張春聲 李海燕 徐如祥 徐弢

生物3D打印技術(shù)代表著當(dāng)前醫(yī)療及科研行業(yè)的重點(diǎn)發(fā)展方向之一，率先在骨科獲得廣泛臨床應(yīng)用，在神經(jīng)外科、口腔、肝膽及腫瘤等科室領(lǐng)域內(nèi)也已獲得一定的探索應(yīng)用，具體應(yīng)用研究涵蓋了醫(yī)學(xué)模型、復(fù)雜組織工程支架制造、組織再生與修復(fù)、個(gè)性化腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療模型以及高端植入類器械的制造等多個(gè)方面[1]。針對(duì)神經(jīng)外科領(lǐng)域的研究，生物3D打印技術(shù)與臨床已形成緊密結(jié)合，在手術(shù)治療及前沿研究等方面均有深度融合。本文主要聚焦神經(jīng)外科領(lǐng)域，根據(jù)神經(jīng)外科中常見的專業(yè)分類，并結(jié)合國內(nèi)外開展生物3D打印技術(shù)發(fā)展情況，探討生物3D打印技術(shù)在神經(jīng)外科領(lǐng)域中的發(fā)展和應(yīng)用機(jī)遇，現(xiàn)綜述如下。

一、生物3D打印技術(shù)概況

生物3D打印技術(shù)是指以加工生物材料、活性物質(zhì)及活細(xì)胞等作為打印對(duì)象，經(jīng)特殊的打印裝置，按照設(shè)定好的程序運(yùn)行后，所形成具有三維立體結(jié)構(gòu)的類組織體，可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)以及組織工程修復(fù)等領(lǐng)域[2,3]。對(duì)于神經(jīng)外科臨床科室，腦腫瘤、顱骨修補(bǔ)、神經(jīng)和血管再生修復(fù)等研究一直屬于熱點(diǎn)，也是急需解決的重大民生問題，國內(nèi)外已有很多團(tuán)隊(duì)結(jié)合生物3D打印技術(shù)在上述領(lǐng)域開展相關(guān)研究。

二、生物3D打印技術(shù)在國內(nèi)外神經(jīng)外科領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀

（一）腦腫瘤治療領(lǐng)域

腦腫瘤已成為危害人類生命健康的重要腫瘤之一，全球發(fā)病率逐年升高?；诨颊叩挠跋駭?shù)據(jù)，3D打印醫(yī)學(xué)模型可用于輔助臨床手術(shù)，縮短手術(shù)時(shí)間，提高手術(shù)成功率，目前在臨床癌癥治療方面已有多方面研究報(bào)道。2015年，日本Mashiko等[4]和Kimura等[5]研究團(tuán)隊(duì)分別利用3D打印技術(shù)制作出醫(yī)學(xué)3D打印血管模型，從顱內(nèi)結(jié)構(gòu)、材質(zhì)以及手術(shù)入路方式等多方面高度仿真真實(shí)動(dòng)脈瘤血管的解剖部位。2015年中國Tai等[6]研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)出可用于腦室穿刺手術(shù)訓(xùn)練的教學(xué)培訓(xùn)的醫(yī)學(xué)3D打印模型，并且為了用于降低材料成本，設(shè)計(jì)和打印上采用拆卸后再組裝方式，輔助臨床醫(yī)師提高手術(shù)技能掌握。2016年，蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院蘭青團(tuán)隊(duì)在國內(nèi)率先使用3D打印全彩醫(yī)學(xué)模型用于重構(gòu)動(dòng)脈瘤模型，輔助術(shù)前選擇合適的手術(shù)器械以及最佳的手術(shù)入路方式，精準(zhǔn)指導(dǎo)手術(shù)[7]。3D打印醫(yī)學(xué)模型主要是在體外應(yīng)用，在術(shù)前幫助醫(yī)生和患者更加直接地了解病情或是輔助臨床手術(shù)，提供更加精準(zhǔn)的個(gè)性化手術(shù)治療方案。3D打印醫(yī)學(xué)模型具有多色彩、多材質(zhì)等特點(diǎn)，便于臨床觀察以及仿真解剖結(jié)構(gòu)，但是無法滿足臨床上對(duì)手術(shù)切除后缺損處的組織部位再生修復(fù)等方面的需求。

