劉昭詩，賴人旭*，任江南，麥蕾，高敏照

(1中山大學附屬第五醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心，珠海 519000; 2中山大學附屬第五醫(yī)院消化內(nèi)科，珠海 519000)

結直腸癌在全球惡性腫瘤中發(fā)病率位居第三，死亡率位居第五[1]。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和生活方式的改變，我國結直腸癌的發(fā)病率及病死率均上升至惡性腫瘤的前五位[2]。小泛素相關修飾物（small ubiquitin-like modi fier，SUMO）修飾作為蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種，遍及體內(nèi)細胞代謝的眾多過程[3],在細胞離子通道和信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控、細胞遷移和凋亡中，SUMO發(fā)揮著重要的作用[4]。SAE2是SUMO化激活酶E1的亞基之一[5]，其異常表達可導致SUMO化途徑的失調(diào)。研究表明，SAE2的表達水平與多種腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲有著密切的關系，但有關其與結腸癌關系的研究較少。本文回顧性分析了93例結腸癌組織及相對應的71例癌旁正常組織中SAE2的表達情況，并進一步探討其與結腸癌患者臨床病理特征及預后之間的關系。

材料與方法

1 研究對象

收集2010年1月至2014年12月在中山大學附屬第五醫(yī)院就診并接受手術治療的164例結腸病理組織（其中結腸癌組織標本93例，相對應的癌旁正常組織標本71例，22例結腸癌病例無癌旁組織），所有結腸癌組織經(jīng)病理證實為R0切除（即手術切緣鏡下觀察陰性）。納入標準包括手術切除的腫瘤病灶、經(jīng)手術病理證實為原發(fā)性結腸癌、具有完整臨床資料、無術前放療和化療等治療。排除標準包括原位癌（高級別上皮內(nèi)瘤變）、直腸及盲腸和肛管惡性腫瘤、結腸轉(zhuǎn)移性癌、同時存在其他部位原發(fā)惡性腫瘤、遺傳性非息肉病性結腸癌。

2 病例臨床特征

結腸癌患者醫(yī)療記錄內(nèi)容包括：社會人口學特征如年齡、性別等；臨床病理資料如腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型、分化程度、腸壁浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移情況、遠處轉(zhuǎn)移情況、術后有無放化療等。腫瘤病理分期標準：采取美國癌癥聯(lián)合委員會或國際聯(lián)合抗癌委員會（UICC/AJCC）的結腸癌（第七版）TNM分期系統(tǒng)進行結腸癌病理分期。解剖分布根據(jù)國際標準的第三版腫瘤分類法分為3組：右半結腸（包括升結腸、結腸肝曲、橫結腸）組、左半結腸（包括結腸脾曲、降結腸、乙狀結腸）組、其他（跨越多個腸段等）組。

3 免疫組織化學染色

采用免疫組織化學PV-6000二步法檢測SAE2的表達，所使用的第一抗體為兔抗人SAE2多克隆抗體（1:100；Abcam公司，ab58451），以PBS溶液代替一抗作為陰性對照，以抗體說明書指示的肺腺癌組織（SAE2表達陽性）作為陽性對照。實驗結果以細胞核或細胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色的強度和面積作為SAE2蛋白表達程度的判斷標準分為4級：無染色或染色面積＜10%為SAE2（0）；染色模糊且可見染色面積大于10%為SAE2（1+）；中等染色面積大于10%為SAE2（2+）；強染色面積大于10%為SAE2（3+）（由兩名病理醫(yī)生雙盲法10倍物鏡下隨機觀察10個視野；SAE2 0～1+為表達陰性表達，SAE2 2+～3+為表達陽性表達）。

4 隨訪記錄

隨訪資料記錄內(nèi)容：隨訪起始時間為手術治療日期；隨訪截止日期為2018年2月28日；終點事件是患者的主要死因為結腸癌轉(zhuǎn)移、復發(fā)或結腸癌相關并發(fā)癥；完全數(shù)據(jù)是指隨訪起始至終點事件出現(xiàn)；生存時間均以月為單位記錄。計算病人1年、3年和5年生存率，如果病人生存時間超過1年，則將截斷時間定義為1年；若病人因非腫瘤因素導致死亡或中途失訪，生存時間即為截斷時間；如果病人生存時間短于1年，則為發(fā)生終點事件。3年和5年生存率以此類推。

5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，SAE2的組間表達的差異比較應用分類變量的χ2檢驗；臨床病理因素應用Kaplan-Meier單因素生存分析、Log-Rank法檢驗；應用 Cox 回歸比例風險模型篩選影響結腸癌患者生存預后的獨立危險因素。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側檢驗，檢驗水準為α=0.05，P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 SAE2在結腸癌組織中高表達

