吳毅 梁仔 劉墉 劉成輝

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的發(fā)病主要是由于外力打擊造成的腦神經(jīng)組織損傷，除因直接外力導(dǎo)致的原發(fā)性腦損傷外，還可因灶傷后缺血、水腫、血液毒性、免疫炎癥等引起繼發(fā)性腦損傷，大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重影響神經(jīng)功能的恢復(fù)[1-3]。有報(bào)道指出，我國每年約有數(shù)十萬人因TBI致死、致殘[4]。內(nèi)脂素是一種脂肪細(xì)胞因子，也可稱之為煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT），是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）補(bǔ)救合成途徑中的限速酶，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NAD+水平從而調(diào)控NAD+依賴蛋白的活性[5]。NAD+作為脫氫酶的輔酶，在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)、氧化呼吸鏈中具有重要的作用[6,7]。TBI后機(jī)體處于高分解代謝應(yīng)激狀態(tài)，細(xì)胞對能量物質(zhì)的需要與代謝供給存在失衡，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞的凋亡[8,9]。本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)脂素能夠顯著降低TBI小鼠病灶周圍神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，對神經(jīng)功能的修復(fù)有重要的促進(jìn)作用，有潛在的臨床使用價(jià)值?，F(xiàn)將目前的研究結(jié)果進(jìn)行如下報(bào)道，以供學(xué)界探討。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及液壓沖擊腦損傷模型建立

48只健康成年雄性C57BL/6小鼠（4～6月齡，體質(zhì)量20～25 g）購自廣州賽柏諾生物科技有限公司。小鼠飼養(yǎng)條件：溫度20℃～25℃，濕度60%，晝夜光照時(shí)間各12 h。小鼠在進(jìn)行模型制作前，先適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。液壓沖擊腦損傷模型采用美國MODEL01-B液壓沖擊裝置，具體方法：小鼠經(jīng)5%水合氯醛充分麻醉后，頭頂部備皮消毒，用眼科剪刀以兩耳連線正中位置縱向剪開皮膚，然后剝離皮膚至骨外膜并固定皮膚，然后用龍膽紫在小鼠顱骨矢狀縫右側(cè)、冠狀縫后側(cè)各4 mm位置做一標(biāo)記，隨后以標(biāo)記點(diǎn)為中心用磨鉆磨一直徑8 mm大小的骨窗，用10 mL注射器吸取生理鹽水小心沖洗骨窗，去除骨碎片，過程中注意保護(hù)硬腦膜完整。骨窗建立后，將液壓沖擊器的沖擊管口小心放置在骨窗內(nèi)，周圍用牙托粉固定沖擊管并密閉管口周邊縫隙。然后啟動(dòng)液壓沖擊器，打擊強(qiáng)度設(shè)定為0.05 MPa，造成氣壓帶動(dòng)液壓打擊小鼠腦組織，建立TBI模型。隨后，雙抗工作液（青霉素：100 U/mL，鏈霉素：0.1 mg/mL）沖洗傷口，骨蠟封閉骨窗，縫合傷口皮膚，消毒皮膚。

二、分組與治療

通過液壓打擊法建立的48只TBI小鼠模型，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B、對照組，每組16只[10]。模型建立3 h后，實(shí)驗(yàn)組A和實(shí)驗(yàn)組B均給予內(nèi)脂素（貨號：68373，Sigma公司，美國）治療，劑量分別為15、30μg/kg，腹腔注射，1次/d，治療7 d。對照組僅給予腹腔注射生理鹽水。

三、小鼠神經(jīng)功能缺損評分

模型建立后，在治療開始前、治療開始后第3、14、28天分別進(jìn)行小鼠神經(jīng)功能缺損評分（neurological severity scores，NSS），具體評分項(xiàng)目包括：出圈、偏癱、直線行走、驚嚇反射、探究行為、方桿平衡（5 mm）、圓桿平衡（5 mm）、方桿行走（3 cm）、方桿行走（2 cm）、方桿行走（1 cm）。上述任務(wù)完成計(jì)0分，失敗計(jì)1分，評分越高，神經(jīng)功能損傷越重[11]。

四、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

治療結(jié)束后第24～28天，通過Morris水迷宮試驗(yàn)觀察小鼠治療后學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)情況。水迷宮裝置包括軌跡跟蹤攝像機(jī)、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、圓形水池（d：1.2 m；h：0.6 m）。具體方法：在圓形水池中注水至深度0.5 m，然后加入足量牛奶至液體奶白色。圓形水池第Ⅰ象限頁面下2 cm深度未平臺(tái)所在位置。將小鼠分別從水池Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限放入水池中，開始計(jì)時(shí)，觀察小鼠在90 s內(nèi)是否找到平臺(tái)，若不能則幫助其找到平臺(tái)以讓小鼠獲知平臺(tái)位置。記錄小鼠從不同象限放入后找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃逸潛伏期時(shí)間。

