張相杰，陳國俊，李涵，李芳柏，劉同旭

(1.華南農業(yè)大學 資源環(huán)境學院，廣州 510650；2.廣東省科學院 生態(tài)環(huán)境與土壤研究所；華南土壤污染控制與修復國家地方聯(lián)合工程研究中心；廣東省農業(yè)環(huán)境綜合治理重點實驗室，廣州 510650)

鐵是地殼中第四豐富的元素，也是生物圈中最普遍存在的氧化還原活性金屬[1]。鐵長期以來被認為是生命所必須的，鐵氧化菌(FeOB)與鐵還原菌(FeRB)驅動了鐵的生物地球化學循環(huán)。鐵循環(huán)過程控制著土壤有機物礦化、甲烷排放、重金屬的吸附固定、反硝化等環(huán)境過程，是連接土壤養(yǎng)分循環(huán)與污染物轉化的紐帶，是推動物質循環(huán)與能量代謝的重要引擎[2-6]。氮是核苷酸和氨基酸的基本組成元素，是構成生命的基本元素，從根本上影響著大多數生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能[7]。硝酸鹽作為氮循環(huán)網絡的關鍵節(jié)點，在自然界氮循環(huán)過程中起著至關重要的作用。在農業(yè)生產中，氮素的輸入至關重要，而微生物的反硝化作用會導致氮素的大量流失[8]。微生物通過反硝化過程、異化硝酸鹽還原成銨、厭氧氨氧化競爭性還原硝酸鹽[9]。硝酸鹽還原的產物N2O作為重要的溫室氣體，超過60%的排放來自農業(yè)土壤，而土壤中超過2/3的N2O排放可歸因于細菌和真菌生物與非生物反硝化過程共同作用的結果[10-11]。因此，微生物驅動的硝酸鹽還原過程對元素地球化學循環(huán)、農業(yè)生產、溫室氣體排放等方面具有重要意義。

筆者選取發(fā)酵型和呼吸型兩種鐵還原菌作為模式菌株，研究其驅動NRFO過程。設置不同鐵還原微生物驅動NRFO過程的對照實驗，對反應物和生成物反應動力學進行分析，對不同處理組的次生礦物進行對比，研究目的包括：探究不同類型鐵還原菌、硝酸鹽還原菌的NRFO過程動力學和礦物學差異，揭示鐵還原菌驅動的NRFO過程的反應機制和影響因素。該研究可拓展NRFO過程的微生物范疇，揭示厭氧環(huán)境微生物驅動的NRFO過程中的微生物功能與貢獻。

1 實驗

1.1 實驗材料

實驗采用的微生物為發(fā)酵型兼性厭氧鐵還原菌KlebsiellapneumoniaeL17[46]、呼吸型兼性厭氧鐵還原菌ShewanellaoneidensisMR-1[47]，來自海洋微生物菌種保藏管理中心(Marine Culture Collection of China, MCCC)；呼吸型兼性厭氧鐵還原菌Shewanellaputrefaciensstrain CN32[48]，來自廣東省微生物菌種保藏中心(Guangdong Microbial Culture Collection Center, GDMCC)。好氧培養(yǎng)基成分為NaCl 5 g/L、牛肉浸膏5 g/L、蛋白胨10 g/L，pH值調至7.0，并對培養(yǎng)基進行高溫高壓滅菌處理。將-80 ℃冰箱中保存的微生物(1 mL)取出解凍后，在超凈工作臺倒入好氧培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)14 h(30 ℃，180 r/min)，然后放置在超凈工作臺，取1 mL菌液轉接到好氧培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14 h(30 ℃，180 r/min)。對100 mL西林瓶、純水用100% N2充氣30 min排氧，并高溫高壓滅菌，然后在厭氧工作站中配制亞鐵母液(FeSO41 mol/L)，用橡膠塞壓緊并用鋁蓋進一步密封，平衡24 h后，用0.22 μm濾頭過濾并進行避光保存。配制葡萄糖母液(1 mol/L)、乳酸鹽母液(1 mol/L)，并用0.22 μm濾頭過濾，然后用100% N2充氣30 min排氧。微量元素儲備液SL14和維生素儲備液V10的具體配方參考文獻[49]，用0.22 μm濾頭過濾之后，再用100% N2充氣30 min排氧。配制30 mmol/L的哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)作為洗菌和實驗體系的緩沖液(pH=7.0)。

