尚信池，尹玉偉，程 義，王 楠，劉 佳，張一琳，李月紅

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130118)

鯉春病毒血癥病毒(Spring viremia of carp virus，SVCV)屬于彈狀病毒科[1]，其基因組由負(fù)義單鏈RNA組成，長度約為11 kb，并含有N，P，M，G，L五個(gè)基因。這5個(gè)基因分別編碼核蛋白N、糖蛋白G、磷蛋白P、基質(zhì)蛋白M和RNA聚合酶L。SVCV是幾種經(jīng)濟(jì)上重要鯉科魚類高致病性病原體，是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)必須申報(bào)的病原微生物，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病毒引起鯉春病毒血癥病(SVC)主要在歐洲養(yǎng)殖的鯉魚中流行，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，病魚臨床癥狀主要表現(xiàn)為體內(nèi)出血，神經(jīng)紊亂，腹腔炎癥和腹內(nèi)積水。水溫是影響該病暴發(fā)的重要因素，春季水溫在11～17 ℃時(shí)受感染魚類死亡率最高。目前尚沒有開發(fā)出針對該病毒的有效疫苗和藥物，控制該疾病的方法主要依賴于及時(shí)診斷和撲殺[2]。本文從SVCV的生物學(xué)特性、致病機(jī)制、檢測、我國流行情況及防治，對目前SVCV研究的現(xiàn)階段進(jìn)展情況作一綜述。

1 SVCV生物學(xué)特性

SVCV是鯉科魚類重要的傳染病，首次在歐洲發(fā)現(xiàn)，之后相繼在亞洲和南美洲發(fā)現(xiàn)[3]。根據(jù)SVCV核苷酸序列差異，分為Ia、Ib、Ic和Id四個(gè)基因型，其中Ia和Id在南美洲和歐洲廣泛流行。Ib和Ic在1980年被發(fā)現(xiàn)[4]。由于SVCV對鯉科魚類的危害性，目前中國加強(qiáng)了對SVCV的檢疫，同時(shí)發(fā)現(xiàn)中國的SVCV為亞洲的分支，然而近期在上海地區(qū)分離的SVCV相對于其他株表現(xiàn)出較低的致病性[5]。從2016年上海地區(qū)某發(fā)病草魚身上分離出來的SVCV，通過進(jìn)化樹分析與2015年上海另一分離株有較為相似的分支，同時(shí)與亞洲株的特性不同。細(xì)胞感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，在25 ℃和28 ℃時(shí)病毒具有較強(qiáng)的感染性。體內(nèi)試驗(yàn)證明，SVCV分離株能夠引起試驗(yàn)動物典型臨床癥狀，在16～20 ℃對草魚和鯉魚具有100%的致死率，對金魚和錦鯉的致死率分別為100%和95%[5-6]。自2002年北卡羅來納州的一個(gè)錦鯉養(yǎng)殖場首次暴發(fā)SVCV后，美國和加拿大至少有8次關(guān)于SVCV的不同報(bào)道，這種外來的病毒被認(rèn)為對北美本土養(yǎng)殖魚類具有潛在威脅，此項(xiàng)研究表明，宿主年齡是感染病毒和決定疾病結(jié)果的關(guān)鍵因素，其他因素，例如水溫、病毒株、物種內(nèi)在的易感性和飼養(yǎng)條件也可能影響感染動態(tài)[7]。

