肖懷秋，李玉珍，林親錄，趙謀明，劉 軍，周 全，姜明姣

(1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲 412000； 2.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640；3.中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004； 4.湖南中威制藥有限公司，湖南 株洲 412000)

亞鐵(Fe2+)是含鐵蛋白(酶)的關(guān)鍵組分，在生物體氧運(yùn)輸、生物大分子合成、生物氧化、髓磷脂生成、神經(jīng)元樹狀結(jié)構(gòu)發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化以及基因表達(dá)等生理過程有重要作用[1-2]。Fe2+含量不足時(shí)易引發(fā)缺鐵性貧血(IDA)，以及帕金森病、阿爾茲海默病等神經(jīng)退行性疾病，缺鐵嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素和含鐵酶活性降低，供氧不足，電子傳遞和能量代謝過程紊亂，機(jī)體免疫功能下降和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等代謝疾病，但可通過食物或藥物進(jìn)行補(bǔ)充。食物中大部分以高鐵(Fe3+)形式存在，吸收效率低，只有以亞鐵形式存在時(shí)，生物利用率才高且結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，易被人體胃腸道消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)；藥物補(bǔ)充主要以無機(jī)鐵鹽或簡(jiǎn)單有機(jī)酸鐵鹽形式進(jìn)行，存在穩(wěn)定性差、胃腸刺激大、易受腸內(nèi)容物干擾、生物利用率低和存在一定毒副作用等缺陷，補(bǔ)充效果不理想[3]。生物多肽與亞鐵經(jīng)配位螯合后可明顯改善亞鐵吸收利用率和穩(wěn)定性，并能減少金屬元素間拮抗[4]。多肽結(jié)構(gòu)中的氫鍵、表面配位鍵及動(dòng)態(tài)共價(jià)鍵等可與亞鐵螯合，并能以完整多肽被腸上皮細(xì)胞吸收，經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟代謝利用，是制備亞鐵營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的重要新策略，具有吸收率高、毒副作用少和安全邊際高等優(yōu)點(diǎn)[5]。

花生肽亞鐵作為亞鐵營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑常采用口服給藥方式，其在人體胃腸道的消化行為及降解規(guī)律是亟待研究的問題。食物的人胃腸仿生消化行為可采取胃腸仿生系統(tǒng)進(jìn)行體外模擬，利用消化酶模擬人體內(nèi)的消化進(jìn)程，可快速、簡(jiǎn)單、直觀地對(duì)消化過程進(jìn)行研究，具有消化用時(shí)短、成本低、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)[6]。目前，體外模擬消化以兩步胃腸消化較常見[7-9]，雙酶三階段法研究較為鮮見。張凱等[10]利用體外胃腸模擬消化系統(tǒng)考察了產(chǎn)物在胃腸道環(huán)境中螯合率的變化情況；杜芬等[7]用胃腸仿生消化手段研究并評(píng)價(jià)了鱈魚皮膠原蛋白源金屬螯合肽(多肽M)的胃腸消化耐受性，認(rèn)為多肽M體外模擬胃腸消化耐受性高；Sangsawad等[11]研究了雞胸肽的體外胃腸模擬消化，研究認(rèn)為1.0 kDa多肽具有更好的生物活性，更容易穿透結(jié)直腸單層腺癌細(xì)胞。為了客觀地評(píng)價(jià)花生肽亞鐵的胃腸仿生消化過程和闡明花生肽亞鐵的胃腸消化耐受性，本研究將腸道仿生消化細(xì)分為十二指腸消化和小腸消化，采用雙酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶)三階段(模擬人胃-十二指腸-小腸消化)法研究花生肽亞鐵在人胃腸仿生條件下的消化行為，明晰花生肽亞鐵的胃腸仿生消化行為及消化降解規(guī)律，為花生肽亞鐵營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的口服制劑提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花生肽，自制；胃蛋白酶(5 500 U/g)、胰蛋白酶(3 500 U/g)，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DK-98-11A型電熱恒溫水浴箱；UV-2500紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；TAS990原子吸收光譜；IRPrestige-21島津傅里葉變換紅外光譜儀；HERMLE Z323K冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hermle公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生肽亞鐵的制備

