騰軍偉，周芷寒，劉振民，蘇米亞，鄭遠(yuǎn)榮，劉景，焦晶凱

（1.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200436；2.上海商學(xué)院酒店管理學(xué)院，上海200235）

紅曲霉在中國有著相當(dāng)悠久的歷史，古籍中有關(guān)于紅曲霉用于發(fā)酵與保藏食物的記載[1]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，紅曲霉的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物包括Monacolin K[2-3]、紅曲色素[4-6]、γ-氨基丁酸[7]等，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物大多對人體有益，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域中[8-10]。

霉菌成熟干酪是通過直投、浸泡或噴灑等形式接種霉菌成熟劑后，干酪內(nèi)部和（或）表面的特征霉菌生長從而促進(jìn)其成熟的干酪，霉菌干酪中較著名的有青紋干酪、卡門貝爾干酪和布里干酪[11-12]等，它們利用其獨(dú)特的霉菌發(fā)酵制作而成。在干酪成熟過程中，霉菌一直被認(rèn)為是輔助性培養(yǎng)物，因?yàn)樗鼈兙哂邪l(fā)酵代謝乳糖、產(chǎn)生特定質(zhì)地和風(fēng)味的能力[13-15]。隨著我國對外貿(mào)易的發(fā)展，國人對干酪文化的認(rèn)知也逐漸擴(kuò)大，其中霉菌干酪作為一種特別品類的干酪逐步被消費(fèi)者接受，其市場消費(fèi)量逐年提升。利用紅曲霉發(fā)酵制作的紅曲霉干酪不僅具有中國特色，還有較高的營養(yǎng)和功能價(jià)值，紅曲霉的發(fā)酵代謝產(chǎn)物具有降低膽固醇水平[16-17]、調(diào)節(jié)心血管[18]、抗衰老等功能[19-20]。紅曲霉干酪的開發(fā)與研究具有很強(qiáng)的中國特色，且更容易被中國消費(fèi)者接受。紅曲霉干酪的制作需要較高濃度的紅曲霉孢子液，但是由于工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵紅曲霉的產(chǎn)量低、成本高等問題，阻礙了與之相關(guān)的產(chǎn)業(yè)發(fā)展；且工藝上選擇直投式加入紅曲霉發(fā)酵劑較適合工業(yè)化生產(chǎn)，因此提高紅曲霉單位體積的產(chǎn)孢子數(shù)顯得尤為重要，產(chǎn)孢子數(shù)能夠直接影響紅曲霉干酪的質(zhì)量[21-22]。因此，如何提高紅曲霉液態(tài)發(fā)酵時(shí)的產(chǎn)孢子數(shù)具有較大的實(shí)際意義。

本研究選取不產(chǎn)桔霉毒素[23-24]且有較高色階的紅曲霉菌株紫紅曲霉（Monascus purpureus）M-4，此外，液態(tài)發(fā)酵不容易受到污染、發(fā)酵情況好控制、生產(chǎn)效率高，與固態(tài)發(fā)酵相比較適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，采用單因素試驗(yàn)對紫紅曲霉M-4的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等因素進(jìn)行優(yōu)化，以期提高液態(tài)發(fā)酵紫紅曲霉M-4的產(chǎn)孢子數(shù)，為中國特色功能性霉菌成熟干酪的順利開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫紅曲霉M-4（保藏編號(hào)CGMCC No.9712）乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）肉湯、馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）上海盛思生化科技有限公司；馬鈴薯浸粉、酵母浸粉、蛋白胨北京陸橋技術(shù)股份有限公司；葡萄糖、蔗糖、碳酸鈣、氯化鈣、氯化鈉、氯化鎂、硫酸鋅、氯化鉀國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大米粉華聯(lián)超市；乳酸上海明富食品科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-2112B水平搖床天津津立儀器設(shè)備科技發(fā)展有限公司；MJ-250-Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱杭州藍(lán)天儀器有限公司；DW-40L188醫(yī)用低溫保存箱海爾集團(tuán)；Thermo1389生物安全柜美國Thermo公司；ME2002E/02電子天平、FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)

基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基（葡萄糖20 g/L、馬鈴薯浸粉4 g/L），pH值自然；固體培養(yǎng)基：PDA肉湯培養(yǎng)基，pH值自然；種子保存液：50%基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基+50%甘油（質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%），pH值自然。以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌20 min。

