賈宏信，揭良，羅妮

（1.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200436；2.上海商學(xué)院酒店管理學(xué)院，上海200235）

嬰兒配方乳粉是母乳的最佳替代品，能最大限度為嬰兒提供生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)。但是嬰兒配方乳粉通常不是無(wú)菌的，其本身可能含有多種致病菌[1-2]，在可能存在的致病菌中，克羅諾桿菌（又稱阪崎腸桿菌）屬危害最大，它可能是新生兒、早產(chǎn)兒及免疫力受損嬰兒發(fā)生敗血癥和腦膜炎的病原體，并且一旦嬰兒感染，致死率高達(dá)80%[1,3]?？紤]到降低克羅諾桿菌和沙門氏菌對(duì)于嬰兒健康的危害，2006年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（United Nations Food Agriculture Organization，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）建議對(duì)于感染風(fēng)險(xiǎn)較高的嬰兒配方乳粉的沖調(diào)溫度應(yīng)不低于70 ℃，并在乳粉充分溶解后立即用自來(lái)水沖涼奶瓶，或者立即將奶瓶放在冷水或冰水中冷卻[4]。隨著嬰兒配方乳粉加工技術(shù)水平的不斷提高，克羅諾桿菌的危害已經(jīng)得到嚴(yán)格控制，例如，我國(guó)嬰兒配方乳粉限定每批取樣3 份，每份取樣100 g，克羅諾桿菌的檢出結(jié)果均為陰性[5]。另外，益生菌被證明有益于嬰兒健康[6]，目前已在嬰兒配方食品中廣泛應(yīng)用[7-8]，如果依然選用70 ℃以上的沖調(diào)溫度不但會(huì)造成配方乳粉內(nèi)熱敏物質(zhì)（如乳鐵蛋白、VC、VD等）的損失，也會(huì)嚴(yán)重影響益生菌在配方乳粉沖調(diào)液內(nèi)的存活率，進(jìn)而影響益生菌的有益作用。本研究就不同沖調(diào)溫度及沖調(diào)方式對(duì)嬰兒配方乳粉沖調(diào)液內(nèi)益生菌存活率的影響進(jìn)行研究，以期為含益生菌嬰兒配方乳粉沖調(diào)方式的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 種不同品牌嬰兒配方乳粉 市售。

MRS固體培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽固體培養(yǎng)基和Baird-Parker培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

A35厭氧培養(yǎng)箱 英國(guó)Don Whitley Scientific公司；HPP110恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國(guó)Memmert公司；TE612-L電子天平 德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 嬰兒配方乳粉中益生菌計(jì)數(shù)

參考賈宏信等[9]的方法，并稍作修改。稱取嬰兒配方乳粉25 g，加入到225 mL 0.85 g/100 mL的生理鹽水中（已滅菌），混勻；取1 mL上述沖調(diào)液用生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋，最后取3 個(gè)適宜的稀釋梯度（根據(jù)各乳粉標(biāo)示值確定）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MRS平板傾注前進(jìn)行121 ℃、15 min滅菌，待冷卻至45 ℃左右時(shí)再進(jìn)行傾注。每個(gè)樣品平行設(shè)置3 個(gè)平板，結(jié)果取平均值，即為各嬰兒配方乳粉中益生菌數(shù)的實(shí)際檢測(cè)值。

1.3.2 不同沖調(diào)方式嬰兒配方乳粉中益生菌計(jì)數(shù)

沖調(diào)方式1：溫水直接沖調(diào)，稱取不同品牌的嬰兒配方乳粉，依照該乳粉的標(biāo)準(zhǔn)沖調(diào)法，將其加入到不同溫度（40、50、60、70 ℃）溫水中，混勻（2～5 min），然后用自來(lái)水沖冷至35 ℃左右。沖調(diào)方式2：溫/涼水兩步?jīng)_調(diào)，稱取不同品牌的嬰兒配方乳粉，依照該乳粉的標(biāo)準(zhǔn)沖調(diào)法，將其加入到?jīng)_調(diào)所需體積一半的溫水（40、50、60、70 ℃）中，混勻（2～5 min），然后再加入等體積的常溫水（開水冷卻至21～25 ℃），混勻，溫度較高的用自來(lái)水沖冷至35 ℃左右。待檢測(cè)。

取冷卻的上述沖調(diào)液各1 mL，用0.85 g/100 mL的生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋，取3 個(gè)適宜的稀釋梯度進(jìn)行MRS培養(yǎng)基傾注實(shí)驗(yàn)，方法同1.3.1節(jié)。

益生菌存活率按下式計(jì)算。

式中：N、N0分別為沖調(diào)后和乳粉中益生菌數(shù)的實(shí)測(cè)值/（CFU/g）。

1.3.3 嬰兒配方乳粉沖調(diào)液中微生物的跟蹤檢測(cè)

