王旭，程紫逸，曹新芳，任秋楠，王雪，張盛周

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省重要生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蕪湖 241000)

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)俗稱黃姑、黃魚、黃臘丁，隸屬鯰形目鲿科黃顙魚屬，是一種優(yōu)質(zhì)名貴的經(jīng)濟(jì)魚類；其肉質(zhì)鮮嫩味美、營養(yǎng)豐富，越來越受到消費(fèi)者的青睞。

隨著黃顙魚的人工養(yǎng)殖的推廣和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，對黃顙魚人工養(yǎng)殖相關(guān)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究也在不斷深入開展。Yang等[1]對黃顙魚幼體消化道的個體發(fā)育進(jìn)行了研究；Cao等[2]采用光鏡和透射電鏡對黃顙魚消化道上皮粘液細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和組化特征進(jìn)行了觀察分析；余濤等[3]對黃顙魚消化器官蛋白酶和淀粉酶活性進(jìn)行了生化測定分析。然而，黃顙魚消化道黏膜中與消化吸收相關(guān)的關(guān)鍵酶的分布與組織定位尚未見報道。本研究利用冰凍切片、酶組織化學(xué)染色和光密度定量分析技術(shù)對黃顙魚消化道不同部位酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、腺苷三磷酸酶(ATPase)、非特異性酯酶(NSE)、過氧化物酶(POX)和琥珀酸脫氫酶(SDH)等6種重要酶的分布與組織定位進(jìn)行了研究，旨在增進(jìn)對黃顙魚消化機(jī)能的認(rèn)識，為其人工養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人工養(yǎng)殖黃顙魚12條，重200～500g，購買于蕪湖市黃山西路的農(nóng)貿(mào)市場。用解剖刀柄敲其后腦致暈，迅速解剖并取出完整消化道，于食道、胃賁門、胃體、胃幽門、前腸、中腸和后腸等7個部位分別取樣，用磷酸緩沖液（PBS, pH7.4）快速漂洗后，對樣品進(jìn)行修整，繼而使用OCT包埋。最后，在冰凍切片機(jī)（Leica CM1900）上切出約8μm的切片，置于 -20℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 酶組織化學(xué)染色

黃顙魚6種重要酶的組織化學(xué)染色方法和酶反應(yīng)的主要底物見表1。其中，藥品試劑的全稱、配制方法、染色的具體操作步驟請參考謝毓玲等[4]的報道。

3 酶活力的光密度測定和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

在Olympus BX61型顯微鏡下觀察并拍照。使用Image-Pro Plus圖像分析軟件對選取的7個部位6種酶的清晰組織化學(xué)染色圖片的陽性部位進(jìn)行光密度分析，得到陽性部位的累積光密度(integrated optical density, IOD)和面積(Area)的準(zhǔn)確值，算出平均光密度值(mean optical density, MOD)。每種酶每個部位測10個視野，取其平均值表示酶活力。使用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 19.0，用單因素方差分析(one way ANOVA)對消化道不同部位酶的活力大小進(jìn)行差異顯著性比較，P＜0.05為差異顯著。

表1 酶組織化學(xué)染色技術(shù)及6種酶的主要底物Tab. 1 Enzyme histochemical staining techniques and main substrates of the 6 enzymes

結(jié) 果

在光鏡下，6種酶組織化學(xué)染色均呈現(xiàn)明顯的顏色反應(yīng)，染色結(jié)果經(jīng)光密度測定和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析后，黃顙魚消化道不同部位ACP、ALP、ATPase、NSE、POX和SDH 等酶的活力分布見表2。

1 酸性磷酸酶（ACP）的分布與定位

ACP的酶組織化學(xué)染色反應(yīng)顯示棕黃色。ACP在胃賁門、胃幽門和中腸酶活力顯著較高，其次是前腸和后腸，在食道和胃體酶活力明顯較弱。在食道中，ACP集中分布于固有層；在胃賁門和胃體中，ACP主要分布于固有層，粘膜上皮細(xì)胞和胃腺中亦有較多分布（圖1A1）；在胃幽門中，ACP主要分布于固有層，粘膜上皮細(xì)胞中亦有少量分布；在腸道各部位，ACP均集中分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部，固有層中有少量分布（圖1A2）。