隨著生物3D打印技術(shù)的不斷發(fā)展，已逐漸形成結(jié)合臨床需求和應(yīng)用為出發(fā)點(diǎn)的再生修復(fù)和腫瘤領(lǐng)域內(nèi)的研究。2018年，蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院和清華大學(xué)團(tuán)隊(duì)合作研究了生物3D打印技術(shù)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型、腫瘤微環(huán)境以及成血管化等方面進(jìn)行研究，對(duì)比傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)方式，研究證實(shí)生物3D打印后的腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞增殖、分化、干性能力保持以及動(dòng)物體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)上均表現(xiàn)出明顯的差異性，為腦腫瘤的發(fā)生機(jī)制及個(gè)性化藥物精準(zhǔn)治療提供理論研究模型[8-11]。生物3D打印通過模擬腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，能夠成功構(gòu)建出具有三維立體結(jié)構(gòu)的腦腫瘤模型，但是該模型中選取了細(xì)胞系作為研究對(duì)象，對(duì)于臨床應(yīng)用指導(dǎo)癌癥患者用藥方面，與患者腫瘤組織在生物學(xué)特性上存在一定的差別，難以實(shí)際反映患者的真實(shí)情況，無法真正指導(dǎo)臨床。然而，2019年韓國Dong-Woo Cho研究團(tuán)隊(duì)在應(yīng)用層面率先利用生物3D打印技術(shù)結(jié)合患者來源的原代細(xì)胞，成功構(gòu)建了針對(duì)特定患者的個(gè)性化膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）芯片，將患者來源的腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及豬來源的腦組織脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建了具有同心環(huán)結(jié)構(gòu)的腫瘤組織芯片，高度仿生模擬真實(shí)GBM組織特性，用于觀察體外環(huán)境下放射、化學(xué)治療對(duì)患者腫瘤芯片的細(xì)胞學(xué)行為變化，并對(duì)比臨床觀察不同患者對(duì)替莫唑胺同步放射、化學(xué)治療的特異性反應(yīng)，幫助評(píng)估不同藥物組合方式對(duì)腫瘤患者的治療效果，為臨床方案的精準(zhǔn)用藥指導(dǎo)提供依據(jù)[12]。

（二）再生型顱骨修復(fù)

因交通事故、疾病發(fā)生等各種原因?qū)е碌娘B腦創(chuàng)傷患者數(shù)量逐年升高，臨床上顱骨修補(bǔ)產(chǎn)品種類多樣，按材料劃分以人工合成材料為主，其中包括硅膠、聚甲基丙烯酸甲酯、鈦網(wǎng)、聚醚醚酮等，這些材料均為不降解材料，且具有一定的生物惰性，這些材料能夠滿足顱骨缺損處的修補(bǔ)，但是缺少生物活性，與自體骨之間骨融合性差，尤其對(duì)于小兒患者，無法滿足顱骨再生的需求。因此，對(duì)于可再生型顱骨的研究具有一定的臨床需求。據(jù)報(bào)道，2016年美國Atala團(tuán)隊(duì)通過對(duì)下頜骨缺損患者進(jìn)行CT掃描并獲取其影像數(shù)據(jù)后，采用生物3D打印技術(shù)，以人來源的羊水干細(xì)胞（human amniotic fluidderived stem cells，hAFSCs）和聚己內(nèi)酯/磷酸三鈣為打印原料，制備出3.6 cm×3.0 cm×1.6 cm可用于缺損處填充的生物活性個(gè)性化骨組織支架，體外培養(yǎng)1 d后，細(xì)胞存活率達(dá)到91%±2%，體外培養(yǎng)28 d后茜素紅染色可觀察到明顯的成骨分化；通過打印出直徑為8 mm、厚度為1.2 mm的圓塊支架并復(fù)合hAFSCs植入到SD大鼠的顱骨缺損模型中，5個(gè)月后觀察到支架內(nèi)部有大量含血管的新生骨組織生成，而陰性對(duì)照和無細(xì)胞支架實(shí)驗(yàn)組僅能觀察到纖維組織的長入[13]。2019年第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院費(fèi)舟團(tuán)隊(duì)利用動(dòng)物自體骨瓣來源，經(jīng)冷凍研磨處理成活性骨粒，并通過向材料中引入自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)合生物3D打印技術(shù)以不同填充率及層間角度基于影像學(xué)數(shù)據(jù)成功制備出具有可再生型功能的多元個(gè)性化顱骨修復(fù)支架，并對(duì)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架中的細(xì)胞增殖、存活率以及成骨分化相關(guān)基因等進(jìn)行檢測(cè)，并建立了兔顱骨缺損模型，評(píng)價(jià)支架植入新西蘭大白兔體內(nèi)后3個(gè)月后的成骨能力，可觀察到大量新生骨組織。生物3D打印技術(shù)具有個(gè)性化設(shè)計(jì)、仿生定制等特點(diǎn)，一方面能夠滿足缺損部位形狀的精準(zhǔn)匹配實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)仿生；另一方面，選擇自體的生物活性物質(zhì)作為打印原材料又可實(shí)現(xiàn)組分仿生，從而促進(jìn)打印支架植入后的功能仿生[14]。