種子培養(yǎng)液制備：在500 mL錐形瓶中裝入100 mL的PDB培養(yǎng)基，進(jìn)行接種，在30 ℃、90 r/min的水平搖床上培養(yǎng)3 d后，從中取20 mL倒入另一瓶裝有300 mL PDB培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30 ℃、90 r/min的水平搖床中培養(yǎng)1 d后，用無菌4 層紗布對320 mL PDB發(fā)酵液進(jìn)行過濾。在1 mL離心管中裝入0.5 mL甘油（質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%）和0.5 mL過濾后的PDB發(fā)酵液作為種子液，并將離心管放入-30 ℃低溫保存箱中冷凍保存。

液體發(fā)酵培養(yǎng)制備：將培養(yǎng)好的種子液按體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接種于裝有100 mL PDB的500 mL錐形瓶中，用8 層紗布封好，在30 ℃、90 r/min的水平搖床上培養(yǎng)3 d。

1.3.2 培養(yǎng)方法和菌落計(jì)數(shù)

根據(jù)GB 4789.15—2016《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》中的標(biāo)準(zhǔn)，采用梯度稀釋和涂布平板法進(jìn)行孢子數(shù)測定。

在已編號(hào)的5 0 0m L錐形瓶中裝入配制好的100 mL PDB液體培養(yǎng)基，每個(gè)錐形瓶中放入玻璃珠10 顆，在高溫高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min；待液體培養(yǎng)基溫度降至常溫時(shí)使用種子液進(jìn)行接種，每瓶接種量3%，不同條件下的液體培養(yǎng)基在接種完成后于30 ℃、90 r/min水平搖床上培養(yǎng)3 d，3 d后在無菌操作臺(tái)進(jìn)行梯度稀釋和平板涂布。

將90 mL質(zhì)量濃度0.9 g/100 mL的生理鹽水加入10 mL接種培養(yǎng)后的PDB液體培養(yǎng)基，進(jìn)行10 倍稀釋；取1 mL稀釋10 倍的菌液，置于裝有9 mL生理鹽水的試管中進(jìn)一步稀釋，以此類推，本研究具體稀釋倍數(shù)根據(jù)涂布平板菌落計(jì)數(shù)情況而定。稀釋后用固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布，取每個(gè)稀釋倍數(shù)的溶液100 μL進(jìn)行涂布，并做3 個(gè)平行樣。涂布完成將平板置于30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，根據(jù)平行樣品的平板計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算平均值。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 氮源種類及添加量對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響

氮源種類的選擇：選用葡萄糖為固定碳源（添加量2.0 g/100 mL），查閱參考文獻(xiàn)[2,8,17]，選擇馬鈴薯浸粉、蛋白胨和酵母浸膏為氮源（添加量均為0.4 g/100 mL），考察氮源種類對產(chǎn)孢子數(shù)的影響。

氮源添加量的選擇：選用葡萄糖為固定碳源（添加量2.0 g/100 mL），根據(jù)氮源種類試驗(yàn)結(jié)果選擇氮源，添加量分別取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/100 mL，考察氮源添加量對產(chǎn)孢子數(shù)的影響。

1.3.3.2 碳源種類及添加量對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響

碳源種類的選擇：固定氮源為每100 mL中添加0.4 g馬鈴薯浸粉，查閱參考文獻(xiàn)[16,20]，選擇大米粉、甘油、蔗糖和葡萄糖為碳源（添加量均為2.0 g/100 mL），考察碳源種類對產(chǎn)孢子數(shù)的影響。

碳源添加量的選擇：固定氮源為每100 mL中添加0.4 g馬鈴薯浸粉，根據(jù)碳源種類試驗(yàn)結(jié)果選擇碳源，碳源添加量分別取1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 g/100 mL，考察碳源添加量對產(chǎn)孢子數(shù)的影響。

1.3.3.3 pH值對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響

在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，測定不同pH值條件對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響。首先對自然狀態(tài)下的pH值進(jìn)行測定；在已編號(hào)的500 mL錐形瓶中各加入100 mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基，用pH計(jì)測定后用乳酸和氫氧化鈉將pH值分別調(diào)至5.42、5.72、6.02、6.32、6.72、7.02、7.32、7.62，考察pH值對產(chǎn)孢子數(shù)的影響。

1.3.3.4 裝液量對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響

在已編號(hào)的500 mL錐形瓶中分別加入80、100、120、140、160 mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基，考察裝液量對產(chǎn)孢子數(shù)的影響。