1.2 實驗方案及測試方法

表1 不同鐵還原菌、不同亞鐵濃度的處理組

2 實驗結果與討論

2.1 硝酸鹽還原動力學

不同亞鐵濃度條件下，3種異化鐵還原菌的硝酸鹽還原動力學曲線見圖1，3種異化鐵還原菌的硝酸鹽還原準一級速率常數見表2。結果表明，不加亞鐵情況下，L17和CN32體系的硝酸鹽在1.6 d時被完全還原，硝酸鹽還原的準一級速率常數分別為1.772、1.672/d(表2)，說明L17和CN32的硝酸還原能力接近。MR-1體系與L17和CN32不同，在0～16 h硝酸鹽迅速還原，在16～64 h硝酸鹽還原速率變慢，在第3天，硝酸鹽被完全還原。硝酸鹽還原準一級速率常數0.674/d，顯著低于L17和CN32。分別在體系中添加1、5 mmol/L亞鐵，結果顯示，硝酸鹽的還原均受到顯著抑制。亞鐵為1 mmol/L條件下，微生物硝酸鹽還原速率明顯高于高濃度亞鐵條件，反應在第7天已達到穩(wěn)定，L17菌在第7天將硝酸鹽完全還原；CN32體系的硝酸鹽在第4天基本被還原；說明低濃度亞鐵抑制了L17、CN-32硝酸鹽還原速率，但硝酸鹽最終能被完全還原。在MR-1體系，初始階段硝酸鹽還原速率較快，之后迅速達到平衡，硝酸鹽被還原30%，說明低濃度亞鐵顯著的抑制了MR-1硝酸鹽還原過程。綜上所述，在低濃度亞鐵條件下，微生物硝酸鹽還原速率為CN32(0.563/d)>L17(0.179/d)>MR-1(0.034/d)。在高濃度5 mmol/L亞鐵條件下，L17處理組僅僅有0.7 mmol/L硝酸鹽被還原，CN32處理組在反應12 d后，1 mmol/L硝酸鹽被還原，MR-1處理組在反應12 d后，1.6 mmol/L硝酸鹽被還原，其準一級速率常數分別為0.010/d、0.014/d、0.010/d，顯著低于1 mmol/L亞鐵處理以及不加亞鐵的處理。3種菌在高濃度亞鐵條件下，反應前期少量的硝酸鹽被還原，之后硝酸鹽還原過程停滯，表明了高濃度亞鐵對微生物硝酸鹽還原具有顯著的抑制作用。綜上所述，亞鐵的添加抑制了微生物硝酸鹽還原過程，而隨著亞鐵濃度的升高，對微生物還原硝酸鹽的抑制作用增強，亞鐵對不同類型鐵還原微生物硝酸鹽還原的抑制程度存在差異。

表2 硝酸鹽還原亞鐵氧化過程中亞鐵氧化和硝酸鹽還原的準一級速率常數

圖1 異化鐵還原菌的硝酸鹽還原反應動力學曲線

2.2 亞硝酸鹽和銨根生成動力學

圖2 不同亞鐵濃度條件下異化鐵還原菌的亞硝酸鹽生成、銨根生成反應動力學曲線

2.3 亞鐵氧化動力學

亞鐵氧化動力學如圖3所示。在未添加硝酸鹽的條件下，L17、CN32和MR-1均不能生物氧化亞鐵；而加入硝酸鹽后，在1、5 mmol/L Fe2+的體系中均發(fā)生了氧化，在厭氧無催化劑存在的條件下，亞鐵和硝酸鹽不能直接發(fā)生化學反應[31, 51]。說明鐵還原條件下的亞鐵氧化是由硝酸鹽還原導致的。對于1 mmol/L Fe2+，在L17體系中，亞鐵在第4天接近完全氧化；CN32體系亞鐵完全氧化耗時6 d；MR-1體系中，直到第7天亞鐵僅氧化14.4%。其準一級速率常數分別為L17(0.066/d)、CN32(0.051/d)、MR-1(0.034/d)(表2)。在5 mmol/L Fe2+條件下，第12天L17、CN32、MR-1體系中分別有57.1%、51.4%、34.1%的亞鐵發(fā)生氧化，其準一級速率常數分別為L17(0.066/d)、CN32(0.051/d)、MR-1(0.034/d)。上述結果表明，3種鐵還原菌的亞鐵氧化速率為L17>CN32>MR-1，亞鐵氧化速率不同的原因是，不同微生物的硝酸鹽還原速率的差異以及代謝途徑的不同。在L17和CN32體系中，高濃度亞鐵不完全氧化，但低濃度亞鐵可以完全氧化；MR-1在不同的亞鐵濃度下均表現為亞鐵的不完全氧化。