（三）神經(jīng)組織再生

神經(jīng)系統(tǒng)在機(jī)體內(nèi)對(duì)生理功能活動(dòng)的調(diào)節(jié)起主導(dǎo)作用，由于神經(jīng)損傷的多樣性和病例改變的復(fù)雜性，傳統(tǒng)的神經(jīng)康復(fù)治療效果并不理想，功能恢復(fù)不佳。神經(jīng)導(dǎo)管的制作方法比較多，包括模具法、編織技術(shù)、靜電紡絲、溶劑揮發(fā)等多種方式，但是對(duì)于理想的神經(jīng)導(dǎo)管構(gòu)建要素應(yīng)當(dāng)考慮材料組分、模擬自體結(jié)構(gòu)以及最佳的種子細(xì)胞等。生物3D打印技術(shù)能夠適用于多種材料和細(xì)胞的打印，尤其在微觀結(jié)構(gòu)上能夠?qū)崿F(xiàn)更加精細(xì)的仿生制造。2016年四川大學(xué)華西醫(yī)院茍馬玲團(tuán)隊(duì)通過一種3D生物打印技術(shù)制備出可用于周圍神經(jīng)再生修復(fù)的神經(jīng)導(dǎo)管。該生物導(dǎo)管由聚合的明膠甲基丙烯?；╟ryo gelat in methacryloyl，cryoGelMA）凝膠和脂肪來源的干細(xì)胞（adipose derived stem cells，ASCs）組成，通過使用3D打印的“鎖和鑰匙”模具進(jìn)行建模，cryoGelMA凝膠被構(gòu)設(shè)計(jì)多通道、分叉型以及個(gè)性化定制結(jié)構(gòu)等具有不同幾何形狀的導(dǎo)管，體外實(shí)驗(yàn)以及植入到缺損長度為10 mm大鼠坐骨神經(jīng)缺損處，發(fā)現(xiàn)cryoGelMA在體內(nèi)2～4個(gè)月可完全降解，研究在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)下大鼠模型的步行軌跡進(jìn)行分析，證明cryoGelMA和ASCs實(shí)驗(yàn)組的生物導(dǎo)管具有較強(qiáng)的神經(jīng)再生能力，在功能和組織學(xué)評(píng)估方面的結(jié)果更加接近自體移植物[15]。2017年日本京都大學(xué)的Hirofumi Yurie研究團(tuán)隊(duì)率先利用生物3D打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)再生功能，通過采集人體皮膚提取成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)出來細(xì)胞塊，經(jīng)生物3D打印制造出內(nèi)徑為2 mm，壁厚為500μm的筒狀神經(jīng)導(dǎo)管。通過實(shí)驗(yàn)鼠的對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植入生物3D神經(jīng)組織的實(shí)驗(yàn)鼠與健康實(shí)驗(yàn)鼠一樣行走，并測(cè)量了老鼠的跖骨擺動(dòng)、肌肉動(dòng)作電位和神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)，研究表明完全由纖維細(xì)胞組成的無支架生物3D導(dǎo)管可以促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)模型中的神經(jīng)再生[16]。2017年5月，美國明尼蘇達(dá)大學(xué)和普林斯頓大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究人員發(fā)現(xiàn)首先利用3D掃描獲得了小鼠坐骨神經(jīng)的輪廓，然后再利用3D打印技術(shù)打造出了一個(gè)內(nèi)含能夠促進(jìn)神經(jīng)元再生的生長因子NGF或膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF的硅酮類支架，通過手術(shù)將這種支架植入到缺損為10 mm的大鼠坐骨神經(jīng)損傷處，經(jīng)過10～12周的培養(yǎng)，大鼠受損的行動(dòng)功能獲得了明顯改善，這一結(jié)果表明3D打印技術(shù)將在促進(jìn)復(fù)雜神經(jīng)元功能的恢復(fù)方面起到重要作用[17]。2019年美國Jacob Koffler團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用生物3D打印技術(shù)，以PEG-GelMA為打印原材料，構(gòu)建了具有白質(zhì)和灰質(zhì)結(jié)構(gòu)的仿生大鼠脊髓模型，其中脊髓白質(zhì)部分具有200μm孔徑，灰質(zhì)為實(shí)心固體結(jié)構(gòu)，通過向支架中添加神經(jīng)前體細(xì)胞后，觀察移植后體內(nèi)神經(jīng)軸突再生和神經(jīng)通路連通情況，發(fā)現(xiàn)受損的宿主脊髓再生的神經(jīng)軸突生長進(jìn)入到打印的仿生脊髓支架中，該方法構(gòu)建的仿生脊髓支架可以實(shí)現(xiàn)受損部位星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)軸突的定向排列生長，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)對(duì)脊髓神經(jīng)再生修復(fù)提供了一種新的研究思路[18]。