2 堿性磷酸酶（ALP）的分布與定位

ALP的酶組織化學(xué)染色反應(yīng)顯示藍(lán)紫色。ALP在食道、前腸和后腸酶活力顯著較高，其次是中腸，在胃賁門、胃體和胃幽門酶活力明顯較弱。在食道中，ALP集中分布于固有層；在胃賁門和胃體中，ALP主要分布于黏膜上皮細(xì)胞，胃腺中亦有較多分布，在胃幽門中，ALP則集中分布于固有層；在腸道各部位，ALP 均集中分布于黏膜上皮細(xì)胞的紋狀緣（圖1B1）。

表2 黃顙魚消化道黏膜6種重要酶的組織化學(xué)分布Tab. 2 Histochemical distribution of the 6 essential enzymes in the mucosa along the different parts of digestive tract of Pelteobagrus fulvidraco

3 三磷酸腺苷酶（ATPase）的分布與定位

ATPase的酶組織化學(xué)染色反應(yīng)顯示棕黑色。ATPase 在食道中酶活力顯著較高，其次是胃賁門、胃體、胃幽門、前腸和后腸，在中腸酶活力明顯較弱。在食道中，ATPase多分布于固有層，黏膜上皮細(xì)胞頂部有少量分布（圖1C1）；在胃賁門和胃體中，ATPase 集中分布于胃腺（圖1C2），在胃幽門中，ATPase則集中分布于粘膜上皮細(xì)胞；在腸道中，ATPase 均集中分布于黏膜上皮細(xì)胞的紋狀緣。

4 非特異性酯酶（NSE）的分布與定位

NSE的酶組織化學(xué)染色反應(yīng)顯示棕紅色。NSE在胃幽門酶活力顯著較高，其次是食道和前腸，在胃賁門、胃體、中腸和后腸酶活力明顯較弱。在食道中，NSE 多分布于黏膜上皮細(xì)胞的表層；在胃賁門和胃體中，NSE主要分布于胃腺，固有層中亦有較多分布（圖1D1），在胃幽門中，NSE則集中分布于固有層；在腸道中，NSE主要分布于粘膜上皮細(xì)胞，其中粘膜上皮游離面明顯較多（圖1D2）。

5 過氧化物酶（POX）的分布與定位

POX的酶組織化學(xué)染色反應(yīng)顯示黃色或棕黃色，多呈顆粒狀分布。POX在食道和胃幽門酶活力顯著較高，其次是胃賁門、胃體、前腸和中腸，在后腸酶活力較弱。在食道中，POX多分布于黏膜上皮細(xì)胞基部（圖1E1）；在胃賁門和胃體中，POX集中分布于粘膜上皮細(xì)胞，胃腺部有少量點(diǎn)狀分布（圖1E2），在胃幽門中，POX則集中分布于固有層；在腸道中，POX主要分布于黏膜上皮細(xì)胞，其中粘膜上皮細(xì)胞游離面明顯較多。

6 琥珀酸脫氫酶（SDH）的分布與定位

SDH的酶組織化學(xué)染色反應(yīng)顯示藍(lán)紫色。SDH在前腸酶活力顯著較高，其次是胃賁門和胃體，在食道、胃幽門、中腸和后腸酶活力明顯較弱。在食道中，SDH主要分布于粘膜上皮細(xì)胞基底部，上皮細(xì)胞頂部亦有少量分布（圖1F1）；在胃賁門和胃體中，SDH集中分布于胃腺中（圖1F2），在胃幽門中，SDH則集中分布于粘膜上皮細(xì)胞；在腸道中，SDH主要分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部和基底部（圖1F3）。