2 SVCV致病機(jī)制

近些年，研究越來越深入，Wang等(2017年)以斑馬魚為研究對象，通過控制穩(wěn)定的水溫，將SVCV感染斑馬魚，在感染后魚體的腦和脾臟中檢測到較高濃度的SVCV，此外他們在對腦和脾的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在腦中主要影響因素與甲型流感和單純皰疹感染通路有關(guān)，脾中主要與結(jié)核病和弓形體病通路有關(guān)；同時(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)還顯示，脾臟中的可變剪接情況增加，從而影響到病毒感染的過程[8-10]。Liu等(2013年)用雙向電泳以及質(zhì)譜分析儀研究SVCV對鯉魚上皮細(xì)胞(EPC)的影響，感染SVCV前后EPC共有54個(gè)差異蛋白，主要集中在細(xì)胞骨架、大分子合成蛋白、應(yīng)激壓力蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白分支中[11]。Hu等(2018年)同樣以斑馬魚為研究對象，對SVCV感染后機(jī)制做了深入研究，發(fā)現(xiàn)TBK1能夠抑制IFN-1的釋放從而促進(jìn)病毒感染過程，其主要機(jī)制是，TBK1的不同亞基能夠競爭性結(jié)合干擾素調(diào)節(jié)因子3(IFR3)并抑制IRF3的磷酸化，以此抑制IFN-1的釋放，促進(jìn)病毒的感染過程[12]。Zhao等(2018年)研究發(fā)現(xiàn)，在SVCV感染細(xì)胞(EPC細(xì)胞和胖頭鯉細(xì)胞)后能夠造成氧化損傷，其氧化損傷也是SVCV感染后重要的損傷機(jī)制，通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在SVCV感染后，線粒體的損傷是氧化損傷主要產(chǎn)生的部位，線粒體的損傷導(dǎo)致活性氧(ROS)的積累，造成細(xì)胞的損傷加劇，進(jìn)一步促進(jìn)病毒的感染[13]。Wang等(2017年)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的與泛素化有關(guān)的蛋白家族-TRIM，它在抗病毒活性中起到重要作用，研究中發(fā)現(xiàn),克隆出的鯉魚CDS區(qū)與斑馬魚的相似度為97%，與人和老鼠相似度為18%;組織分布分析顯示，TRIM47在腦中具有最高的mRNA水平，一些免疫相關(guān)器官如肝和腎也具有相對高水平的TRIM47表達(dá)；體外和體內(nèi)感染SVCV均顯著降低TRIM47 mRNA水平，但其在蛋白質(zhì)水平上不受病毒的影響；FHM細(xì)胞中的過表達(dá)TRIM47能夠顯著減少SVCV-G的mRNA水平，同時(shí)能夠增加IFN-1的表達(dá)水平，從而減少了SVCV的積累，這樣TRIM47在抗病毒中發(fā)揮重要作用[14]。Gong等(2019年)研究表明，線粒體抗病毒信號(MAVS)和IFN基因刺激物(MITA)的顯性失活突變體MAVS-ΔTM與MITA-CT的過表達(dá)削弱了SVCV對魚類IFN啟動子的激活；MAVS-ΔTM和MITA-CT的阻斷作用可能是通過調(diào)節(jié)SVCV介導(dǎo)的IRF3和雙鏈RNA依賴的蛋白質(zhì)激酶(PKR)的表達(dá)，因?yàn)镸AVS-ΔTM表現(xiàn)出比MITA-CT更好的抑制作用；因此，魚類MAVS和MITA都是SVCV觸發(fā)的IFN表達(dá)所必需的[15]。Shao等(2016年)研究發(fā)現(xiàn)，活性氧(ROS)的產(chǎn)生和不能維持適當(dāng)?shù)难趸€原平衡會有助于病毒發(fā)病，核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)可以通過協(xié)調(diào)激活一系列細(xì)胞保護(hù)基因，來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和應(yīng)對侵襲性。通過對Nrf2-ARE信號通路與SVCV復(fù)制之間的相互作用研究，發(fā)現(xiàn)SVCV感染可以誘導(dǎo)ROS以及蛋白質(zhì)羰基和8-OHdG的積累；并伴隨著Nrf2及其下游基因的上調(diào)，同時(shí)用D,L-蘿卜硫素(SFN)和CDDO-Me激活Nrf2可以抑制SVCV的復(fù)制，siRNA抑制Nrf2可以促進(jìn)SVCV的復(fù)制，所以Nrf2-ARE信號通路在SVCV感染后激活被動防御反應(yīng)，靶向Nrf2途徑具有對抗SVCV感染的潛力[16]。Wei等(2016年)研究發(fā)現(xiàn)，鯉魚感染鯉春病毒后Toll樣受體(TLRs)以及免疫相關(guān)基因表達(dá)升高，感染過程中模式識別受體TLR，干擾素和干擾素調(diào)節(jié)因子發(fā)揮重要的抗病毒作用；體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)，使用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，在SVCV分別感染鯉魚后的3、6、12 h，以及1、3、7、10 d進(jìn)行采樣，感染后3 h，發(fā)現(xiàn)SVCV的N蛋白、TLR2、TLR3、TLR7、TFN-1、ISG-15和Vig1顯著增加；在5～10 h這段時(shí)間中，病毒的拷貝量逐漸減少，免疫應(yīng)答相應(yīng)地減弱，但仍存在較高的表達(dá)；在病毒感染后12 h，發(fā)現(xiàn)與免疫相關(guān)基因之間存在較高的相關(guān)性，所以延長免疫基因表達(dá)時(shí)間，是幸存的魚主要應(yīng)對SVCV的方式[17]。

