80年代開始，德國聯(lián)邦、西班牙、荷蘭等國家先后規(guī)定了蘋果、梨、橙子、葡萄等常見水果原汁的參數(shù)標準值（richtwert schwankungsbreite kennzahl，RSK）的測定方法；日本和臺灣地區(qū)以可溶性和不可溶性固形物含量、灰分、氨基酸態(tài)氮、總酸等指標參數(shù)為依據(jù)來分析評價果汁質量；澳大利亞以無機物（鈣、鉀、磷）、糖類（果糖、葡萄糖、蔗糖）、灰分及其之間的比值來評估果汁含量；歐盟果蔬汁飲料工業(yè)協(xié)會自1993年連續(xù)兩年制定了十九項果汁評價標準；國際食品法典委員會（codex alimentarius commission，CAC）規(guī)定了果汁中可溶性固形物、糖類、乙醇、蘋果酸、檸檬酸、二氧化碳等物質的添加限量[1，6-7]。目前，我國已頒布標準GB 10789—2015《飲料通則》和GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》對果汁的定義、加工方式等作了詳細闡述，關于果汁質量控制的相關標準法規(guī)也不斷完善，主要有GB/T 18963—2012《濃縮蘋果汁》、GB/T 19416—2003《山楂汁及其飲料中果汁含量的測定》、QB/T 4855—2015《果汁中水的穩(wěn)定氧同位素比值（18O16O）測定方法同位素平衡交換法》、GB/T 27305—2008《食品安全管理體系果汁和蔬菜汁類生產(chǎn)企業(yè)要求》、NY/T 2015—2011《柑橘果汁中離心果肉漿含量的測定》、NY/T 707—2003《芒果汁》等?，F(xiàn)有標準在實際檢測中依然存在應用推廣困難、覆蓋范圍不夠全面的問題，需要各國加強新標準、新技術的研究。

檢測技術在果汁鑒偽中具有關鍵性作用，對檢測技術的研究開發(fā)從不間斷。目前，果汁鑒偽技術主要有：（1）感官評價；（2）理化方法：色譜技術、質譜技術、色譜-質譜聯(lián)用技術、光譜技術等；（3）生物學方法：PCR及其改良技術、LAMP技術、DNA條形碼技術等[8-9]。感官鑒定方法起步較早，但結果易受果汁加工方式等外部條件的影響，應用受到限制。隨著科學技術的發(fā)展，出現(xiàn)了智能感官技術，可以有效的對單一新鮮果汁進行評價。理化方法大多對水果汁中含有的標志化合物進行鑒別，但這些特有化合物容易受水果果實生長條件、品種、產(chǎn)地、生長周期、加工方式等因素影響，對復合果汁鑒定更是困難，在實際檢測中的應用具有局限性?，F(xiàn)代生物技術從基因水平出發(fā)，不受果汁加工方式、儲藏條件和果實狀態(tài)等外部因素等影響，具有一定優(yōu)勢，為果汁原料的溯源和質量控制等提供了可靠的技術基礎[10-12]。

2 分子生物技術概述及應用

2.1 普通PCR技術

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種對特定的DNA片段進行體外復制延伸的無細胞克隆技術[13]。PCR技術是開始研究最早、應用最廣泛的生物技術，從1971年KHORANA首次提出核酸的體外擴增開始迅速發(fā)展，到1985年MULLIS假設了PCR的反應過程，再到1988年SAIKI在該反應體系中加入了耐高溫的TaqDNA聚合酶，PCR技術發(fā)展迅速，目前在臨床、食品、醫(yī)藥、生物、環(huán)境等領域得到廣泛應用[14]。在果汁的鑒偽研究和應用中運用最為普遍。