五、小鼠全腦組織的獲取及石蠟切片

治療結(jié)束后第2天，每組隨機(jī)取3只小鼠全腦取材，用于TUNEL染色。具體方法：小鼠經(jīng)5%水合氯醛充分麻醉后，眼科剪剪開小鼠顱蓋骨后部，止血鉗剝離顱骨，顯微剪剪斷顱底神經(jīng)獲取全腦樣本，放入福爾馬林中固定標(biāo)本，24 h后進(jìn)行脫水、透明，然后石蠟包埋組織，以5μm厚度進(jìn)行石蠟切片。

六、TUNEL染色

一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京碧云天科技有限公司）用于細(xì)胞凋亡的檢測。染色步驟：（1）切片在二甲苯中脫蠟2次，每次10 min；（2）依次無水乙醇浸泡5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min；（3）滴加20μg/mL不含DNase的蛋白酶K，室溫作用30 min，然后PBS洗滌3次，每次5 min；（4）滴加TUNEL檢測液覆蓋組織，37℃避光孵育60 min；（5）PBS洗滌3次，每次5 min；（6）用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。陽性細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)方法：在400倍視野下，以著力點(diǎn)為中心周邊任意6個(gè)視野中的陽性細(xì)胞數(shù)取平均數(shù)，共計(jì)數(shù)6張切片。

七、Western blot檢測

治療結(jié)束后第2天，每組隨機(jī)選取3只小鼠取腦組織蛋白。小鼠經(jīng)充分麻醉后，用0.9%生理鹽水充分灌注，然后獲取著力點(diǎn)位置（骨窗下）黃豆大小腦組織，勻漿機(jī)處理后，用RIPA裂解液（北京碧云天科技有限公司）冰上裂解30 min，隨后在4℃12 000 r/min，有效半徑10 cm，離心10 min，吸取上清液獲取總蛋白。BCA蛋白濃度檢測試劑盒（北京碧云天科技有限公司）測定蛋白濃度。以每個(gè)樣品40μg總蛋白上樣量加到SDS-PAGE膠孔中，以80 V恒壓電泳，至蛋白marker跑至凝膠下緣時(shí)停止。切取 蛋 白cleave Caspase-3、Caspase-3、PRAP、GAPDH相應(yīng)分子量條帶進(jìn)行PVDF膜轉(zhuǎn)膜處理，以280 mA轉(zhuǎn)膜70 min。取出條帶放入5%BSA溶液中室溫封閉處理1 h，然后用塑封雜交袋進(jìn)行一抗孵育（一抗均用5%BSA溶液按照1∶1000稀釋使用）。4℃冰箱中孵育過夜后，TBST溶液洗滌一抗3次，5 min/次，然后進(jìn)行相應(yīng)種屬二抗孵育（二抗用TBST溶液按照1∶10 000稀釋使用），室溫孵育1 h。然后洗滌二抗3次，每次5 min。條帶用ECL顯影液顯影后曝光。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，NSS評分、潛伏逃逸時(shí)間等計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組間均數(shù)比較采用F檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3組腦損傷小鼠NSS評分比較

實(shí)驗(yàn)干預(yù)前，3組小鼠的NSS評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。開始治療后第3天，3組小鼠的NSS評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而在第14、28天時(shí)，3組小鼠的NSS評分差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且實(shí)驗(yàn)組B優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組A。詳細(xì)信息見表1。

表1 3組小鼠的神經(jīng)功能缺損評分比較（）

表1 3組小鼠的神經(jīng)功能缺損評分比較（）

與對照組比較，a P＜0.05

二、3組小鼠水迷宮潛伏逃逸期時(shí)間比較

3組小鼠24、25 d時(shí)潛伏逃逸期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在26、27、28 d時(shí)潛伏逃逸期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組潛伏逃逸期時(shí)間較對照組更短，小鼠能夠更快地找到平臺(tái)，且內(nèi)脂素劑量更高，潛伏逃逸期越短（表2）。3組小鼠第28天時(shí)水迷宮路徑圖見圖1。

表2 3組小鼠水迷宮潛伏逃逸期比較（s，）

表2 3組小鼠水迷宮潛伏逃逸期比較（s，）

與對照組比較，a P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)組A比較，b P＜0.05

三、3組小鼠細(xì)胞的凋亡檢測結(jié)果比較

TUNEL染色結(jié)果顯示，內(nèi)脂素治療后組織切片中陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.533、P=0.030，t=3.946、P=0.003）（圖2A～B）。Western blot檢測顯示，內(nèi)脂素降低了小鼠腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleave Caspase-3、cleaved PARP的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.023、P=0.026，t=5.838、P=0.028）（圖2C～D）。