1.3.3.5 金屬離子對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響

在已編號(hào)的500 mL錐形瓶中各加入100 mL基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基，然后分別加入CaCl2、CaCO3、NaCl、MgCl2、ZnSO4和KCl 6 種金屬離子化合物（添加量均為2 g/L），考察金屬離子對產(chǎn)孢子數(shù)的影響。

1.3.3.6 傳代次數(shù)對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響

根據(jù)上述試驗(yàn)所得最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。菌株接種培養(yǎng)基發(fā)酵3 d后為第1代，進(jìn)行梯度稀釋和平板涂布，從第1代結(jié)束時(shí)的培養(yǎng)基中抽取發(fā)酵液，按照3%接種量接種到新配制的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d即為第2代，進(jìn)行梯度稀釋和平板涂布，以此類推得到第3代、第4代和第5代，考察傳代次數(shù)對產(chǎn)孢子數(shù)的影響。

1.3.3.7 培養(yǎng)時(shí)間對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響

根據(jù)上述試驗(yàn)所得最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)完成后發(fā)酵液分別在培養(yǎng)第3、4、5、6、7、8、9、10天后進(jìn)行梯度稀釋，考察培養(yǎng)時(shí)間對產(chǎn)孢子數(shù)的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取馬鈴薯浸粉添加量（A）、葡萄糖添加量（B）和培養(yǎng)時(shí)間（C）3 個(gè)因素，以紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)（R）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken軟件進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平如表1所示。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Codes and levels of independent variables used for response surface methodology

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Origin 9.0軟件作圖，并用SPSS 22.0和Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源種類及添加量對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)影響的試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 氮源種類的確定

表2 氮源種類對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響Table 2Effect of nitrogen sources on spore number of Monascus purpureus M-4

由表2可知，在碳源種類和添加量相同的條件下，以馬鈴薯浸粉作為氮源時(shí)，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)最多，明顯高于蛋白胨作氮源時(shí)的產(chǎn)孢子數(shù)。而以酵母浸膏作為氮源時(shí)，計(jì)數(shù)平板上并沒有菌落生長，可能由于酵母浸膏無法被紫紅曲霉M-4消化利用，導(dǎo)致菌株無法生長繁殖。蛋白胨中雖然有許多蛋白質(zhì)及游離多肽，但是馬鈴薯浸粉中也含有大量蛋白質(zhì)，以及一些生長因子[25]，用于培養(yǎng)霉菌的PDA培養(yǎng)基均以馬鈴薯浸粉作為氮源，因此紫紅曲霉M-4的最佳氮源種類是馬鈴薯浸粉。

2.1.2 氮源添加量的確定

圖1 氮源添加量對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響Fig. 1Effect of nitrogen source concentration on spore number of Monascus purpureus M-4

氮源是紫紅曲霉生長代謝過程中必不可少的，氮源過多或過少均對菌株產(chǎn)孢子數(shù)有一定影響。由圖1可知：在馬鈴薯浸粉添加量較低時(shí)，逐漸增加馬鈴薯浸粉添加量，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)也會(huì)逐漸增加，當(dāng)馬鈴薯浸粉添加量為0.4 g/100 mL時(shí)，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)最多；繼續(xù)提高氮源添加量時(shí)，反而會(huì)抑制紫紅曲霉M-4的產(chǎn)孢子情況，表明紫紅曲霉M-4在營養(yǎng)充足的情況下，菌體會(huì)大量繁殖，而產(chǎn)孢子等途徑被抑制。因此馬鈴薯浸粉的最佳添加量為0.4 g/100 mL。

2.2 碳源種類及添加量對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)影響的試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碳源種類的確定

傳統(tǒng)發(fā)酵多為固態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵大都選用大米為碳源，而液態(tài)發(fā)酵選用的碳源種類較多，有大米粉、葡萄糖、蔗糖、甘油、麥芽糖等[22,25-26]。

在微生物生長期間，紫紅曲霉M-4能快速消耗碳源，消耗過程中產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物累積在培養(yǎng)基中，會(huì)對紫紅曲霉M-4的生長代謝起到一定的抑制作用。在培養(yǎng)期間，肉眼可觀察到用葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中菌絲體較蔗糖與大米粉作為碳源時(shí)多，但是以蔗糖和葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中菌絲體數(shù)量大致相同。

表3 碳源種類對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響Table 3Effect of carbon sources on spore number of Monascus purpureus M-4

由表3可知，當(dāng)?shù)创_定為馬鈴薯浸粉且添加量為0.4 g/100 mL時(shí)，以葡萄糖作為碳源，同等培養(yǎng)條件下紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)明顯多于用大米粉、甘油和蔗糖作為碳源時(shí)的產(chǎn)孢子數(shù)。因此，選用葡萄糖作為紫紅曲霉M-4的最佳碳源種類。