圖1 6種重要酶在黃顙魚消化道黏膜中的組織化學(xué)定位。A，ACP在胃體（A1）和中腸（A2）的分布；B，ALP在中腸（B1）的分布；C，ATPase 在食道（C1）胃體（C2）的分布；D，NSE在胃賁門（D1）和前腸（D2）的分布；E，POX在食道（E1）和胃賁門（E2）的分布；F，SDH在食道（F1）、胃體（F2）和前腸（F3）的分布；L:消化道腔；ME:粘膜上皮；CG:賁門腺； FG:胃底腺；LP:固有層；SB:紋狀緣；比例尺=50μmFig. 1 Histochemical localization of 6 essential enzymes in the mucosa along the different parts of digestive tract of Pelteobagrus fulvidraco. A, location of ACP in the stomach corpus (A1) and middle intestine (A2)；B, location of ALP in the middle intestine (B1)；C, location of ATPase in the esophagus(C1) and stomach corpus (C2) ；D, location of NSE in the stomach cardia (D1) and anterior intestine (D2); E, location of POX in the esophagus(E1)and stomach cardia (E2)；F, location of SDH in the esophagus (F1) , stomach corpus (F2) and anterior intestine(F3)；L: lumen of the digestive tract;ME: mucosal epithelia; CG: cardia gland; FG: fundic gland; LP: lamina propria; SB: striated border; scale bar, 50μm

討 論

ACP是一種在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無機(jī)磷酸的水解酶，其廣泛分布于機(jī)體中，主要參與細(xì)胞的胞飲作用和細(xì)胞內(nèi)的消化過程[5]。研究表明，魚類消化道上皮細(xì)胞可通過胞飲作用直接消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)[6]。本研究顯示，在黃顙魚胃賁門、胃幽門和中腸ACP酶活力相對較高，食道和胃體酶活力較弱。與烏鱧(Ophiocephalus argus)[4]消化道ACP在中腸酶活力相對較高，食道酶活力較弱有一定的相似性；與鱖魚(Siniperca chautsi)[7]消化道ACP在前腸酶活力較高，胃體酶活力相對較弱有所不同；與歐洲無須鱈 (Meluccius meluccius)[8]消化道ACP在食道、胃和腸道中都檢測到很強(qiáng)的酶活力則明顯不同?？梢?，ACP在魚類消化道各部位的分布存在一定的物種及組織特異性。本研究表明黃顙魚中腸是吸收蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)消化的主要部位。有研究顯示，ACP在細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的代謝及細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換過程中亦發(fā)揮重要作用[9]，故黃顙魚胃賁門胃腺中有較高的ACP酶活力可能與其參與胃粘液和胃酸的分泌活動有關(guān)。

ALP是一種能夠在堿性條件下將底物去磷酸化的非特異性磷酸水解酶，主要參與細(xì)胞膜的主動運(yùn)輸過程，在消化道中參與脂質(zhì)、葡萄糖和鈣離子等重要營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[10]，因此，常被看作是消化道吸收營養(yǎng)物質(zhì)的一種標(biāo)志性酶[11]。本研究顯示，黃顙魚食道、前腸和后腸ALP酶活力較高，而胃賁門、胃體和胃幽門酶活力相對較弱。與鱖魚[7]消化道 ALP 在食道和前腸酶活力相對較高，胃賁門酶活力較弱有一定的相似性；與烏鱧[4]消化道ALP在腸道酶活力相對較高，胃賁門、胃體和胃幽門酶活力較弱相一致；與歐洲無須鱈[8]消化道 ALP在腸道酶活力相對較高，胃酶活力較弱亦相似。本研究表明黃顙魚前腸和后腸是脂類、葡萄糖、鈣和無機(jī)磷酸鹽等重要營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位。黃顙魚前腸和后腸中ALP主要定位于黏膜上皮細(xì)胞的紋狀緣，與其參與吸收營養(yǎng)物質(zhì)的功能相適應(yīng)。