SAE2在93例結腸癌標本中34例為陽性表達，59例為陰性表達，陽性表達率為36.6%（34/93）；在71例癌旁正常結腸標本中2例為陽性表達，69例為陰性表達，陽性表達率為2.8%（2/71）。將結腸癌組織與癌旁正常組織鏡下觀察結果對比顯示：SAE2表達水平在結腸癌組織標本中較癌旁正常組織標本高，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=26.756，P＜0.001）（圖 1和表1）。

2 SAE2表達水平與結腸癌臨床病理因素相關

SAE2陽性表達率在不同性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、分化程度、病理類型中，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。不同Dukes分期中，C+D期者SAE2陽性表達率為53.5%，A+B期者為22.0%，其差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=12.956，P＜0.001）。不同TNM分期中，SAE2陽性表達率在I期、II期、III期、IV期分別為0%、29.4%、32.4%、38.2%，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=11.480，P＜0.05）。SAE2陽性表達率在有淋巴結轉(zhuǎn)移者為51.4%，無淋巴結轉(zhuǎn)移者為27.6%，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=5.350，P＜0.05）。SAE2陽性表達率在有發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移者為68.4%，無遠處轉(zhuǎn)移者為28.4%，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=10.452，P＜0.001）（表2）。

圖1 SAE2在結腸/結腸癌組織中的表達。A，陰性對照組；B，陽性對照組；C，SAE2(0)；D，SAE(1+)；E，SAE(2+)；F，SAE(3+)；比例尺，20μmFig.1 Expression of SAE2 in normal colon/colon cancer tissue. A, negative control；B, positive control；C, SAE2(0)；D, SAE(1+)；E, SAE(2+)；F,SAE(3+); scale bar, 20μm

表1 SAE2在結腸癌和癌旁正常組織的表達Tab. 1 The expression of SAE2 in colon cancer and adjacent normal tissues

表2 SAE2與結腸癌臨床病理因素的關系Tab. 2 Relationship between SAE2 and clinicopathological factors of colon cancer

3 SAE2表達水平與結腸癌患者預后相關

進行隨訪的93例結腸癌患者中，最短隨訪時間為0個月，最長隨訪時間為95個月，中位隨訪時間為41.0個月，平均隨訪時間為40.73個月，中位生存時間為26.00個月。直至2018年2月28日隨訪停止時，有65個受訪者仍然存活。生存期超過5年的有24例，占患者總數(shù)的25.8%。有29例發(fā)生死亡，其中有28例死于結腸癌所致的復發(fā)或轉(zhuǎn)移、并發(fā)癥等，另有1例為因其他疾病死亡。有6名受訪者在發(fā)生了復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移后，直到隨訪截止時仍然存活。

低年齡組1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為98%、86%、76%，而高年齡組1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為80%、54%、52%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Dukes分期為A+B期者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為98%、93%、90%，C+D期者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為81%、45%、32%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。TNM分期為I期者5年生存率達100%，II期、III期、IV期者1年生存率分別為100%、94%、67%，3年生存率85%、69%、26%，5年生存率71%、69%、7%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。腫瘤浸潤深度為T1+T2期、T3期、T4期1年生存率分別為100%、96%、76%，2年生存率分別為80%、82%、49%，5年生存率分別為80%、76%、35%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。無淋巴結轉(zhuǎn)移組患者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為98%、86%、80%，有淋巴結轉(zhuǎn)移組患者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為77%、48%、36%，較無淋巴結轉(zhuǎn)移組的生存率下降，以5年生存率下降最為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。無遠處轉(zhuǎn)移患者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為90%、83%、68%，而有遠處轉(zhuǎn)移組患者生存率明顯下降，其1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為30%、10%、10%，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。SAE2表達陰性者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為96%、86%、80%， SAE2表達陽性者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為81%、50%、41%，5年生存率降低更為明顯，其差異具有統(tǒng)計學差異（P＜0.001）（表3和圖2）

4 SAE2是結腸癌患者生存時間的獨立影響因素

將單因素分析所得具有統(tǒng)計學意義的因素納入Cox多元回歸模型表4所示，不同Dukes分期、不同浸潤深度、有無淋巴結轉(zhuǎn)移和有無遠處轉(zhuǎn)移對生存時間影響的差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。SAE2表達陽性者較陰性者死亡風險升高（P＜0.05）。高年齡組較低年齡組死亡風險升高（P＜0.05）。高TNM分期者較低TNM分期者死亡風險升高（P＜0.05）（表4）。

表3結腸癌患者預后的單因素分析Tab.3 Univariate analysis of prognosis in patients with colon cancer