2.2.2 碳源添加量的確定

圖2 碳源添加量對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響Fig. 2 Effect of carbon source concentration on spore number of Monascus purpureus M-4

葡萄糖作為能被快速利用的單糖，經(jīng)常被用來作為霉菌、酵母菌和真菌等微生物的碳源。由圖2可知，葡萄糖添加量在1.6～2.0 g/100 mL范圍時(shí)，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)逐漸增多，當(dāng)葡萄糖添加量為2.0 g/100 mL時(shí)，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)達(dá)到最大值，之后繼續(xù)增加葡萄糖添加量，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)反而降低。葡萄糖雖然是本研究中紫紅曲霉M-4的最優(yōu)碳源，但是葡萄糖添加量過多或過少都對菌株產(chǎn)孢子不利。葡萄糖添加量較少時(shí)，由于營養(yǎng)不充足，導(dǎo)致紫紅曲霉M-4無法大量繁殖，產(chǎn)孢子數(shù)也較少；但當(dāng)葡萄糖添加量過多時(shí)，紫紅曲霉M-4生長過程中產(chǎn)生的一些代謝物不斷累積，可能會(huì)對其生長起到抑制作用，也不利于產(chǎn)生更多孢子。因此葡萄糖添加量為2.0 g/100 mL時(shí)最有利于紫紅曲霉M-4產(chǎn)生孢子。

2.3 pH值對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)影響的試驗(yàn)結(jié)果

紫紅曲霉是嗜酸性菌，大多數(shù)菌株的最適pH值在3.5～7.5之間，在偏酸的環(huán)境中生長情況更好，特別是在含乳酸的環(huán)境中[27]。所有微生物都有適合生長的最適pH值范圍，選擇最適的pH值更有利于紫紅曲霉M-4的生長繁殖。

圖3 pH值對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響Fig. 3 Effect of medium pH value on spore number of Monascus purpureus M-4

由圖3可知，初始pH值對紫紅曲霉M-4的生長有一定影響，紫紅曲霉M-4雖然是嗜酸性菌，但是過酸環(huán)境還是會(huì)影響其生長代謝及產(chǎn)孢子情況，培養(yǎng)基堿性pH值條件也不利于菌株的產(chǎn)孢子情況。當(dāng)培養(yǎng)基pH值為5.42～6.32時(shí)，隨著pH值逐漸提高，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)逐漸增多；培養(yǎng)基自然條件下pH值（6.72）時(shí)，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)達(dá)到最大值；之后繼續(xù)提高培養(yǎng)基pH值，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)迅速降低。這可能是由于過高的pH值鈍化了紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子代謝過程中的酶類，使得菌體產(chǎn)孢子數(shù)迅速降低[28]。因此培養(yǎng)基自然pH 6.72條件下最有利于紫紅曲霉M-4代謝產(chǎn)生孢子。

2.4 裝液量對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)影響的試驗(yàn)結(jié)果

氧元素不僅是大多數(shù)微生物生存的必要條件，同時(shí)也是生物體重要代謝過程中不可缺少的元素，在好氧微生物的生長代謝中極其重要。紫紅曲霉是好氧微生物，在培養(yǎng)過程中，溶氧量也是影響菌株產(chǎn)孢子數(shù)的因素。

圖4 裝液量對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響Fig. 4 Effect of medium volume on spore number of Monascus purpureus M-4

由圖4可知，在上述各因素較適值條件下，隨著裝液量的增加，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)先上升然后緩慢下降。當(dāng)裝液量為80 mL時(shí)，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)最少；當(dāng)裝液量在80～120 mL之間時(shí)，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)逐漸上升；當(dāng)裝液量為120 mL時(shí)，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)高于其他裝液量時(shí)的產(chǎn)孢子數(shù)，達(dá)到最大值；當(dāng)裝液量大于120 mL后，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)開始緩慢下降。由此可以推測，裝液量太多可能不利于培養(yǎng)基中氧氣的擴(kuò)散，會(huì)導(dǎo)致菌株發(fā)酵供氧量不足，對紫紅曲霉M-4的生長和代謝產(chǎn)孢子不利；但裝液量太少，氧含量會(huì)過多，導(dǎo)致菌株產(chǎn)生大量菌絲體，而產(chǎn)孢子數(shù)偏少。考慮到時(shí)間和效率綜合因素，最有利于紫紅曲霉M-4代謝產(chǎn)孢子的裝液量為120 mL（500 mL錐形瓶）。

