梅佳 曾娟 王琴 李軍 韓永紅

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院腫瘤科（武漢430024）

胰腺癌是一種惡性程度高、預(yù)后極差的腫瘤，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)逐年上升。近20年來(lái)，胰腺癌的發(fā)病率在我國(guó)增加了6倍，嚴(yán)重危害人民的健康和生存質(zhì)量［1］。對(duì)于胰腺癌的治療，手術(shù)、放化療仍是主要手段。但是化療藥物毒副作用較大，并且易產(chǎn)生耐藥性。即使胰腺癌患者接受各種途徑治療后，其整體的預(yù)后水平并不理想，總體5年生存率只有3%［2-3］。因此，醫(yī)學(xué)研究人員亟待尋找療效好、毒副作用小的藥物［4］，緩解患者的痛苦。研究報(bào)道多種中藥成分具有抗腫瘤作用，且毒副作用小，已經(jīng)成為腫瘤的主要輔助治療途徑之一。

川陳皮素是陳皮的有效成分之一，為多甲氧基黃酮類化合物中的一種，在柑橘屬植物果皮中的含量較為豐富，具有較高的生物利用度和滲透性。研究報(bào)道川陳皮素具有多種藥理學(xué)活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化等［5-10］。川陳皮素對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞具有選擇性的抑制作用。

長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近期研究表明，LncRNA調(diào)控多種關(guān)鍵的促癌基因或抑癌基因的表達(dá)，從而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。除了調(diào)節(jié)其他基因，LncRNA自身也作為致癌或者抑癌因子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11-12］。LncRNA是否參與了中藥的抗腫瘤過(guò)程，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討川陳皮素對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其潛在分子機(jī)制。

1 方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞株MIAPaCa-2和PANC1及正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株H6C7均購(gòu)于武漢大學(xué)保藏中心。所有細(xì)胞株均培養(yǎng)在加入10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的PRMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。采用二甲基亞砜（DMSO）溶解川陳皮素（上海索萊寶生物科技有限公司）。DMSO作為溶劑，其終濃度不超過(guò)0.1%。

1.2 CCK-8采用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力變化。細(xì)胞消化后，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×103/mL，接種于96孔板中。培養(yǎng)48 h后，棄掉培養(yǎng)基，加入CCK8反應(yīng)試劑，繼續(xù)孵育2 h。采用酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）檢測(cè)96孔板每孔在450 nm的吸光度值。

1.3 RT-PCR采用Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）從癌組織及癌旁組織樣品和細(xì)胞株中提取總RNA。超微量紫外分光光度計(jì)（德國(guó)Eppendorf公司）測(cè)定總RNA濃度以及純度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKARA公司）以RNA為模板合成cDNA，之后運(yùn)用SYBR Green RT-PCR試劑盒（日本TAKARA公司）檢測(cè)LncRNA的表達(dá)豐度。

1.4 集落形成實(shí)驗(yàn)細(xì)胞消化后，完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。按1×103/mL濃度將細(xì)胞接種于六孔板上。連續(xù)培養(yǎng)14 d后，加入10%的甲醛固定細(xì)胞15 min，1.0%的結(jié)晶紫染色5 min?？諝飧稍锖筮M(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)轉(zhuǎn)染si-LSINCT5 48 h后，用遇冷的70%乙醇固定細(xì)胞后，50 mg/mL PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)每個(gè)階段細(xì)胞數(shù)量。