討 論

研究表明，SAE2的表達水平與多種腫瘤細胞如骨肉瘤細胞、乳腺癌、肝癌細胞、膽管癌、肺癌等的增殖、遷移和侵襲有著密切的關系[6-11]，且SAE2的表達水平與腫瘤的TNM分期和腫瘤分化程度相關[12]，同時與患者的生存預后成一定相關性，但與結腸癌關系尚不十分明確。本實驗應用免疫組化法對164例結腸組織標本中SAE2的表達水平進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)93例結腸癌標本中陽性表達率達到36.6%（34/93），而在71例對應的癌旁正常標本中陽性表達率僅為2.8%（2/71），結腸癌組織中SAE2的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織。實驗結果表明SAE2在結腸癌組織中高表達，提示著SAE2可能是結腸上皮細胞發(fā)生惡變的重要環(huán)節(jié)，有望成為結腸癌診斷和治療的靶標。

圖2 結腸癌患者生存狀況的Kaplan-Meier單因素分析Fig. 2 Kaplan-Meier univariate analysis of survival status of colon cancer patients

表4 影響患者預后的Cox多元回歸分析Table 4 Cox multivariate regression analysis of prognosis in patients

在Shao[13]的研究中，SAE2的表達與腫瘤浸潤的深度、是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移、患者的TNM分期有著明顯的相關性，胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移潛力在敲除SAE2降低其表達后得到減弱。而在Liu[11]課題組中，實驗表明降低SAE2的表達后，不僅可以延緩肺癌細胞的生長、增加其凋亡的發(fā)生，還可降低腫瘤的遷移能力和侵襲性。Cheng[14]和Ji[15]的研究結果顯示，SAE2可能通過Wnt/β-catenin信號通路影響結直腸癌或胃癌腫瘤細胞的侵襲性和遷移。以上結果均表明SAE2與腫瘤的發(fā)生和侵襲性密切相關，但目前國內(nèi)外對SAE2與結腸癌發(fā)生、發(fā)展的關系研究較少且不深入。在本研究中，93例隨訪對象被按年齡、性別、Dukes分期、TNM分期、腫瘤部位及大小、浸潤深度、分化程度、病理類型等分為不同亞組。通過統(tǒng)計學方法對不同亞組中結腸癌患者臨床病理資料以及SAE2的表達水平進行分析后結果顯示：SAE2在結腸癌組織中的表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、分化程度、病理類型無關，與患者的Dukes分期、TNM分期、是否發(fā)生淋巴結或遠處轉(zhuǎn)移有關。患者的Dukes分期越晚，SAE2陽性表達率越高，C+D期的患者SAE2陽性表達率高于A+B期。同時，隨著TNM分期增加SAE2陽性表達率也在增加，I期、II期、III期、IV期患者的SAE2陽性表達率呈現(xiàn)遞增趨勢（I期為0%、II期為29.4%、III期為32.4%、IV期為38.2%），IV期的陽性表達率最高，顯著高于陽性率為0%的I期患者。SAE2的陽性表達率在有淋巴結轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移的患者中顯著高于無淋巴結或遠處轉(zhuǎn)移的患者。在腫瘤浸潤深度上，SAE2的陽性表達率隨著浸潤深度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，T1+T2中SAE2陽性率為16.7%，T3中SAE2陽性率為33.9%，T4中SAE2陽性率為48.0%，但各組間差異無統(tǒng)計學意義，考慮與所收集的組織標本主要集中在T3分期導致的組間分布不均對結果造成了一定的偏倚有關。SAE2與腫瘤的臨床分期以及轉(zhuǎn)移情況密切相關，提示SAE2的高表達可能在結腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲過程起著促進的作用，其異常不僅提示著腫瘤的存在，同時還可能反映腫瘤發(fā)展、浸潤的程度，其可以預測結腸癌的轉(zhuǎn)移情況，與前述研究發(fā)現(xiàn)具有一致性。

在本研究單因素分析中，患者的生存時間與年齡、Dukes分期、TNM分期、腫瘤浸潤深度、有無淋巴結核轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移以及SAE2在結腸癌中的表達水平有關，與分化程度、病理類型、術后有無放化療等無關。通過建立Cox多元回歸模型分析得知年齡、TNM分期以及SAE2在腫瘤組織的表達水平是影響患者生存預后的獨立危險因素。SAE2是結腸癌患者生存時間的獨立影響因素，且其表達與腫瘤Dukes分期、TNM分期浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移相關，預示其在評估結腸癌的轉(zhuǎn)移情況、判斷預后存在潛在價值，可作為判斷結腸癌進展情況以及生存預后的一個重要標志物。

本研究屬于回顧性研究，結腸癌患者部分資料，如患者其他感染情況、手術方式和治療記錄等情況登記不完整，故未對其與結腸癌患者總體生存期進行統(tǒng)計分析。另外，部分結腸癌患者的失訪也造成了一定的信息偏倚。

綜上所述，SAE2與結腸癌的發(fā)生、侵襲性以及預后密切相關，在結腸癌患者的診治中結合TNM分期加入SAE2的檢測，或許可使結腸癌診治更具有客觀性和個體化。