較高的靈敏度和自動化操作等優(yōu)點使該方法廣泛應用于食品摻假中，果汁鑒別中也多有報道[15]。KNIGHT A[16]研究發(fā)現(xiàn)，應用PCR技術可以有效的鑒定出橙汁中含有的中國柑橘成分；SASS-KISS A等[17]通過調查發(fā)現(xiàn)西柚中分子質量為31 kDa和117 kDa的肽可用于西柚果汁的鑒偽；POPPING B[18]利用PCR技術對葉綠體trnT-trnL基因進行差異性分析，檢測出橙汁中含有柑橘汁成分；NG C C等[19]根據(jù)鮮榨和還原橙汁兩種產(chǎn)品中葉綠體基因rbcL的降解程度的不同對二者進行有效的區(qū)分；陳文炳等[20]建立了單重和雙重PCR體系對果汁飲料中普遍存在的植物葉綠體rbcL基因以及核糖體18S rDNA片段等進行檢測；PALMIERI L等[21-22]建立常規(guī)PCR和RT-PCR對漿果種屬進行定性檢測，也可以對漿果與其他植物種屬進行定性鑒別，并得到成功應用；HAN J等[23]研究表明，PCR技術具有比化學分析方法更明顯的優(yōu)勢，如較高的靈敏度和易于優(yōu)化的反應條件等；劉偉紅等[24]利用PCR技術建立了鑒別果汁中柑橘屬成分的方法；HERBST N等[25-26]采用PCR技術對市售果泥、果醬和果汁中葉綠體基因matK進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)可以有效鑒定果泥和果醬中DNA的擴增片段，無法鑒定果汁中的DNA成分；孫建霞等[27]建立了PCR技術對蘋果汁和桃汁進行準確鑒定，并規(guī)定了所建立方法的最低檢測限；賈欣月等[28]建立并優(yōu)化了一種PCR反應體系來快速鑒定鮮榨果汁中櫻桃成分。

PCR技術開始較早，發(fā)展比較成熟，其特異性強、靈敏度高、便于操作、結果直觀、節(jié)省人力、價格低廉等優(yōu)點，有利于國家標準的完善，從而為食品檢測提供依據(jù)。但試驗操作過程中會出現(xiàn)假陰性和假陽性，而且極易產(chǎn)生污染，試驗人員需要檢測污染狀況，采取措施避免和減輕污染的發(fā)生。因此，PCR技術發(fā)展應從可操作性、檢測細節(jié)、操作安全性與簡易性等方面為研究方向，確保檢測技術應用的高效率與高質量。

2.2 實時熒光PCR技術

實時熒光PCR技術原理與普通PCR相似，但實時熒光PCR在反應體系中加入了熒光基團，通過對熒光信號強度的跟蹤檢測來實時監(jiān)控整個過程，具有靈敏度高、結果準確、效率高、特異性強、實時監(jiān)控等優(yōu)點，實用性和通用型較普通PCR技術強，近年來在果汁鑒偽和質量控制中的應用逐漸增多[29-30]。PALMIERI L等[21]建立實時熒光PCR技術鑒別出食品中桔子、草莓、藍莓、菠蘿成分；韓建勛等[31]通過設計梨類甜蛋白基因的特異性引物，建立了實時熒光PCR技術來鑒別梨成分；周蘭等[32]通過實時熒光PCR技術對18S rRNA、ACTB、GAPDH、UBQ、TUB五個內參基因進行檢測，篩選出蘋果的最佳內參基因；梁宇斌等[33]通過設計柑橘屬植物的特異性擴增引物，建立了其SYBGreen實時熒光PCR分析方法，得出該方法的檢出限，并將該方法應用于市售的實際果汁樣品的鑒定中，使該技術的實用性得到驗證；ALDEGUER M等[34]設計了一種基于雙重探針實時PCR（dual-probe real time PCR，DP PCR）分析方法來鑒別橙汁中的柑橘成分。

實時熒光PCR技術與普通PCR技術相比，還有環(huán)保、實時分析、自動化程度高、耗時更短、結果精準等優(yōu)點，是分子生物、食品、臨床、環(huán)境等領域中研究應用最常用的技術，也是目前最常用的果汁鑒偽方法。該技術的發(fā)展應用解決了很多社會性難題，具有較高的經(jīng)濟價值和社會價值，實時熒光PCR技術依然有很大的改進空間，如與高通量測序、基因芯片等技術相結合會顯現(xiàn)出更多的優(yōu)勢，未來在食品鑒偽方面的應用前景巨大。