1.6 Western BlotRIPA提取細(xì)胞的總蛋白，超微量分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度后加入Loading Buffer，沸水煮5 min將蛋白變性。每個(gè)蛋白樣本取40 μg加入SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。通過(guò)電轉(zhuǎn)方式將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜在含有5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h。以1∶1 000比例稀釋一抗，4°C下一抗孵育PVDF膜過(guò)夜。HRP標(biāo)記的二抗以1∶3 000稀釋后室溫孵育PVDF膜2 h后，ECL顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示，采用SPSS 19.0分析軟件和單因素方差分析ANOVA方法或非配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LSINCT5在胰腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)增加采用RT-PCR檢測(cè)LSINCT5在10對(duì)胰腺癌組織及其癌旁組織中LSINCT5的表達(dá)情況，LSINCT5在胰腺癌患者腫瘤組織（3.05±0.49）中的表達(dá)顯著高于其癌旁組織（1.02±0.09）中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1A；進(jìn)一步檢測(cè)了LSINCT5在胰腺癌細(xì)胞株MIAPaCa-2和PANC1及正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株H6C7中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，LSINCT5在MIAPaCa-2（2.19± 0.23）和PANC1（1.81± 0.20）中的表達(dá)與H6C7（1.03± 0.09）相比顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為P＜0.01，P＜ 0.05），見(jiàn)圖1B。

圖1 LSINCT5在胰腺癌組織和癌旁組織（A）及細(xì)胞株（B）中表達(dá)Fig.1 Expression of LSINCT5 in pancreatic cancer tissues and adjacent tissues（A）and cell lines（B）

2.2 川陳皮素對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響觀察川陳皮素對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響，運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)川陳皮素不同濃度（40、80、160、320 μmol/L）對(duì)胰腺癌細(xì)胞株MIAPaCa-2和PANC1干預(yù)后，MIAPaCa-2增殖能力分別為（82.41±9.13）、（63.32±7.72）、（33.34 ± 4.12），（17.13 ±1.64），空白組為（99.92±9.41）；PANC1增殖能力分別為（77.14±8.91）、（59.12 ± 7.23）、（39.61 ± 4.54），（16.12 ± 1.93），空白組為（99.75±9.22），川陳皮素分別作用MIAPaCa-2和PANC1細(xì)胞48 h后，與空白對(duì)照組相比，兩組胰腺癌細(xì)胞株活力均受到不同程度的抑制（圖2A、圖2B）。川陳皮素的濃度為160 μmol/L時(shí)，對(duì)兩種細(xì)胞株的活力抑制作用超過(guò)40%，因此，選擇濃度為160 μmol/L的川陳皮素進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 微陣列芯片篩選川陳皮素干預(yù)后，細(xì)胞中表達(dá)差異最大的LncRNA采用微陣列芯片分析川陳皮素干預(yù)胰腺癌細(xì)胞株后，細(xì)胞內(nèi)LncRNAs的表達(dá)譜變化情況。結(jié)果如圖3A所示，在MIAPaCa-2胰腺癌細(xì)胞中加入160 μmol/L川陳皮素處理48 h后，21個(gè)LncRNA表達(dá)上調(diào)（表達(dá)差異＞2倍），19個(gè)LncRNA表達(dá)下調(diào)（表達(dá)差異＞2倍），見(jiàn)圖3B。其中，LncRNA LSINCT5表達(dá)下調(diào)的變化最為明顯。接下來(lái)采用RT-PCR對(duì)微陣列芯片的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示160 μmol/L川陳皮素分別干預(yù)MIAPaCa-2和PANC1細(xì)胞48 h后，MIAPaCa-2和PANC1中LSINCT5表達(dá)分別為（0.42±0.06）、（0.32±0.05），與未加藥組（0.99±0.09）相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3C。結(jié)果提示在川陳皮素的作用下，LSINCT5表達(dá)明顯下調(diào)，有可能作為致癌調(diào)節(jié)因子參與調(diào)節(jié)胰腺癌的細(xì)胞生物學(xué)功能。

圖2 川陳皮素對(duì)胰腺癌細(xì)胞株MIAPaCa-2（A）和PANC1（B）活力的影響Fig.2 Effects of nobiletin on the activity of pancreatic cancer cell line MIAPaCa-2（A）and PANC1（B）

圖3 川陳皮素對(duì)胰腺癌細(xì)胞株中LncRNA表達(dá)影響（A和B）和細(xì)胞株中（C）LSINCT5表達(dá)的影響Fig.3 Effects of nobiletin on LncRNA expression in pancreatic cancer cell lines（A and B）and LSINCT5 expression in cell lines（C）

