滕祥云，王新夢(mèng)，劉 維，樊 慧，李 琦

(長(zhǎng)沙三濟(jì)生物科技有限公司,長(zhǎng)沙 410205)

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在我國(guó)結(jié)直腸癌的死亡率位于全部惡性腫瘤死亡率的前6位，對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響[1]。伊立替康是一種治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的特效藥，與氟尿嘧啶聯(lián)合使用，可以延長(zhǎng)結(jié)直腸癌患者的生存期[2]。但是，伊立替康因其毒副作用的影響(尤其是嚴(yán)重的延遲性腹瀉以及骨髓抑制)，使用受到一定的限制。而引起伊立替康產(chǎn)生毒副作用發(fā)生的機(jī)制可能與遺傳基因多態(tài)性有關(guān)。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(uridine diphosphate glucuronosyltransferase，UGT)是 體 內(nèi)重要第II相生物轉(zhuǎn)化代謝酶，分為UGT1和UGT2兩個(gè)家族。UGT1A1啟動(dòng)子區(qū)存在大量的TA堿基重復(fù)序列(TA6或TA7)，隨著TA重復(fù)序列數(shù)目的增加，UGT1A1表達(dá)下降，將導(dǎo)致伊立替康代謝產(chǎn)物SN-38在體內(nèi)過度蓄積，從而引發(fā)嚴(yán)重的毒副反應(yīng)[3]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)在伊立替康和UGT1A1的標(biāo)簽中表明，UGT1A1*28純合基因型(TA7/ TA7)使用伊立替康進(jìn)行治療時(shí)，中性粒細(xì)胞減少增加。

有研究發(fā)現(xiàn)，UGT1A1 基因多態(tài)性的分布在不同種族間存在明顯差異[4]，為進(jìn)一步明確中國(guó)漢族結(jié)直腸癌人群UGT1A1*28位點(diǎn)基因多態(tài)性的分布特點(diǎn)及差異，本研究采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)505例漢族結(jié)直腸癌患者UGT1A1*28的基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，比較不同性別、年齡段及地區(qū)漢族結(jié)直腸癌患者中UGT1A1*28基因型分布特點(diǎn)，為結(jié)直腸癌人群的UGT1A1*28基因篩查及個(gè)體化用藥提供理論依據(jù)，有效減少臨床延遲性腹瀉以及骨髓抑制等不良事件的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 505例結(jié)直腸癌患者的臨床樣本來自全國(guó)49家醫(yī)療機(jī)構(gòu)于2016～2017年送檢的血液標(biāo)本，每份樣本均通過病理檢查確診。其中，男性311例，平均年齡58.10±11.19歲；女性194例，平均年齡56.19±11.73歲。

1.2 試劑與儀器 DNA提取試劑盒、測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒(長(zhǎng)沙三濟(jì)生物科技有限公司)；焦磷酸測(cè)序試劑、 Qiagen PyroMark Q24 焦磷酸測(cè)序儀(德國(guó)凱杰公司)；PCR擴(kuò)增引物和焦磷酸測(cè)序引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提?。喊凑誅NA提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)：見表1。采用PyroMark Assay Design Software2.0(德國(guó)凱杰公司)軟件設(shè)計(jì)PCR引物和焦磷酸測(cè)序引物。

表1 UGT1A1*28 位點(diǎn)的引物序列

1.3.3 焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)UGT1A1*28的基因多態(tài)性 ：按照儀器和試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增、焦磷酸測(cè)序，并通過Qiagen PyroMark Q24(德國(guó)凱杰公司)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)出峰的堿基和峰高判斷UGT1A1*28的基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表述，組間比較采用 χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)采用Person χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)UGT1A1*28基因多態(tài)性，其代表性結(jié)果見圖1。

圖1 UGT1A1*28焦磷酸測(cè)序結(jié)果

2.2 UGT1A1*28基因型分布情況 UGT1A1*28的3種基因型分布頻率為TA6/TA6：74.26%，TA6/TA7：22.97%，TA7/TA7：2.77%，等位基因的分布頻率為TA6：85.74%，TA7：14.26%，檢測(cè)結(jié)果符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.84，P ＞ 0.05)。