圖3 不同亞鐵濃度條件下鐵還原微生物的亞鐵氧化動力學曲線

2.4 次生礦物表征

亞硝酸鹽與亞鐵化學反硝化作用生成的次生礦物分為3部分，一部分沉淀于細胞周圍環(huán)境(綠色箭頭所示)，一部分粘附在細胞表面但結合并不緊密(藍色箭頭所示)；一部分沉淀生成在細胞表面或者外膜，形成細胞結殼(紅色箭頭所示)。如圖4所示。

圖4 高濃度亞鐵條件下硝酸鹽還原亞鐵氧化過程生成礦物的SEM結果(菌濃度OD600=1.0；硝酸鹽初始濃度5 mmol/L)

在Fe2+濃度為5 mmol/L的條件下，次生礦物大量附著在細胞表面，3種微生物均發(fā)生了明顯的細胞結殼，導致在高濃度亞鐵條件下硝酸鹽還原速率遠遠低于低濃度亞鐵濃度。在Fe2+濃度為1 mmol/L條件下，如圖5所示。

圖5 低濃度亞鐵條件下硝酸鹽還原亞鐵氧化過程生成礦物的SEM結果(菌濃度OD600=1.0；硝酸鹽初始濃度5 mmol/L)

L17和CN32亞鐵氧化生成鐵氧化物并沉淀在細胞表面，會阻礙硝酸鹽進入細胞周質進行還原。然而，大部分微生物沒有結殼，所以，在反應后期，硝酸鹽仍然能被完全還原；而且L17細胞表面沉淀的次生礦物明顯多于CN32，導致L17硝酸鹽還原速率明顯低于CN32。低濃度亞鐵條件下，MR-1處理組亞鐵幾乎沒有被氧化，所以，未收集到次生礦物，這可能是因為亞鐵的添加導致了細胞活性降低，從而抑制了硝酸鹽還原過程。同時，對次生礦物類型進行了XRD表征，如圖6所示，結果表明，在高濃度亞鐵條件下，3種鐵還原微生物處理組生成的結晶態(tài)礦物主要為針鐵礦。亞鐵與亞硝酸鹽化學反應生成的鐵氧化物主要為針鐵礦和纖鐵礦[50]。在低濃度亞鐵條件下，生成的鐵氧化物除了針鐵礦之外，還生成了結晶度較差的水鐵礦，說明亞鐵氧化成礦的結晶度與亞鐵濃度正相關。

圖6 不同亞鐵濃度下硝酸鹽還原亞鐵氧化生成礦物的XRD圖譜(菌濃度OD600=1.0；硝酸鹽初始濃度5 mmol/L)

綜上所述，亞鐵氧化成礦并附著在細胞表面，能影響微生物硝酸鹽還原。隨著亞鐵濃度的提高，細胞結殼逐漸增加，次生礦物結晶度提高，阻礙硝酸鹽進入細胞周質進行還原，導致了硝酸鹽還原速率明顯降低甚至完全停滯，從而抑制了微生物的代謝活動[52]。