討 論

腦組織是人體各系統(tǒng)中代謝最為旺盛的組織，需要大量的能量供給以維持正常的細(xì)胞代謝、電生理活動(dòng)[12]。TBI發(fā)生后早期，腦組織常處于代謝應(yīng)激狀態(tài)，對物質(zhì)和能量的需求劇增，腦損傷可導(dǎo)致局部血循環(huán)障礙、局部出血、水腫等，引起的二次損傷進(jìn)一步加劇了氧供需失衡，神經(jīng)細(xì)胞在原發(fā)性和繼發(fā)性因素作用下逐漸凋亡[13,14]。研究證明，細(xì)胞內(nèi)NAD+水平對哺乳動(dòng)物細(xì)胞的存活非常重要，細(xì)胞中NAD+含量不足能夠引起細(xì)胞的凋亡，其中一個(gè)重要機(jī)制是NAD+水平能夠顯著影響Caspase依賴性核酸內(nèi)切酶DFF40的活性，從而造成DNA斷裂，促發(fā)凋亡[15,16]。內(nèi)脂素是NAD+補(bǔ)救合成途徑中的限速酶，對NAD+有重要的作用[17]。有研究表明，激活內(nèi)脂素，促進(jìn)NAD+的合成能夠增強(qiáng)嚙齒類動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力，可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[18,19]。TBI后神經(jīng)細(xì)胞處于處于高分解代謝應(yīng)激狀態(tài)，細(xì)胞對能量物質(zhì)的需要與代謝供給存在失衡，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞的凋亡，因此提高細(xì)胞的代謝能力有助于神經(jīng)細(xì)胞度過代謝應(yīng)激導(dǎo)致的供能不足[8,9]。

圖1 3組小鼠第28天時(shí)水迷宮路徑圖

圖2 3組小鼠TUNEL染色及凋亡相關(guān)蛋白比較

本研究通過液壓打擊方式建立了小鼠TBI模型，該模型較好地模擬了臨床TBI病情，是國際上通用的動(dòng)物TBI模型。通過內(nèi)脂素的干預(yù)，從神經(jīng)功能修復(fù)、學(xué)習(xí)記憶能力兩方面評價(jià)內(nèi)脂素的治療作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)脂素的干預(yù)對TBI后小鼠NSS評分有明顯的影響。開始治療前，3組小鼠間NSS評分無明顯差異，具有良好的可比性，自開始治療后第3天，3組間小鼠NSS評分無明顯差異，考慮此刻處于水腫高峰期剛過，神經(jīng)功能恢復(fù)尚未出現(xiàn)明顯改善，而在治療后第14、28天，小鼠的NSS評分顯著低于對照組，并且高劑量內(nèi)脂素組小鼠NSS評分要低于低內(nèi)脂素劑量組小鼠，即神經(jīng)功能修復(fù)情況更好。由此可見，內(nèi)脂素對TBI小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)支配的運(yùn)動(dòng)功能修復(fù)有明顯的改善作用。本研究還通過水迷宮實(shí)驗(yàn)評價(jià)了內(nèi)脂素對TBI后小鼠學(xué)習(xí)記憶能力修復(fù)的作用，水迷宮功能實(shí)驗(yàn)在早期對小鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力訓(xùn)練，讓小鼠熟悉水迷宮環(huán)境下平臺(tái)位置，通過比較小鼠對平臺(tái)位置記憶及尋找平臺(tái)所需要的時(shí)間來評價(jià)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。與神經(jīng)支配運(yùn)動(dòng)功能修復(fù)情況的趨勢一致，內(nèi)脂素對TBI后小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力修復(fù)同樣有明顯的改善作用，內(nèi)脂素治療后的小鼠能夠更快速記住水面下平臺(tái)位置，迅速找到平臺(tái)。神經(jīng)系統(tǒng)支配的運(yùn)動(dòng)功能、學(xué)習(xí)記憶能力都是在相關(guān)功能神經(jīng)元細(xì)胞的調(diào)控下完成的，這類神經(jīng)細(xì)胞屬于高度分化的不可再生細(xì)胞，在腦創(chuàng)傷中，除原發(fā)性腦損傷可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的直接死亡，繼發(fā)性腦水腫等二次損傷因素則進(jìn)一步加劇了神經(jīng)細(xì)胞的死亡及神經(jīng)功能的惡化[20,21]。本文通過TUNEL實(shí)驗(yàn)和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測分析了細(xì)胞凋亡差異是否與不同組內(nèi)小鼠腦細(xì)胞凋亡差異有關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)脂素治療后TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目明顯更少，說明內(nèi)脂素降低了小鼠TBI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并且凋亡相關(guān)蛋白cleave Caspase-3、cleaved PARP的表達(dá)量也明顯降低。

綜上所述，內(nèi)脂素通過其促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)NAD+及其代謝產(chǎn)物的合成功能，一定程度上緩解了TBI后代謝應(yīng)激帶來了壓力，對能量供需平衡起到了調(diào)節(jié)作用，從而抑制TBI后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，對神經(jīng)細(xì)胞起到了保護(hù)作用，促進(jìn)了神經(jīng)功能的修復(fù)。