2.3 數(shù)字PCR技術

數(shù)字PCR（dPCR）是一種新興技術，是由PCR擴增和熒光信號采集兩部分先后交替進行。數(shù)字PCR反應過程原理：首先將樣品核酸模板進行幾萬甚至幾十萬倍稀釋使其成單分子，把這些單分子分配到不同的單元中分別進行擴增，每個單元有0或1各單分子，擴增完成后計數(shù)熒光信號，將有熒光信號的反應單元標記為陽性，沒有熒光信號的反應單元標記為陰性[35]。數(shù)字PCR技術主要有微孔式、微腔式、微滴式等方法，具有準確度高、靈敏度高、耐受性高、效率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，在食品安全檢測中的應用潛力越來越大，在牛肉、豬肉、雞肉、羊肉等動物源性食品中摻入鴨肉的數(shù)字PCR技術已經(jīng)被開發(fā)[36-37]。苗麗等[38]利用微滴式數(shù)字PCR技術對肉制品中羊源性成分定量分析，得出羊肉質量與拷貝數(shù)之間的關系，對羊肉進行絕對定量；楊華等[39]將雙重數(shù)字PCR技術應用于牛肉的鑒偽中，定量檢出了雞肉、鴨肉、豬肉等廉價原料。數(shù)字PCR也應用于植物源食品摻假中，如BUCHER T B等[40]用于橄欖油純度的檢測、SCOLLO F等[41]用于香味水稻的檢測。賈欣月[14]建立特異性數(shù)字PCR技術用于定性鑒別混合鮮榨果汁、非濃縮果汁和濃縮果汁中櫻桃成分，并能得到櫻桃特異性片段che36拷貝數(shù)。此外，李浩等[42]應用數(shù)字PCR技術對植物油中動物源性成分的檢測來鑒定地溝油。

數(shù)字PCR可以根據(jù)原料質量、DAN量和基因拷貝數(shù)的線性關系來確定摻假比例，可以更好的檢測出食品源摻假種類，具備其他檢測方法所沒有的優(yōu)勢，但數(shù)字PCR技術設備昂貴，在果汁鑒偽和質量控制中的應用較少，仍具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.4 DNA條形碼技術

DNA條形碼（DNA barcode）是短的標準化DNA序列，廣泛存在于生物基因組中，通過分析該DNA序列形成了一種快速鑒定物種的技術手段，即DNA條形碼技術[43]。2003年，HEBERT P D N等[44]根據(jù)物種DNA序列的復雜多樣性首次提出DNA條形碼概念。次年，生命條形碼聯(lián)盟（theconsortium for the barcode of life，CBOL）開始計劃建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，至今收入的DNA條形碼數(shù)量不斷增多。隨著被測定的已知DNA條形碼序列的物種越來越多，DNA條形碼技術將會成為物種鑒定的常規(guī)方法[45]。目前DNA條形碼技術在魚品種鑒別[46-47]、藥材類鑒別[48-50]、可食用植物[51]和加工食品中[52]等應用廣泛。

DNA條形碼技術在果汁摻假摻偽的鑒定研究也有報道。如BRUNI I等[53]通過序列比對篩選出匹配效果較好的matK和psbAtrnH基因片段，使DNA條形碼技術鑒定水果的成功率得到很大提高，建立了DNA條形碼技術來區(qū)分可食用及不可食用水果物種。JAAKOLA L等[54]采取DNA條形碼技術與高分辨率熔解曲線（high-resolution melting，HRM）技術聯(lián)用手段分析越橘的內轉錄間隔區(qū)和質體DNA、核糖體蛋白L36-核糖體蛋白S8基因序列，有效的區(qū)分出8個越橘品種，適用于漿果類加工產(chǎn)品中摻入越橘成分的鑒偽，但會因DNA斷裂現(xiàn)象而限制該技術在深加工漿果果汁中的應用。李梅閣[55]建立的DNA條形碼技術成功地鑒定出市售果醬、果汁等漿果產(chǎn)品中單一成分和復雜成分，具有良好的適用性。