取不同品牌嬰兒配方乳粉，按溫水直接沖調(diào)和溫/涼水兩步?jīng)_調(diào)法沖調(diào)（沖調(diào)所用溫水溫度50 ℃），但沖調(diào)濃度依據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[10]、GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》[11]、GB 4789.10—2016《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[12]和GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[13]稀釋要求，并10 倍梯度稀釋，檢測(cè)嬰兒配方乳粉沖調(diào)液的菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)、金黃色葡萄球菌和雙歧桿菌數(shù)量。監(jiān)測(cè)沖調(diào)液（5±1） ℃放置24 h的微生物數(shù)量變化，分別于0、8、16、24 h檢測(cè)菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)、金黃色葡萄球菌和雙歧桿菌的數(shù)量。

1.3.4 培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

待傾注后的平板培養(yǎng)基冷卻凝固后，用于益生菌計(jì)數(shù)的平板放置在厭氧箱內(nèi)37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)；用于菌落總數(shù)、大腸菌群和金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)的平板放置在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)；雙歧桿菌的有效計(jì)數(shù)在平板菌落數(shù)30～300 CFU/平板時(shí)進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 嬰兒配方乳粉中益生菌水平

表1 不同品牌嬰兒配方乳粉中益生菌的實(shí)際檢測(cè)值Table 1Claimed versus measured counts of probiotics in different brands of infant formula

由表1可知，市售4 款嬰兒配方乳粉中活性益生菌的實(shí)際檢測(cè)值均在1.0×107CFU/g以上，均滿足GB 10765—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》的規(guī)定（活性益生菌數(shù)量≥106CFU/g）。2001年，F(xiàn)AO和WHO將益生菌定義為“活的微生物，攝入適量對(duì)宿主健康產(chǎn)生有益作用的活菌”[14]，從該定義可知，“活”對(duì)于益生菌而言很重要。另有臨床研究證明，每200 mL乳粉沖調(diào)液中動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12數(shù)量達(dá)到107CFU/g可以有效提高15～31 個(gè)月幼兒的免疫力[15]。俞漪等[16]研究表明，2014年市售中國(guó)嬰幼兒配方乳粉中益生菌活菌數(shù)多集中在1×106～1×107CFU/g，而益生菌活菌數(shù)高于1×107CFU/g的嬰幼兒配方乳粉僅占15%，并且還有10%的乳粉益生菌活菌數(shù)小于1×105CFU/g。本研究中4 款市售嬰兒配方乳粉中益生菌活菌數(shù)均高于1.0×107CFU/g可能與所選品牌為市場(chǎng)主流品牌有關(guān)，也可能與2015年中國(guó)嬰幼兒配方乳粉注冊(cè)制的實(shí)施有關(guān)。

2.2 不同沖調(diào)方式嬰兒配方乳粉中益生菌的存活率

表2 不同沖調(diào)方式嬰兒配方乳粉中益生菌的存活率Table 2 Survival rates of probiotics in different brands of infant formula reconstituted by different methods%

由表2可知，嬰兒配方乳粉的沖調(diào)溫度對(duì)益生菌的存活率影響很大，沖調(diào)所用溫水溫度越高，益生菌的存活率越低。沖調(diào)所用溫水溫度為40 ℃時(shí)，益生菌的平均存活率分別為94.89%（溫水直接沖調(diào)）和98.31%（溫/涼水兩步?jīng)_調(diào)），但是沖調(diào)所用溫水溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，益生菌的存活率分別僅為1.49%和15.81%。另外，溫水直接沖調(diào)時(shí)，在相同沖調(diào)溫度下，不同品牌乳粉的益生菌存活率不盡相同，特別是在60、70 ℃沖調(diào)溫度下，各品牌乳粉的存活率相差1 倍以上，甚至達(dá)到幾十倍，說(shuō)明不同品牌乳粉所含益生菌的耐熱性不同。張宜鳳等[17]研究耐熱乳酸菌的耐熱性，發(fā)現(xiàn)即使是耐熱性乳酸菌，其D值（特定溫度下，乳酸菌存活量下降1 個(gè)對(duì)數(shù)單位（90%）所需的時(shí)間）在60 ℃時(shí)多數(shù)僅為2 min左右，說(shuō)明大部分乳酸菌在溫度高于60 ℃的情況下很快會(huì)熱致死。因此，益生菌在較高溫度的水中所處時(shí)間越短越利于其存活，這也解釋了本研究中60、70 ℃沖調(diào)溫度下益生菌存活率不高的原因。

