陶 婭，殷邵杰，劉明江，李金貴

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一種可以影響人、犬、貓等物種的特異性、慢性、復(fù)發(fā)性的腸道疾病，多數(shù)累及回腸、直腸、結(jié)腸，常以腸黏膜固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為特點(diǎn)。IBD的發(fā)病原因目前認(rèn)為與環(huán)境、免疫失常、遺傳以及腸道菌群改變有關(guān)，也有研究認(rèn)為IBD是一種自身免疫性疾病[1]。越來(lái)越多的研究表明，遺傳易感性是IBD的主要決定因素，免疫調(diào)節(jié)紊亂是直接發(fā)病的表征，而腸道菌群失衡以及環(huán)境等因素則是誘因[2]。

1 犬IBD的主要特征

IBD通常包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn’s diseases,CD)，近年來(lái)炎性結(jié)直腸息肉(Inflammatory colorectal polyps,ICPS)也被認(rèn)為是犬特發(fā)性IBD的一種新形式。UC病變多發(fā)于乙狀結(jié)腸和直腸，可延伸至整個(gè)結(jié)腸，病灶局限于大腸黏膜及黏膜下層。病程漫長(zhǎng)，常反復(fù)發(fā)作。臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便等。CD在胃腸道的任何部位均可發(fā)生，但常發(fā)生于末端回腸和上行結(jié)腸。臨床主要表現(xiàn)為腹部疼痛、大便次數(shù)增多、肛周病變、腸狹窄等。ICPS以結(jié)直腸部位出現(xiàn)多發(fā)或者單發(fā)息肉并伴隨中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征。該病發(fā)生于犬，具有種特異性，近年來(lái)被認(rèn)為是引起犬大腸腹瀉的一個(gè)主要原因[3]。

2 IBD的病理機(jī)制

目前IBD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但大量研究表明，該病與免疫、遺傳、環(huán)境以及腸道菌群失衡有關(guān)。外界環(huán)境衛(wèi)生和刺激物的刺激，會(huì)導(dǎo)致犬腸道菌群多樣性降低或失調(diào)，從而引起IBD的發(fā)生。研究表明，遺傳因素是IBD發(fā)生的重要影響因素。IBD與多種基因有關(guān)，具有一定的遺傳性[4]。在外界環(huán)境和遺傳等多個(gè)因素的相互作用下，腸道菌群發(fā)生改變，腸黏膜對(duì)于腸道菌群的失調(diào)作出異常的免疫應(yīng)答。這種異常的免疫應(yīng)答導(dǎo)致大量的炎性細(xì)胞及介質(zhì)產(chǎn)生，所產(chǎn)生的炎性細(xì)胞進(jìn)一步對(duì)腸道屏障造成損害從而引起腸道的慢性炎癥和組織損傷。

3 IBD與腸道菌群的關(guān)系

腸道菌群在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，由于機(jī)體的適應(yīng)力和自然選擇，菌群與宿主、環(huán)境之間始終都處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，形成一個(gè)相互依存、相互制約的微生態(tài)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與犬IBD的發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)非常緊密。雖然迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)某種特定細(xì)菌與IBD的發(fā)病直接相關(guān)，也沒(méi)有確定IBD特征性的菌群變化，但已明確IBD患犬糞便菌群的組成與健康犬存在一定的差異，而且IBD病變?cè)絿?yán)重，患犬糞便中乳酸桿菌的比率下降越多[6]。

IBD通常以門栓菌和擬桿菌菌群減少，而變形桿菌菌群增加為特征。此外，梭菌中毛螺菌科和球狀梭菌亞組(即XIVa和IV簇)的多樣性減少也與IBD相關(guān)[7]。已有研究證明，梭菌中XIVa和IV簇具有促進(jìn)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)發(fā)育的功能。腸道免疫穩(wěn)態(tài)的維持和針對(duì)微生物抗原免疫反應(yīng)的控制涉及多層次調(diào)控，其中CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞發(fā)揮著重要的抗炎作用，Treg細(xì)胞連續(xù)高表達(dá)調(diào)節(jié)其發(fā)育和活性的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3+。因此腸道梭菌中XIVa和IV簇的減少會(huì)降低腸道的免疫狀態(tài)，從而引起慢性腸道疾病。

4 IBD標(biāo)志物

目前對(duì)于IBD的評(píng)估主要是基于臨床癥狀和疾病活動(dòng)評(píng)分，但這種評(píng)估具有明顯的局限性。在有些病例中，盡管患犬臨床癥狀有所緩解，但仍存在明顯的組織病理學(xué)炎癥。因此，尋找能夠評(píng)估臨床變化并預(yù)測(cè)IBD患犬臨床過(guò)程的生物標(biāo)志物已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