DNA條形碼技術可以一次性快速鑒定大量樣本，準確性高、通用性高、易于操作和標準化，不受物種個體完整性和發(fā)育狀況等因素的影響，在物種鑒定中優(yōu)勢明顯。但DNA條形碼技術在果汁摻偽造假檢測的應用研究相對較少，還處于初始研究階段，存在巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.5 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術是一種體外等溫核酸擴增技術，是由日本學者NOTOMI于2 000年發(fā)明的新型生物檢測方法[56]。LAMP反應過程是在恒溫（60～65 ℃）條件下，經(jīng)特殊設計的兩對內、外引物和一對環(huán)引物特異性識別靶序列上6個獨立區(qū)域，在BstDNA聚合酶的作用下啟動鏈循環(huán)進行核酸片段的復制延伸。在這一過程中引物設計是LAMP實驗成功的關鍵。LAMP反應體系省略了反復熱變形過程，縮短了反應時間，提高了實驗效率，在1 h內可以達到109倍靶序列拷貝。實驗結果可以通過加入顯色液直接觀察、電泳檢測、濁度儀檢測等方式進行判定[57]。

LAMP技術所需實驗設備簡單，不需要投入很大的成本；LAMP反應體系比普通PCR方法靈敏100倍；此外還具有特異性強、操作簡便、效率高、結果直觀等優(yōu)點，目前在各個領域已經(jīng)被廣泛的應用，如加工食品中過敏原成分的快速檢測[58]、食用燕窩的快速檢測[59]以及肉類食品中動物品種鑒定[60]。但在果汁中植物源性成分等物種鑒定中的應用報道較少，具有很大的研究空間。

2.6 代謝組學

代謝組學是以相對分子質量＜1 000 Da的代謝物為研究對象，采用先進的現(xiàn)代技術手段通過定量定性分析該代謝物來達到物種鑒定的目的[61-62]。近年來逐漸成為現(xiàn)代食品科學研究的重要工具，特別是解決與食品安全、質量和營養(yǎng)相關的問題。JANDRI? D等[63]研究發(fā)現(xiàn)，代謝組學方法可用于發(fā)現(xiàn)追蹤食物摻假的生物標志物，為快速檢測摻假果汁中較便宜的替代品，采用超高液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質譜（high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flightmass spectrometry，UPLC-QTOF/MS）聯(lián)用技術進行非靶向代謝物指紋圖譜分析，并進行多元數(shù)據(jù)分析，使代謝組學在食品摻假中的應用得到驗證。俞邱豪[64]通過電子鼻技術檢測小漿果果汁中的揮發(fā)性氣味代謝產(chǎn)物快速鑒別出藍莓汁和蔓越莓汁成分。

代謝組學在解決食品安全、營養(yǎng)、質量相關的問題中起到關鍵作用，是現(xiàn)代食品科學研究的重要工具之一，但代謝組學技術成本高、實驗條件要求高等使該技術的應用受到限制。目前，樣本的采集、處理和代謝物中獨特的生物標志物的尋找是研究熱點和難點，需要研究者進一步探索。

3 結論與展望

近年來，隨著果汁飲料的市場需求量逐漸增大和國際貿易活動的增多，果汁行業(yè)的競爭越來越激烈。為保證產(chǎn)品質量和人們的合法權益，高效、可靠、簡單的鑒偽技術成為未來研究的方向。在諸多鑒定方法中，分子生物技術是基于遺傳信息對樣品進行檢測，不受原料產(chǎn)地、環(huán)境、加工方式等因素的影響，適合對果汁等深加工產(chǎn)品中水果品種進行鑒定。從本文綜述可以看出，在分子生物技術鑒定果汁真假的研究應用中，普通PCR技術應用研究比較成熟，報道較多，實時熒光PCR技術是目前最常用的鑒定方法，數(shù)字PCR、DNA條形碼等新興技術起步較晚，在果汁成分鑒別的應用存在巨大潛力。

由于果汁加工形式多樣、成分復雜、原料來源和保存方式不同、水果成熟度水平和生長環(huán)境差異大，應用分子生物學技術檢測果汁中成分處于定性分析階段，且對單品種果汁樣品檢測研究應用較多，需要進一步深入研究建立方法加強生物技術在復合果汁檢測中的適用性。另外，在實驗過程中出現(xiàn)假陽性和假陰性現(xiàn)象是分子生物技術鑒定中亟需注意的問題。建立健全檢測標準等法律法規(guī)體系，大力開發(fā)檢測技術，采用多種鑒定方法和檢測儀器聯(lián)合使用，才能為果汁的鑒別帶來新的突破。