3 SVCV檢測

感染SVCV會導(dǎo)致鯉魚大量死亡。及時(shí)診斷對于SVCV的預(yù)防和控制至關(guān)重要，并且成功檢測出SVCV很大程度上取決于所使用的方法。Shao等(2016年)設(shè)計(jì)了2個(gè)TaqMan探針(N-tag1和N-tag2)，對應(yīng)于2個(gè)擴(kuò)增區(qū)域。使用SVCV 10/3，SVCV-265，SH140501，SH140502，SH140503和SH140522感染的EPC培養(yǎng)物進(jìn)行測試，所有測試均證明2種探針都可以有效地?cái)U(kuò)增系統(tǒng)發(fā)育樹上不同的SVCV分離株。從而建立了用于檢測SVCV的N-靶向?qū)崟r(shí)PCR策略[18]。安偉等選擇SVCV的N蛋白保守序列，成功建立了SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法，并且與常規(guī)RT-PCR進(jìn)行比較，二者檢驗(yàn)結(jié)果相同，均檢出陽性樣品，證明該方法可以運(yùn)用到臨床檢驗(yàn)[19]。吳斌等通過“油包水”的形式將反應(yīng)體系分割成小微滴，并對RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，建立了檢測SVCV的數(shù)字 RT- PCR 檢測方法，其優(yōu)點(diǎn)能夠?qū)蝹€(gè)微滴中的目標(biāo)基因進(jìn)行檢測，并且比實(shí)時(shí)定量RT-PCR的靈敏度更強(qiáng)[20]。劉遙等通過設(shè)計(jì)特異性的測序引物與指紋序列建立了SVCV的焦磷酸檢測方法，該檢測方法靈敏度高,最低檢出核酸量為10 pg/μL。一般3～4 h就可以出結(jié)果，并且以具體序列為檢測結(jié)果，防止了假陽性的出現(xiàn)，是國內(nèi)外首次建立的SVCV焦磷酸檢測技術(shù)[21]。

4 SVCV在我國流行情況

我國北京、河北、天津等地區(qū)均有魚類感染SVCV的發(fā)生，2003年從天津養(yǎng)殖場分離得到了SVCV,這是我國第一次從無臨床癥狀的觀賞魚體內(nèi)分離獲得的SVCV[22]。2007-2015年，王姝等從北京市9個(gè)區(qū)縣采集673份樣品，使用細(xì)胞分離法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行檢測，分離到28份SVCV陽性樣品[23]。紀(jì)峰等研究結(jié)果表明，通過對黑龍江地區(qū)2015-2016年間不同地區(qū)的40個(gè)養(yǎng)殖場送檢的鯉進(jìn)行SVCV分離鑒定，得出SVCV檢出率約為10%，并且來源于不同養(yǎng)殖場的病毒分離株的核酸序列呈現(xiàn)不同程度的差異，該結(jié)果進(jìn)一步證明SVCV毒株在中國不同的鯉養(yǎng)殖環(huán)境中正在不斷地進(jìn)化[24]。目前中國沒有關(guān)于SVCV大面積暴發(fā)的報(bào)道，但是上述的調(diào)查表明，該病毒在我國已有存在，并對我國魚類的對外出口貿(mào)易造成極大負(fù)面影響。