ATPase 是一類能將ATP催化水解為ADP和磷酸根離子的水解酶，其普遍存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜上，主要通過水解ATP為物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量，參與腸道上皮細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收過程[12,13]。本研究顯示，黃顙魚食道、胃和前腸ATPase酶活力較高，中腸酶活力相對較弱。與鱖魚[7]消化道ATPase在食道酶活力相對較高，中腸酶活力較弱相一致；與烏鱧[4]消化道ATPase在胃中酶活力相對較高亦較相似。黃顙魚食道ATPase酶活力較高可能與其捕食小魚、小蝦，以肉食性為主的食性有關(guān)，較高的ATPase酶活力有利于肌肉收縮和吞咽的進(jìn)行。黃顙魚胃中ATPase酶活力主要定位于胃腺，這種特異性的分布與胃酸和胃蛋白酶的分泌活動需要充足的能量有關(guān)；腸道中ATPase 主要定位于粘膜上皮細(xì)胞紋狀緣，這與小腸參與營養(yǎng)物質(zhì)吸收的功能相一致。

NSE是一種非特異性水解酯酶，在動物消化道中參與對酯類物質(zhì)的消化與吸收[14]。魚類的主要能量來源不是碳水化合物和蛋白質(zhì)，而是脂類[8]。本研究顯示，黃顙魚胃幽門NSE酶活力相對較高，后腸酶活力較弱。與鱖魚[7]消化道NSE在后腸和胃幽門酶活力相對較高存在差異；與尼羅羅非魚(Oreoehromis niloticus)[10]消化道NSE均勻分布于整個腸道(除腸道末端外）不同；與大鱗紅娘魚(Lepidotrigla cavillone)[6]消化道NSE在后腸酶活力相對較高亦明顯不同?？梢姡琋SE在魚類消化道各部位的分布存在明顯的物種及組織特異性。本研究表明黃顙魚胃幽門是酯酶分泌和脂質(zhì)消化的主要部位。

POX是一種氧化還原酶，廣泛存在于微生物、動植物體內(nèi)，具有消除細(xì)胞內(nèi)有毒代謝產(chǎn)物如過氧化氫、酚類、醛類、胺類等的功能[15,16]。此外，該酶還參與脂類代謝過程[17]。本研究顯示，在黃顙魚胃幽門中POX酶活力相對較高，后腸酶活力較弱。與烏鱧[4]消化道POX在胃體酶活力相對較高，胃幽門酶活力較弱明顯不同；與胡子鯰（Clarias fuscus）[18]消化道POX在后腸和胃體酶活力都相對較高亦不相同；與鱖魚[7]消化道POX在胃幽門酶活力相對較高相似，但與鱖魚不同的是黃顙魚食道中POX酶活力亦較高。POX在黃顙魚胃幽門酶活力較高，可能與該部位代謝活動旺盛會產(chǎn)生較多代謝毒性物質(zhì)有關(guān)。黃顙魚POX 和NSE均以胃幽門中酶活力最高，這可能與POX亦參與脂質(zhì)的代謝過程有關(guān)。

SDH屬于細(xì)胞色素氧化酶類，是三羧酸(TCA)循環(huán)中唯一一個整合于膜上的多亞基酶，SDH的活性對TCA循環(huán)的速率有決定性作用[19]。本研究顯示，在黃顙魚胃體、胃賁門和前腸中SDH酶活力相對較高，中腸和后腸酶活力較弱。與烏鱧[4]消化道SDH在胃體和胃賁門酶活力較高相一致；與鱖魚[7]消化道SDH在胃賁門酶活力相對較高亦相似。黃顙魚胃中SDH酶活力主要定位于胃腺部，和胃中ATPase的組織定位相一致，兩者均可為胃腺的分泌活動提供充足的能量。黃顙魚前腸粘膜上皮細(xì)胞頂部亦有較多的SDH分布，這與上皮細(xì)胞通過主動運(yùn)輸吸收營養(yǎng)物質(zhì)需要消耗較多能量相適應(yīng)。

總之，黃顙魚消化道黏膜 6 種重要酶的分布和其他魚類既有相似性也有其物種特異性。黃顙魚消化道6種重要酶的分布及其組織定位與消化道各部位執(zhí)行的生理功能相適應(yīng)，中腸是其吸收蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)消化的主要部位；前腸和后腸是吸收脂類、葡萄糖、鈣和無機(jī)磷酸鹽等重要營養(yǎng)物質(zhì)的主要部位；胃幽門是脂質(zhì)消化的主要部位。