以不同相對(duì)分子質(zhì)量(<1.0 kDa、1.0～3.0 kDa和>3.0 kDa)的花生肽為載體，以氯化亞鐵為金屬螯合配體，在多肽與亞鐵質(zhì)量比4.31∶1、溫度25.4℃和pH 7.5條件下螯合28.5 min后，用無水乙醇沉淀，靜置2 h并于8 000 r/min離心20 min，得到花生肽亞鐵配位螯合物(沉淀部分)，簡(jiǎn)稱為花生肽亞鐵(PPC)[5，12]。以相對(duì)分子質(zhì)量小于1.0 kDa、1.0～3.0 kDa、大于3.0 kDa的花生肽為載體制備的花生肽亞鐵分別命名為L(zhǎng)-PPC、M-PPC和H-PPC。

1.2.2 花生肽亞鐵的pH穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱取花生肽亞鐵配制10.0 mg/L的花生肽亞鐵溶液，用0.5 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至1.0～13.0，于37℃保溫1 h，8 000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)定鐵含量，計(jì)算花生肽亞鐵螯合率。

1.2.3 花生肽亞鐵的熱穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱取花生肽亞鐵配制10.0 mg/L的花生肽亞鐵溶液(pH自然)，于10～100℃下保溫1 h，8 000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)定鐵含量，計(jì)算花生肽亞鐵螯合率。

1.2.4 模擬胃腸仿生消化液的配制

1.2.4.1 胃仿生消化液

參考《中國(guó)藥典》(2010版)第二部附錄XA方法配制[13]。移取23.4 mL濃HCl，加水100 mL配制成稀HCl溶液，取稀HCl溶液1.64 mL加入80.0 mL去離子水，加入胃蛋白酶1.0 g混勻，加水稀釋至100.0 mL即為模擬胃仿生消化液，pH為2.0左右。

1.2.4.2 腸仿生消化液

參考《中國(guó)藥典》(2010版)第二部附錄XVD方法配制[13]。稱取0.68 g KH2PO4，用去離子水50.0 mL溶解，調(diào)節(jié)pH至7.6，另取胰蛋白酶1.0 g于適量水溶解，合并上述溶液并加水稀釋至100.0 mL，即為模擬十二指腸仿生消化液。將pH調(diào)節(jié)到6.8即為模擬小腸仿生消化液。

所有模擬胃腸仿生消化液均現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.5 花生肽亞鐵的人胃腸仿生消化過程

人胃腸仿生消化參考Cruz-Huerta等[14]方法并作修改。采用雙酶三階段法進(jìn)行連續(xù)人胃腸仿生消化，分為胃仿生消化、十二指腸仿生消化和小腸仿生消化。具體仿生消化過程為：準(zhǔn)確稱取1.0 mg花生肽亞鐵加入至100.0 mL胃仿生消化液中，于(37±0.5)℃和100 r/min條件下進(jìn)行胃仿生消化2 h，每間隔30 min取樣，收集的樣品命名為SGF1～SGF4(分別對(duì)應(yīng)消化30、60、90、120 min)。胃仿生消化完成后，用0.5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.6，終止胃仿生消化，8 000 r/min離心20 min，收集沉淀。沉淀用十二指腸仿生消化液溶解并于(37±0.5)℃和50 r/min條件下十二指腸仿生消化1 h，每間隔30 min取樣，收集的樣品命名SDF1、SDF2(分別對(duì)應(yīng)消化30、60 min)。十二指腸仿生消化完成后，調(diào)pH至6.8，繼續(xù)在(37±0.5)℃、50 r/min條件下仿生小腸消化3 h，每間隔30 min取樣，收集的樣品命名SIF1～SIF6 (分別對(duì)應(yīng)消化30、60、90、120、150、180 min)。

1.2.6 花生肽亞鐵螯合率的測(cè)定

采用改進(jìn)的乙醇沉淀法[7,10,15]測(cè)定花生肽亞鐵螯合率。取待測(cè)樣2.00 mL，加入8.00 mL無水乙醇混勻，靜置2 h后于8 000 r/min離心20 min，去除沉淀后將上清液濃縮至2 mL，加入8倍體積的無水乙醇，靜置2 h后8 000 r/min離心20 min，測(cè)定上清液中亞鐵含量，鐵含量采取鄰菲羅琳510 nm比色法[12]測(cè)定，樣品總鐵含量采用GB 5009.90—2016火焰原子吸收光譜法測(cè)定。按下式計(jì)算亞鐵螯合率。