2.5 金屬離子對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)影響的試驗(yàn)結(jié)果

金屬離子通常只有在低添加量條件下才能對微生物的生長起到一定的促進(jìn)作用，在高添加量條件下反而會(huì)抑制其生長代謝[29]，因此設(shè)置金屬離子添加量僅為2 g/L。

由圖5可知，加入不同的金屬離子對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)影響較大。鋅離子雖然是多種酶的輔酶，但是在培養(yǎng)基中添加ZnSO4后反而完全抑制了紫紅曲霉M-4產(chǎn)生孢子，產(chǎn)孢子數(shù)為0；而加入CaCO3的培養(yǎng)基中紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)最大，其次是加入KCl的培養(yǎng)基，再次是加入CaCl2和NaCl的培養(yǎng)基，但2 組的產(chǎn)孢子數(shù)較為相近。與不添加金屬離子的培養(yǎng)基相比，加入合適的金屬離子能明顯提高紫紅曲霉M-4的代謝產(chǎn)孢子數(shù)。因此，對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)有顯著提高作用的金屬離子來源是CaCO3。

圖5 金屬離子對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響Fig. 5 Effect of metal ions on spore number of Monascus purpureus M-4

2.6 傳代次數(shù)對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)影響的試驗(yàn)結(jié)果

圖6 傳代次數(shù)對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響Fig. 6Effect of number of passages on spore number of Monascus purpureus M-4

檢測紫紅曲霉M-4傳代后的活性是否優(yōu)于不經(jīng)傳代的紫紅曲霉M-4，同時(shí)考察紫紅曲霉M-4傳代后是否具有穩(wěn)定性。由圖6可知，紫紅曲霉M-4從第1代傳代到第2代時(shí)，產(chǎn)孢子數(shù)大幅度提高，從第2代到第5代，菌株產(chǎn)孢子數(shù)幾乎持平，沒有明顯增加或減少。說明紫紅曲霉M-4經(jīng)第1代培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中已有較多的孢子，再接種到新的培養(yǎng)基時(shí)，在營養(yǎng)充足的條件下，菌株開始迅速生長繁殖和代謝產(chǎn)生孢子，之后再接種到新的培養(yǎng)基時(shí)，相較于第2代無明顯變化。與不經(jīng)傳代比較，紫紅曲霉M-4傳代1 次后產(chǎn)孢子數(shù)明顯升高。因此，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)較高的傳代次數(shù)為2 代。

2.7 培養(yǎng)時(shí)間對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)影響的試驗(yàn)結(jié)果

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響Fig. 7 Effect of culture time on spore number of Monascus purpureus M-4

由圖7可知：培養(yǎng)3～6 d時(shí)，隨著時(shí)間的延長，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)逐漸增多，其中4～6 d的增長量最大，第6天時(shí)菌落計(jì)數(shù)最多；但培養(yǎng)6 d后紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)不但沒有上升，反而開始緩慢下降，從第9天開始大量減少。由此可見，發(fā)酵前期處于紫紅曲霉M-4的生長繁殖產(chǎn)孢子階段，培養(yǎng)第6天時(shí)紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)達(dá)到最大值，之后開始減少，這可能是由于在發(fā)酵后期，營養(yǎng)底物減少、pH值上升、生長空間減少等原因造成菌株產(chǎn)孢子數(shù)下降，同時(shí)孢子之間競爭營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間，使部分孢子失活，菌落計(jì)數(shù)減少。

2.8 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.8.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，共設(shè)計(jì)17 個(gè)試驗(yàn)組，其中12 組為分析點(diǎn)，5 組為零點(diǎn)試驗(yàn)，用以估計(jì)誤差。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表4所示。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 4 Box-Behnken design with experimental results

2.8.2 回歸模型的建立及顯著性分析

根據(jù)Design-Expert（Version 8.0.6）軟件對表4數(shù)據(jù)及結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到紫紅曲霉M-4液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢子數(shù)（R）對馬鈴薯浸粉添加量（A）、葡萄糖添加量（B）和培養(yǎng)時(shí)間（C）3 個(gè)因素的二次多項(xiàng)式回歸模型為R＝-0.025A+0.075B+0.550C-0.400AB+0.800AC+0.300BC-0.850A2-0.750B2-0.850C2。