5 防治措施

SVCV的防治對控制疫病的流行也起到了關(guān)鍵的作用，也為研究提供了新的思路。Embregts等(2018年)通過使用重組SVCV-G基因制備DNA疫苗和桿狀病毒亞單位疫苗，進(jìn)行免疫鯉魚試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同的免疫方式對鯉魚的保護(hù)率存在不同的差異，其中肌肉注射方式保護(hù)率較好[25]。Zhang等用載有編碼全長基質(zhì)蛋白新型功能化單壁碳納米管(SWCNT) 作為DNA疫苗的遞送載體，肌肉注射免疫后對幼年鯉魚抗SVCV 具有顯著的保護(hù)作用。此外，當(dāng)選擇功能化的SWCNT作為疫苗載體時(shí)，觀察到良好的免疫保護(hù)作用(RPS大于51.3%)。因此，SVCV 的M基因編碼基質(zhì)蛋白可以用于SVCV DNA疫苗構(gòu)建體，SWCNT可能作為針對魚的病毒病原體的潛在高效DNA疫苗載體[26]。Medina-Gali等(2018年)研究發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖對感染SVCV斑馬魚有一定的治療作用，其機(jī)制主要是調(diào)節(jié)炎性因子的釋放過程，而體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖能夠調(diào)節(jié)IL-1在細(xì)胞中的位置，以此抑制SVCV感染的過程[27]。Chen等(2018年)以Bavachin(BVN)作為補(bǔ)骨脂活性成分之一，發(fā)現(xiàn)其對SVCV具有強(qiáng)抗病毒活性，BVN對SVCV復(fù)制的抑制是在某種程度上阻斷SVCV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明BVN可以抑制SVCV復(fù)制并阻斷病毒釋放以保護(hù)宿主細(xì)胞,從而達(dá)到治療效果[28]。通過利用體外細(xì)胞分子水平篩選模型對化合物進(jìn)行抗病毒活性評價(jià),得到具有良好抗SVCV活性的香豆素，通過觀察，感染SVCV 和藥物處理后 EPC的形態(tài)學(xué)和各項(xiàng)生化指標(biāo)的變化,以及使用多種細(xì)胞凋亡檢測技術(shù),對活性香豆素的抗SVCV活性作了進(jìn)一步深入的研究，研究表明，香豆素C4、D5分別通過宿主抗病毒反應(yīng)和直接作用病毒結(jié)構(gòu)蛋白對SVCV增殖產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用,能夠在體外和體內(nèi)顯著地降低病毒量,有效地維持宿主細(xì)胞生長活力,減少感染病毒斑馬魚的死亡率[29]。Shen等(2019年)研究發(fā)現(xiàn)，SVCV誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷和活性氧(ROS)生成都受到柴胡(Bupleurumyinchowense)的一個(gè)主要成分Saikosaponin D(SSD)處理的抑制，體內(nèi)試驗(yàn)中SSD對感染SVCV斑馬魚和鯉魚的治療也有效；腹腔注射SSD[6 mg/(kg·bw)]可使斑馬魚的存活率提高36%，并抑制90%以上的SVCV 核蛋白和糖蛋白基因在腎臟和脾臟中表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，SSD[6 mg/(kg·bw)]處理后鯉魚的存活率也增加了32%；總之，SSD被證實(shí)是迄今為止具有最高抗SVCV活性的天然產(chǎn)物[30]。

6 展望

由于SVCV與狂犬病都屬于彈狀病毒科，現(xiàn)階段對狂犬病的研究更加深入，我們可借鑒狂犬病的研究思路，進(jìn)一步對SVCV進(jìn)行研究，狂犬病抗病毒藥物能夠快速且有效地阻止正在進(jìn)行復(fù)制的病毒分子，因此阻止病毒的進(jìn)一步傳播。還可以設(shè)想用于預(yù)防性使用的抗病毒藥物，這些抗病毒藥物能夠預(yù)防外周神經(jīng)細(xì)胞的感染，并且應(yīng)該有可能取代目前用于抗病毒的免疫球蛋白[31-32]。Li等(2018年)通過噬斑克隆測定法從野生型彈狀病毒株(MSRV-SS)中純化篩選出MSRV-SS-7 菌株，并研究MSRV-SS-7克隆株抗彈狀病毒作用，動物試驗(yàn)中分別使用腹膜腔注射和浸泡接種免疫中國鱸魚，評估MSRV-SS-7株對毒性SCRV-GM的免疫保護(hù)作用，2種方法MSRV-SS-7對中國鱸魚相對免疫保護(hù)率均為100%[33]，表明MSRV-SS-7是針對SCRV疾病的潛在活疫苗候選物，可以參考用來研究SVCV，使SVCV研究思路更加寬廣。