4.1 巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子 現(xiàn)已知腸巨噬細(xì)胞在維持腸道平衡中發(fā)揮了重要作用，但也促成了IBD的發(fā)生。巨噬細(xì)胞可分為2種類型：M1和M2巨噬細(xì)胞。M1巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)；M2巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用[1]。與其他組織中的常駐巨噬細(xì)胞相反，Toll樣受體對(duì)于腸巨噬細(xì)胞最初炎癥反應(yīng)活化產(chǎn)生的刺激沒(méi)有反應(yīng)。這需要通過(guò)下調(diào)下游信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)獲得這種無(wú)反應(yīng)狀態(tài)，并保護(hù)宿主免受炎癥危害[8]。運(yùn)用針對(duì)巨噬細(xì)胞相關(guān)的多克隆抗體(分化抗原簇、CD64、CD163、CD204、離子化鈣結(jié)合速配分子1和主要組織相容性復(fù)合體II)進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非IBD患犬胃腸道內(nèi)以表達(dá)CD163和CD204的M2巨噬細(xì)胞在犬小腸絨毛區(qū)域占優(yōu)勢(shì)；而IBD患犬該區(qū)域M2巨噬細(xì)胞數(shù)量下降，只有表達(dá)CD64+的巨噬細(xì)胞數(shù)量有輕微增加。研究證明，M2巨噬細(xì)胞在維持犬胃腸道穩(wěn)態(tài)和動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用[9]。

4.2 凋亡蛋白 T淋巴細(xì)胞對(duì)凋亡的抗性會(huì)使活化的腸道T淋巴細(xì)胞持續(xù)存在，從而產(chǎn)生過(guò)量的促炎介質(zhì)并導(dǎo)致異常免疫應(yīng)答，過(guò)量的促炎介質(zhì)會(huì)引起組織破壞和腸上皮屏障功能受損，最終加劇腸黏膜炎癥和臨床癥狀[10]。雖然細(xì)胞凋亡由多種細(xì)胞信號(hào)控制，但其通過(guò)促凋亡和抗凋亡相關(guān)蛋白的平衡而緊密調(diào)節(jié)。通過(guò)免疫組織化學(xué)和TUNEL分析IBD患犬十二指腸、回腸和結(jié)腸固有層中的半胱天冬酶3(Caspase-3)和B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康犬相比，IBD患犬結(jié)腸黏膜中Caspase-3的表達(dá)顯著減少；IBD患犬十二指腸黏膜絨毛頂端和基底部Bcl-2的表達(dá)顯著增多，而回腸絨毛頂部Bcl-2表達(dá)顯著減少。IBD患犬小腸內(nèi)T淋巴細(xì)胞在不同區(qū)域的凋亡情況不同，腸黏膜中Bcl-2/Caspase-3的比值增加促進(jìn)了小腸T淋巴細(xì)胞對(duì)抗凋亡而持續(xù)存在，從而引起T淋巴細(xì)胞累積并產(chǎn)生慢性腸道炎癥[11]。

4.3 嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)介質(zhì) 嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophil)是多功能粒細(xì)胞，活化后能釋放細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞毒性顆粒蛋白(脫顆粒)等多種介質(zhì)，在調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在炎癥期間，活化嗜酸性粒細(xì)胞釋放的細(xì)胞毒性顆粒蛋白如嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白、嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶(Epx)和堿性蛋白質(zhì)可導(dǎo)致組織損傷和功能障礙。使用Epx單抗檢測(cè)IBD患犬，可發(fā)現(xiàn)患犬黏膜固有層下部區(qū)域脫顆粒嗜酸性細(xì)胞數(shù)顯著增加，而未活化的嗜酸性粒細(xì)胞無(wú)明顯差異；患犬黏膜固有層上部區(qū)域內(nèi)的活化和未活化嗜酸性粒細(xì)胞均顯著增加。治療犬和正常犬腸黏膜固有層內(nèi)活化的和未活化的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異[12]。Epx為腸道活檢組織標(biāo)本嗜酸性粒細(xì)胞的定量和選擇性評(píng)價(jià)提供了一種可靠的策略。

4.4 鈣粒蛋白 鈣粒蛋白主要是由活化的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞來(lái)表達(dá)與分泌的。S100A12即鈣粒蛋白C，屬于S100/鈣粒蛋白亞族[13]。S100A12釋放進(jìn)入細(xì)胞間隙后，作為晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)受體的配體，兩者結(jié)合后可誘導(dǎo)持續(xù)的受體后信號(hào)通路，包括核因子-κB(NF-κB)的激活，跨膜AGEs的上調(diào)，導(dǎo)致炎性反應(yīng)的擴(kuò)大和持續(xù)。S100A12是人IBD的一個(gè)生物標(biāo)志物，與正常人相比，IBD患者糞便、血清和腸黏膜內(nèi)S100A12濃度增加[14]。鈣粒蛋白的濃度隨著標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)治療而發(fā)生改變，測(cè)量患犬糞便和血清中的鈣粒蛋白可以有效的評(píng)估腸道炎癥。