2.5 反應機制與環(huán)境意義

圖7 異化鐵還原菌介導的硝酸鹽還原亞鐵氧化過程機制

鐵還原菌還原鐵主要通過3種途徑：鐵還原菌與鐵氧化物直接接觸；細胞分泌胞外螯合物提高鐵礦物溶解性，促進鐵還原過程；細胞分泌或者利用周圍環(huán)境的電子穿梭體，通過胞外電子傳遞過程進行鐵還原[57]。鐵還原菌介導的Fe-N循環(huán)已有報道，鐵氧化物作為電子受體被微生物還原為亞鐵，亞鐵被亞硝酸鹽化學氧化，生成的鐵氧化物仍然能夠作為鐵還原菌的電子受體被還原，實現鐵的氧化還原循環(huán)。對于亞硝酸鹽來說，一方面被亞鐵化學還原，另一方面能夠作為微生物的電子受體，被生物還原[58-59]。說明鐵還原菌介導的鐵氧化還原循環(huán)和硝酸鹽的持續(xù)還原理論上可行。但研究當中沒有發(fā)現明顯的鐵還原過程，其主要原因可能是：1)細胞結殼一方面限制微生物的運動、生長和營養(yǎng)物的攝入，導致微生物鐵還原相關酶活性的降低，阻礙鐵還原菌胞外電子傳遞。另一方面微生物不能有效地利用細胞表面鐵氧化物作為電子受體[36, 60]。2)硝酸鹽還原過程抑制了鐵還原過程。目前的研究表明，細胞色素CymA能夠參與多種電子受體的還原過程，微生物更傾向于利用硝酸鹽作為電子受體，所以硝酸鹽還原CymA的電子傳遞過程可能導致鐵還原速率的減慢，表現為硝酸鹽和鐵的競爭性還原[44, 61]。3)由于較高濃度亞硝酸鹽的存在，導致鐵還原生成亞鐵發(fā)生再氧化。4)體系殘留的亞鐵吸附在鐵氧化物表面，導致鐵活性的降低，微生物無法進行生物鐵還原過程。

研究表明，厭氧環(huán)境中多種微生物群落參與NRFO過程[62]。本研究強調了在厭氧富鐵環(huán)境中非模式菌驅動的NRFO過程，表明在厭氧環(huán)境中NRFO過程并不是單一微生物驅動的，非亞鐵氧化功能菌也能夠驅動NRFO過程。在低氮肥施加水稻土和厭氧沉積物中，微生物硝酸鹽異化還原為銨(DNRA)在硝酸鹽代謝途徑中占有主導地位[63-64]。鐵還原菌DNRA生成銨根，然后被植物或者其他微生物吸收利用，有利于厭氧環(huán)境氮沉積和再循環(huán)。厭氧富鐵環(huán)境中亞鐵顯著抑制微生物DNRA過程，亞鐵競爭性還原亞硝酸鹽導致微生物產銨的大量減少，生成的NO和N2O釋放到大氣中，造成厭氧環(huán)境中氮損耗[39]。細胞結殼阻礙硝酸鹽等電子受體進入細胞還原，導致硝酸鹽的不完全還原，同時限制微生物的運動、生長、營養(yǎng)物質攝入[60]。該研究表明，細胞結殼抑制了異化鐵還原菌介導的NRFO過程，細胞結殼對不同鐵還原菌的抑制機制不同。本工作豐富了硝酸鹽還原亞鐵氧化的研究思路，加深了對微生物驅動的NRFO反應機制的理解。

3 結論

鐵還原菌能夠通過硝酸鹽還原的中間產物亞硝酸鹽與亞鐵的化學反硝化作用實現亞鐵氧化過程。亞鐵抑制了微生物硝酸鹽還原、亞硝酸鹽和銨根的生成。低濃度亞鐵條件下，亞鐵降低了L17和CN32硝酸鹽還原速率，而亞鐵完全抑制了MR-1硝酸鹽還原，其抑制順序為MR-1>L17>CN32。亞鐵嚴重抑制了硝酸鹽異化還原成銨過程。在高濃度亞鐵條件下，亞鐵氧化成礦明顯抑制了微生物硝酸鹽還原過程。在低濃度亞鐵條件下，對于L17和CN32來說，亞鐵氧化生成的鐵氧化物抑制了微生物的硝酸鹽還原，但大部分微生物沒有完全結殼，所以，硝酸鹽最終能被完全還原，且CN32硝酸鹽還原速率明顯高于L17。亞鐵毒害作用抑制了L17硝酸鹽還原過程，也是影響MR-1硝酸鹽還原的主要原因。隨著亞鐵濃度的升高，微生物細胞結殼程度越高，細胞的完全結殼是硝酸鹽還原停滯的主要原因。本研究拓展了硝酸鹽還原亞鐵氧化過程的微生物類型，加深了對微生物介導的硝酸鹽還原亞鐵氧化的理解，對研究微生物介導的鐵-氮循環(huán)過程具有重要的意義。