在相同沖調(diào)溫水溫度下，溫/涼水兩步?jīng)_調(diào)嬰兒配方乳粉中益生菌的平均存活率均高于溫水直接沖調(diào)，說(shuō)明常溫自來(lái)水沖冷對(duì)于益生菌的保護(hù)效果遠(yuǎn)低于直接加入常溫水。如果不考慮沖調(diào)方式，含益生菌的嬰兒配方乳粉沖調(diào)所用溫水溫度可以控制在40～50 ℃，這樣有利于乳粉內(nèi)益生菌的存活。一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)居民家庭嬰幼兒配方乳粉消費(fèi)習(xí)慣的調(diào)查[3]顯示，目前我國(guó)居民家庭沖調(diào)配方乳粉時(shí)有55.73%居民選擇40～50 ℃的溫水，24.36%居民選擇60 ℃的水，18.48%居民選擇70～80 ℃的水，說(shuō)明多數(shù)消費(fèi)者已經(jīng)在使用有利于益生菌存活的沖調(diào)溫度。另外，嬰兒配方乳粉沖調(diào)溫度為40～50 ℃時(shí)，乳粉的感官評(píng)分更高，維生素?fù)p失更少，所含不飽和脂肪酸更穩(wěn)定[18-19]。因此，對(duì)于含益生菌的嬰兒配方乳粉，建議沖調(diào)所用溫水溫度為40～50 ℃，沖調(diào)方式可以任選；如果沖調(diào)所用溫水溫度為60～70 ℃，建議沖調(diào)方式為溫/涼水兩步?jīng)_調(diào)，這樣有利于嬰兒配方乳粉中益生菌的存活。

2.3 嬰兒配方乳粉沖調(diào)液存放24 h期間的微生物數(shù)量變化

根據(jù)FAO和WHO的建議，對(duì)于大批量沖調(diào)的嬰兒配方乳粉，沖調(diào)液應(yīng)裝于消毒潔凈容器內(nèi)，冰箱冷藏時(shí)間不宜超過(guò)24 h，超過(guò)24 h應(yīng)丟棄，不能再給嬰兒食用[4]。歐洲兒科胃腸病學(xué)、肝病學(xué)和營(yíng)養(yǎng)協(xié)會(huì)也提出了類似建議，沖調(diào)好的嬰兒配方乳4 ℃冷藏時(shí)間不宜超過(guò)30 h[20]?；谝陨辖ㄗh，本研究跟蹤檢測(cè)2 種沖調(diào)方式嬰兒配方乳粉沖調(diào)液5 ℃條件下貯藏24 h期間的菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)、金黃色葡萄球菌及雙歧桿菌的數(shù)量變化。

表3 嬰兒配方乳粉沖調(diào)液5 ℃條件貯藏24 h期間的微生物數(shù)量變化Table 3Microbiological changes in reconstituted infant formula during 24 h storage at 5 ℃

由表3可知，4 個(gè)品牌的嬰兒配方乳粉沖調(diào)后，菌落總數(shù)（均小于200 CFU/g）、大腸菌群（均為陰性）和金黃色葡萄球菌（均為陰性）檢測(cè)結(jié)果均滿足GB 10765—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》的要求，說(shuō)明市售4 款嬰兒配方乳粉的微生物控制均達(dá)到極佳狀態(tài)。另外，同種沖調(diào)方式下，同一品牌乳粉沖調(diào)液5 ℃冷藏24 h期間的雙歧桿菌活菌數(shù)及菌落總數(shù)均無(wú)顯著差異（P≥0.05）。上述結(jié)果表明，5 ℃冷藏完全能滿足含益生菌嬰兒配方乳粉沖調(diào)液的保存需求。

3 結(jié)論

沖調(diào)所用溫水溫度越高，嬰兒配方乳粉中益生菌的存活率越低，沖調(diào)所用溫水溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，溫水直接沖調(diào)的嬰兒配方乳粉中益生菌存活率為1.49%，溫/涼水兩步?jīng)_調(diào)乳粉中為15.81%，說(shuō)明70 ℃的沖調(diào)溫度不適用于含益生菌的嬰兒配方乳粉。溫/涼水兩步?jīng)_調(diào)有利于乳粉中益生菌的存活，選擇溫/涼水兩步?jīng)_調(diào)，沖調(diào)所用溫水溫度上升至60 ℃也能保證益生菌的存活率高于50%。如不考慮沖調(diào)方式，40～50 ℃是含益生菌乳粉的適宜沖調(diào)溫度。未經(jīng)食用的嬰幼兒配方乳粉沖調(diào)液應(yīng)于5 ℃冷藏，以保證沖調(diào)液中益生菌的存活，并控制沖調(diào)液中其他微生物的增殖。