2.3 中國(guó)漢族結(jié)直腸癌患者UGT1A1*28基因型和等位基因分布 505例結(jié)直腸癌患者中，UGT1A1*28野生型(TA6/TA6)、雜合型(TA6/TA7)、突變純合型(TA7/TA7)頻率分別為74.26%，22.97%和2.77%。通過對(duì)不同性別、年齡段以及地區(qū)UGT1A1*28基因型和等位基因數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，基因型分布和等位基因分布與患者性別、年齡以及地區(qū)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞ 0.05)，見表2。

3 討論

UGT1A1基因位于染色體2q37，是尿苷酸二磷酸葡萄醛酸轉(zhuǎn)移酶中的一員，其基因產(chǎn)物的主要作用是醛酸化各種外源性藥物以及內(nèi)生底物葡萄糖，使其更好地被清除，包括伊立替康、膽紅素等。伊立替康(Irinotecan, CPT-11)，是一種DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，是目前治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌最有效的化療藥物之一[5]，主要在肝臟內(nèi)進(jìn)行代謝，形成活性代謝產(chǎn)物7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)，SN-38的細(xì)胞毒性大大增強(qiáng)，從而導(dǎo)致毒副作用的發(fā)生。UGT1A1是伊立替康的重要代謝酶，該基因位點(diǎn)存在50多種基因多態(tài)性，其中以UGT1A1*6和UGT1A1*28與伊立替康療效和安全性研究為主[6-7]，UGT1A1*28啟動(dòng)子區(qū)存在大量的TA堿基重復(fù)序列，隨著TA重復(fù)序列數(shù)目的增加，UGT1A1酶活性下降，使得SN-38在體內(nèi)蓄積，從而引發(fā)嚴(yán)重的毒副反應(yīng)[3]。2005年FDA批準(zhǔn)UGT1A1*28用于預(yù)測(cè)伊立替康的不良反應(yīng)。

結(jié)直腸癌是一種世界范圍的消化道常見惡性腫瘤，發(fā)病率位于第三位[8]。在我國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率約為37.6/10萬，死亡率約為19.1/10萬[9]，并且呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，成為中國(guó)社會(huì)重要的健康負(fù)擔(dān)，尤其是在較為發(fā)達(dá)的省份[10]。以往研究表明UGT1A1*28基因多態(tài)性與伊立替康療效及不良反應(yīng)密切相關(guān)，并且UGT1A1*28基因多態(tài)性有地域和種族差異。本次研究中中國(guó)漢族結(jié)直腸癌患者中UGT1A1*28 的3種基因型發(fā)生率與國(guó)內(nèi)漢族人群相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[11-12]。UGT1A1*28的基因型分布頻率為TA6/TA6：74.26%，TA6/TA7：22.97%，TA7/TA7：2.77%，等位基因的分布頻率為TA6：85.74%，TA7：14.26%。UGT1A1*28的3種基因型及兩種等位基因分布與中國(guó)漢族結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、地區(qū)差異無關(guān)。但在新疆維吾爾族人群[13]中， TA6與TA7兩種等位基因的頻率分別為30.93%和69.07%，兩者之間存在差異性。與國(guó)外研究相比，泰國(guó)[14]UGT1A1*28基因頻率分布與我國(guó)相似，沙特阿拉伯[15]、秘魯和墨西哥[16]TA7等位基因頻率高于我國(guó)。由此可知，UGT1A1*28基因頻率存在種族差異性，相比于白種人，TA7等位基因在中國(guó)人群中的頻率較低。

綜上所述，UGT1A1是伊立替康重要的代謝酶，UGT1A1*28基因多態(tài)性可以預(yù)測(cè)伊立替康不良反應(yīng)，但是UGT1A1*28在白種人群中突變率較高，而在中國(guó)人群中突變率較低，在對(duì)中國(guó)人使用伊立替康治療時(shí)，是否需要檢測(cè)UGT1A1*28多態(tài)性，尚無一致的定論。本次研究還存在很多局限性，本次研究結(jié)果還需要更廣泛的地區(qū)，更大的樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。