（四）血管重建

全球心血管病患病率及死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，導(dǎo)致臨床上對(duì)于人工血管的需求也日漸增多。理想的人工血管應(yīng)當(dāng)具有一定的力學(xué)強(qiáng)度、彈性以及植入后保持血管內(nèi)部的通暢等特點(diǎn)。目前，大尺寸（直徑≥6 mm）血管支架已在臨床獲得應(yīng)用，常用的材料包括聚四氟乙烯、絲素蛋白、聚氨酯等，但是小尺寸（直徑≤6 mm）血管，因植入后容易發(fā)生血栓以及血管內(nèi)膜增生等使其在臨床應(yīng)用方面受到局限[19]。2014年，美國哈佛大學(xué)的Jennifer A.Lewis研究團(tuán)隊(duì)基于生物3D打印技術(shù)以GelMA為生物墨水制備出具有多通道結(jié)構(gòu)的含成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，打印的多通道材料為F127，該材料具有在低溫狀態(tài)下呈現(xiàn)液態(tài)以及高溫下固化等特點(diǎn)，打印完成后通過溶解去除其中的F127材料，使得結(jié)構(gòu)體中富含大量的管狀通道，通過向管道內(nèi)壁中注入血管內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞附著在通道內(nèi)壁中自組裝形成血管，該方法為血管化的多細(xì)胞組織研究提供了一種策略[20]。2019年Miller JS研究團(tuán)隊(duì)利用光固化生物3D打印技術(shù)構(gòu)建了內(nèi)部含有豐富復(fù)雜血管網(wǎng)絡(luò)的水凝膠塊，通過向通道中分別灌注氧氣與脫氧紅細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)紅細(xì)胞的供氧仿生模擬人體肺泡結(jié)構(gòu)；其中最小的血管直徑為300μm[21]。人體組織中常含有豐富而密集的血管網(wǎng)絡(luò)，主要是為組織內(nèi)的活細(xì)胞提供氧氣以及營養(yǎng)物質(zhì)輸送，所以血管化是組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)關(guān)鍵問題，對(duì)于器官打印，尤其針對(duì)大塊組織的修復(fù)至關(guān)重要。目前，所制造的活性組織太小，制造用于器官修復(fù)或替換的大型組織，需要制造高細(xì)胞密度結(jié)構(gòu)體以及血管化通道。2019年，Jennifer A.Lewis研究團(tuán)隊(duì)再次在血管化組織研究方面取得突破進(jìn)展，研究發(fā)明SWIFT技術(shù)選用特異性誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞并使用大規(guī)模的微孔陣列聚集形成高密度細(xì)胞團(tuán)的器官堆積體OBBs，通過與Ⅰ型膠原和基質(zhì)膠在0℃～4℃下混合離心形成高密度的細(xì)胞聚體，并使用生物3D打印技術(shù)在高密度細(xì)胞聚集體中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)通道，去除打印通道的材料進(jìn)行灌注，從而在致密基質(zhì)內(nèi)部形成血管通道，并且這些通道的直徑范圍為400μm～1 mm[22]。該打印方法模擬了具有循環(huán)通道的高細(xì)胞密度和帶血管化厚實(shí)組織的構(gòu)建，進(jìn)一步接近組織修復(fù)和再生的活體結(jié)構(gòu)。

三、總結(jié)與展望

針對(duì)神經(jīng)外科研究領(lǐng)域的腦部腫瘤治療，通過建立腦腫瘤模型研究微環(huán)境變化下腫瘤的細(xì)胞行為學(xué)、腫瘤-血管發(fā)生機(jī)制等；在顱骨、神經(jīng)以及血管等組織再生方面，尤其是在個(gè)性化定制、復(fù)雜或精細(xì)的組織結(jié)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)組織修復(fù)的結(jié)構(gòu)仿生；同時(shí)，生物3D打印技術(shù)能夠滿足活細(xì)胞以及活性物質(zhì)等作為打印材料，通過選用不同的生物材料以及細(xì)胞類型或配比等實(shí)現(xiàn)組分仿生，進(jìn)而對(duì)功能進(jìn)行調(diào)控，實(shí)現(xiàn)最終的功能仿生。目前，基于生物3D打印技術(shù)在體外三維組織或器官模型、模擬病理微環(huán)境以及藥理模型等方面已經(jīng)有很大研究，未來有望為再生醫(yī)學(xué)、腫瘤治療研究、新藥研發(fā)等領(lǐng)域的研究及產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化帶來更多機(jī)遇。