5 治療方法

近年來(lái)，盡管在犬IBD診斷方面取得了一定的進(jìn)展，但對(duì)于該病尚未形成較好的治療方案。IBD仍是一個(gè)難以治愈的疾病，現(xiàn)行的治療方案主要在于最大程度地降低嘔吐和腹瀉的發(fā)作頻率，減輕患犬的臨床癥狀。目前，對(duì)于人和犬的IBD患者通常采取抗炎治療，其中以皮質(zhì)類固醇類藥物為代表。但使用類固醇藥物治療的IBD患犬中有很大一部分產(chǎn)生了耐藥性和明顯的副作用，因此急需一種新的IBD治療方法。

5.1 脂肪干細(xì)胞(ADSCs)療法 使用脂肪來(lái)源的干細(xì)胞(ADSCs)的細(xì)胞療法已被用于治療人和狗的IBD。在內(nèi)窺鏡和組織學(xué)檢查中，能明顯觀察到使用ADSCs治療的IBD患犬癥狀得到改善[15]。給C57BL/6小鼠口服7 d的葡聚糖硫酸鈉制備結(jié)腸炎小鼠模型，然后連續(xù)7 d向小鼠施用僅包含犬ADSC或犬ADSC CellSaic，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADSC CellSaic組的體重和結(jié)腸長(zhǎng)度得以恢復(fù)。組織學(xué)分析顯示，ADSC CellSaic治療減少了炎性細(xì)胞的數(shù)量并修復(fù)了潰瘍。在體外試驗(yàn)中，未觀察到犬ADSC CellSaic的致腫瘤性和一般毒性，這表明犬ADSC CellSaic對(duì)犬結(jié)腸炎具有治療效果[16]。

5.2 絲氨酸蛋白酶 腸道通透性增加，屏障功能障礙是IBD的另一個(gè)特征[17]。腸上皮細(xì)胞(IEC)形成針對(duì)細(xì)菌、毒素和抗原的物理屏障來(lái)防止黏膜炎癥和組織損傷。腸屏障由IEC連接而成，其連接方式包括緊密連接(TJ)、粘附連接(AJs)和橋粒。對(duì)于如何修飾緊密連接來(lái)維持屏障功能的理解可為該病的治療提供方法。研究表明，添加絲氨酸蛋白酶會(huì)引起IEC頂端產(chǎn)生一個(gè)快速且持續(xù)升高的細(xì)胞間跨膜電阻，但機(jī)制不明。在犬IEC內(nèi)，基質(zhì)酶即內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶能增加細(xì)胞間跨膜電阻。通過(guò)siRNA技術(shù)敲除細(xì)胞的咬合蛋白基因可阻止絲氨酸蛋白酶誘導(dǎo)的細(xì)胞間跨膜電阻的增加。利用光漂白熒光恢復(fù)試驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶在細(xì)胞膜上使咬合蛋白顯著增加。腸上皮頂端暴露的絲氨酸蛋白酶或基質(zhì)酶可通過(guò)增加咬合蛋白來(lái)提高屏障功能[18]，從而降低黏膜炎癥和組織損傷。

5.3 糖皮質(zhì)激素 鑒于IBD發(fā)病機(jī)制的假設(shè)，其治療有2個(gè)主要目標(biāo)：減少宿主的炎癥反應(yīng)并最小化抗原暴露。為實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，治療方案包括免疫抑制藥物，特定飲食和抗生素，然而并非每個(gè)IBD患者都需要這種方案。一般僅在中度或重度病例中使用硫唑嘌呤、環(huán)孢霉素等免疫抑制藥物。硫唑嘌呤能夠抑制T淋巴細(xì)胞的激活和RNA的合成。但硫唑嘌呤等藥物引起的不良反應(yīng)率高達(dá)20%，主要包括過(guò)敏反應(yīng)、白細(xì)胞減少癥等不良反應(yīng)。在病情輕微的病例中，限制性飲食足以給予體征緩解。當(dāng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重的時(shí)候，給以波尼松等糖皮質(zhì)激素并輔助蛋白膳食可以更好地改善臨床癥狀[19]。

6 展望

IBD是一種難治性慢性疾病，其確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，病程漫長(zhǎng)常給患病動(dòng)物帶來(lái)極大的痛苦，但目前還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出有效的IBD診斷和治療方法。針對(duì)IBD患犬腸道菌群和標(biāo)志物的深入研究有助于對(duì)發(fā)病機(jī)制的理解，也有望成為IBD的診療手段。