由表5可知，模型的P值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.01，說明該模型極顯著，與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好。決定系數(shù)R2＝0.963 3，說明優(yōu)化所得試驗(yàn)值與模型回歸值有良好的一致性。校正系數(shù)R2Adj=0.916 0，說明該模型能夠很好地解釋91.60%的響應(yīng)值變化，失擬項(xiàng)F值為0.63，P值為0.631 4，大于0.05，表明模型失擬項(xiàng)不顯著，能很好地說明該方程充分反映了紫紅曲霉M-4的實(shí)際產(chǎn)孢子數(shù)情況。因此，該模型擬合程度良好，可以用此模型來分析和預(yù)測營養(yǎng)和培養(yǎng)條件對提高紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果的方差分析Table 5 Analysis of variance of quadratic polynomial model

2.8.3 各因素交互作用分析

圖8 馬鈴薯浸粉添加量和葡萄糖添加量對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig. 8 Response surface and contour plots showing the interactive effects of potato and glucose concentration on spore production of Monascus purpureus M-4

圖9 馬鈴薯浸粉添加量和培養(yǎng)時(shí)間對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig. 9Response surface and contour plots showing the interactive effects of potato concentration and incubation time on spore production of Monascus purpureus M-4

圖10 葡萄糖添加量和培養(yǎng)時(shí)間對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig. 10Response surface and contour plots showing the interactive effects of glucose concentration and incubation time on spore production of Monascus purpureus M-4

采用Design-Expert（Version 8.0.6）軟件對表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合分析，得到各因素交互作用的響應(yīng)曲面和等高線圖，可以直觀地看出不同營養(yǎng)因素和培養(yǎng)條件對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)的影響。由8～10可知：從等高線圖可以看出，馬鈴薯浸粉添加量與葡萄糖添加量、馬鈴薯浸粉添加量與培養(yǎng)時(shí)間的交互作用均顯著；從響應(yīng)面圖可以看出，培養(yǎng)時(shí)間對紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子的促進(jìn)作用最大，表現(xiàn)為曲面最陡；馬鈴薯浸粉添加量的促進(jìn)作用最小，曲面最為平緩。

2.8.4 最優(yōu)組合及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由等高線圖和響應(yīng)面圖可知，回歸模型存在最大值。通過響應(yīng)面軟件分析得到紫紅曲霉M-4液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢子數(shù)的優(yōu)化條件為馬鈴薯浸粉添加量0.38 g/100 mL、葡萄糖添加量2.2 g/100 mL、培養(yǎng)時(shí)間6.5 d，此條件下理論預(yù)測紫紅曲霉M-4最大產(chǎn)孢子數(shù)為（7.53±0.31）×106CFU/mL。為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，采用響應(yīng)面分析法得到的優(yōu)化條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子數(shù)為（7.47±0.15）×106CFU/mL，與理論預(yù)測值的平均誤差為0.79%，表明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

在紅曲霉干酪制作中，二級(jí)發(fā)酵劑中的孢子數(shù)是紅曲霉干酪發(fā)酵與成熟的重要影響因素，直接影響最終的干酪品質(zhì)。為提高紅曲霉干酪發(fā)酵菌種紫紅曲霉M-4的產(chǎn)孢子數(shù)，對紫紅曲霉M-4進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件，達(dá)到提高菌株產(chǎn)孢子數(shù)的目的。

在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果表明：最佳氮源為馬鈴薯浸粉，進(jìn)一步確定其最優(yōu)添加量為0.4 g/100 mL；最佳碳源為葡萄糖，最優(yōu)添加量為2.0 g/100 mL；pH 6.72時(shí)（自然狀態(tài)下）紫紅曲霉M-4產(chǎn)孢子情況較好；最佳裝液量為120 mL（500 mL錐形瓶）；CaCO3為培養(yǎng)基的最佳金屬離子來源；菌株培養(yǎng)產(chǎn)孢子的最佳傳代次數(shù)為2 代，此條件下連續(xù)培養(yǎng)6 d，菌株產(chǎn)孢子數(shù)可達(dá)到最高值。通過響應(yīng)面方法分析得到紫紅曲霉M-4液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢子數(shù)的優(yōu)化條件為馬鈴薯浸粉添加量0.38 g/100 mL、葡萄糖添加量2.2 g/100 mL、培養(yǎng)時(shí)間6.5 d，此條件下紫紅曲霉M-4最大產(chǎn)孢子數(shù)為（7.47±0.15）×106CFU/mL，較優(yōu)化前提高30.13 倍，效果較顯著，菌株單位體積的產(chǎn)孢子能力得到大幅度提升。