式中：M1為2 mL待測(cè)樣對(duì)應(yīng)的花生肽亞鐵所含的鐵含量，mg；M2為上清液中游離亞鐵含量，mg。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 花生肽亞鐵的pH穩(wěn)定性(見圖1)

注：圖中字母相同表示3種PPC的亞鐵螯合率差異不顯著(p>0.05)，字母不同表示差異極顯著(p<0.01)，下同。

由圖1可看出：L-PPC比M-PPC和H-PPC具有更好的pH穩(wěn)定性，在pH 1～9范圍內(nèi)能保持較好的穩(wěn)定性，與M-PPC和H-PPC有極顯著差異；pH為10.0時(shí)，L-PPC亞鐵螯合率小于60%，隨著pH的進(jìn)一步增加，亞鐵螯合率呈遞減趨勢(shì)。相同pH條件下，H-PPC穩(wěn)定性最差，主要是由于H-PPC配位螯合載體為大于3.0 kDa的花生肽，相對(duì)分子質(zhì)量較大。研究認(rèn)為，花生肽亞鐵pH穩(wěn)定性與載體相對(duì)分子質(zhì)量成反比，低相對(duì)分子質(zhì)量載體制備的花生肽具有更好的穩(wěn)定性。H-PPC在極端pH條件下(如pH<2和pH>9)，亞鐵螯合率不足50%，主要是由于相對(duì)分子質(zhì)量大的多肽載體在酸性或堿性條件下易發(fā)生分解，從而使已螯合的亞鐵離子由共價(jià)結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)[16]。L-PPC在酸性條件下具有較好的穩(wěn)定性，仍保持較高的亞鐵螯合率，意味著L-PPC具有較好的酸耐受性。

2.2 花生肽亞鐵的熱穩(wěn)定性(見圖2)

圖2 花生肽亞鐵的熱穩(wěn)定性

由圖2可以看出，60℃以下L-PPC亞鐵螯合率可保持80%以上，M-PPC在50℃以下可保持75%以上的亞鐵螯合率，與L-PPC差異不顯著，而與H-PPC有極顯著差異。當(dāng)溫度達(dá)70℃以上，L-PPC、M-PPC和H-PPC的亞鐵螯合率均顯著下降，且隨著溫度上升，亞鐵螯合率呈線性下降。作為花生肽亞鐵金屬營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的口服制劑，以低溫或常溫儲(chǔ)存較為普遍，因此60℃以下能保持較好的穩(wěn)定性，基本上可滿足生產(chǎn)技術(shù)要求[17-18]。從L-PPC、M-PPC和H-PPC的熱耐受性來看，低相對(duì)分子質(zhì)量載體制備的花生肽亞鐵具有更好的熱耐受性。在60℃時(shí)，L-PPC亞鐵螯合率仍保持在(80.65±1.02)%，而H-PPC在37℃時(shí)亞鐵螯合率僅為(54.38±0.95)%。隨著溫度的持續(xù)上升，H-PPC 的亞鐵螯合率呈顯著下降趨勢(shì)，特別是在溫度高于50℃后，其亞鐵螯合率低于50%。說明對(duì)于H-PPC 來說，溫度的持續(xù)上升使超過50%的結(jié)合態(tài)亞鐵由于多肽鏈的破壞而變?yōu)橛坞x的亞鐵離子[19]，主要是由于多肽載體相對(duì)分子質(zhì)量較大時(shí)熱穩(wěn)定性較差，特別當(dāng)溫度較高時(shí)，容易引起多肽載體的熱沉凝聚[10]，亞鐵螯合率相應(yīng)顯著降低。

2.3 花生肽亞鐵胃仿生消化耐受性(見圖3)

圖3 花生肽亞鐵胃仿生消化耐受性

由圖3可以看出，不同相對(duì)分子質(zhì)量載體制備的花生肽亞鐵表現(xiàn)出不同的胃酸耐受性。在胃仿生消化30 min時(shí)，L-PPC和M-PPC亞鐵螯合率差異不顯著，亞鐵螯合率分別為(89.50±0.70)%和(89.01±0.66)%，但與H-PPC亞鐵螯合率((72.74±0.68)%)差異極顯著。隨著胃仿生消化時(shí)間的延長(zhǎng)，L-PPC、M-PPC和H-PPC表現(xiàn)的胃酸耐受性呈現(xiàn)極顯著性差異。胃仿生消化90 min和120 min時(shí)，M-PPC和H-PPC的亞鐵螯合率分別為(71.83±1.32)%、(56.61±1.16)%和(61.46±1.25)%和(53.90±1.33)%。胃仿生消化120 min時(shí)，相對(duì)于胃仿生消化30 min，L-PPC、M-PPC和H-PPC的亞鐵螯合率殘存率分別為91.15%、69.05%和74.10%。因此，L-PPC胃酸耐受性明顯高于M-PPC和H-PPC，與前述的pH穩(wěn)定性結(jié)果一致。主要是由于L-PPC的載體相對(duì)分子質(zhì)量較小，具有較好的穩(wěn)定性，而相對(duì)分子質(zhì)量較大的載體則穩(wěn)定性較差[7]。

2.4 花生肽亞鐵腸仿生消化耐受性(見圖4)

由圖4可看出，L-PPC與M-PPC和H-PPC的亞鐵螯合率在十二指腸仿生消化和小腸仿生消化過程中均存在極顯著差異，其中L-PPC腸耐受性最好。L-PPC在十二指腸仿生消化階段，亞鐵螯合率保持在75%以上，而M-PPC和H-PPC經(jīng)十二指腸仿生消化60 min，亞鐵螯合率分別下降至(57.93±0.83)%和(45.65±0.87)%。在小腸仿生消化階段，L-PPC亞鐵螯合率呈小幅下降，小腸仿生消化180 min，亞鐵螯合率為(66.96±1.73)%，而M-PPC降至(38.42±0.85)%，H-PPC腸耐受性最差，小腸仿生消化180 min，其亞鐵螯合率僅為(18.34±0.72)%。主要是由于H-PPC載體在小腸仿生消化時(shí)遭到破壞，使共價(jià)結(jié)合的亞鐵變成游離態(tài)的亞鐵[20]。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)分別以小于1.0 kDa、1.0～3.0 kDa和大于3.0 kDa的花生肽為載體，以氯化亞鐵為配體，采用液相合成法制備L-PPC、M-PPC和H-PPC，研究了其pH、熱穩(wěn)定性和胃腸消化耐受性。研究表明：L-PPC具有較好的pH穩(wěn)定性和酸耐受性，與M-PPC 和H-PPC存在極顯著差異，H-PPC的pH穩(wěn)定性最差；L-PPC具良好熱穩(wěn)定性，60℃條件下亞鐵螯合率仍保持在(80.65±1.02)%，H-PPC在37℃時(shí)亞鐵螯合率僅有(54.38±0.95)%；胃仿生消化30 min，L-PPC和M-PPC亞鐵螯合率差異不顯著，與H-PPC差異極顯著，L-PPC胃酸耐受性明顯高于M-PPC和H-PPC；在十二指腸仿生消化階段，L-PPC亞鐵螯合率與M-PPC和H-PPC亞鐵螯合率差異極顯著；在小腸仿生消化階段，L-PPC 仿生消化180 min，亞鐵螯合率為(66.96±1.73)%，而M-PPC降至(38.42±0.85)%，H-PPC腸耐受性最差。研究結(jié)果說明，低相對(duì)分子質(zhì)量載體制備的花生肽亞鐵具有更好的pH穩(wěn)定性、熱耐受性和胃腸消化耐受性，經(jīng)胃腸仿生消化后仍保持相對(duì)較高的亞鐵螯合率。制備花生肽亞鐵時(shí)應(yīng)選擇低相對(duì)分子質(zhì)量的花生肽作為載體，以提高花生肽亞鐵的消化吸收率、穩(wěn)定性和胃腸耐受性。