2.4 LSINCT5促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖筆者運(yùn)用RNA干擾的方法，合成LSINCT5的干擾序列抑制其表達(dá)，觀察LSINCT5對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4A顯示，抑制LSINCT5表達(dá)后，MIAPaCa-2和PANC1細(xì)胞活力顯著降低，與對(duì)照組si-NC相比，在72 h和96 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4B顯示，將si-LSINCT5轉(zhuǎn)染進(jìn)入MIAPaCa-2和PANC1細(xì)胞48 h后，兩種胰腺癌細(xì)胞株分別為（0.42± 0.06）、（0.32± 0.05）mm2，菌落數(shù)量均明顯減少，與si-NC組（0.98±0.08）mm2相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 LSINCT5對(duì)胰腺癌細(xì)胞株增殖能力的影響Fig.4 Effect of LSINCT5 on the proliferation of pancreatic cancer cell lines

2.5 LSINCT5促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞周期進(jìn)展將LSINCT5干擾序列及對(duì)應(yīng)的si-NC序列分別轉(zhuǎn)染進(jìn)MIAPaCa-2和PANC1細(xì)胞株后，提取細(xì)胞總RNA后，進(jìn)行微陣列芯片分析。結(jié)果如圖5A所示，與si-NC組相比較，轉(zhuǎn)染LSINCT5干擾序列的細(xì)胞中，有20個(gè)與細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)出現(xiàn)異常（表達(dá)差異＞2倍）。其中，14個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，6個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。因此，接下來(lái)筆者采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LSINCT5對(duì)胰腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)展的影響情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LSINCT5干擾序列后，MIAPaCa-2處于G0/G1期細(xì)胞數(shù)量為（78.11±9.15）%，與si-NC組（58.15±6.19）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PANC1處于G0/G1期細(xì)胞數(shù)量為（74.19±8.51）%，與si-NC組（55.18±6.22%）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5B、5C。結(jié)果提示，LSINCT5誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖可能與其刺激細(xì)胞周期進(jìn)展、促進(jìn)G1期向S期轉(zhuǎn)移相關(guān)。

2.6 LSINCT5調(diào)節(jié)細(xì)胞周期關(guān)鍵因子的蛋白表達(dá)水平上述結(jié)果提示LSINCT5對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展有顯著地促進(jìn)作用，本部分采用Western Blot和RT-PCR的方法檢測(cè)LSINCT5對(duì)細(xì)胞周期關(guān)鍵因子Cyclin B1、CyclinE和P21表達(dá)影響，明確LSINCT5對(duì)細(xì)胞周期影響的內(nèi)在機(jī)制。結(jié)果如圖6顯示，將LSINCT5干擾序列轉(zhuǎn)染進(jìn)入MIAPaCa-2和PANC1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期關(guān)鍵因子CyclinB1、CyclinE的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，P21的mRNA和蛋白表達(dá)均升高，與si-NC相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果提示，LSINCT5直接或間接的影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)一步明確了LSINCT5對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期促進(jìn)作用潛在可能機(jī)制。

2.7 川陳皮素抑制胰腺癌細(xì)胞增殖與LSINCT5明顯相關(guān)上述結(jié)果提示LSINCT5促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖，川陳皮素對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并且胰腺癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)川陳皮素干預(yù)后，LSINCT5的表達(dá)降低，下一步探究LSINCT5是否作為關(guān)鍵因素參與川陳皮素的抑瘤作用。結(jié)果顯示，川陳皮素160 μmol/L干預(yù)MIAPaCa-2和PANC1細(xì)胞48 h后，si-NC組兩種細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制（圖7A），且細(xì)胞中LSINCT5表達(dá)均顯著降低（圖7B），與未加川陳皮素干預(yù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。但是川陳皮素干預(yù)48 h后，si-LSINCT5組兩種細(xì)胞的細(xì)胞活力沒(méi)有受到顯著抑制（圖7C、D），LSINCT5的表達(dá)變化也不明顯（圖7E）。結(jié)果表明，抑制LSINCT5表達(dá)后，川陳皮素對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用明顯減弱。

圖5 LSINCT5對(duì)胰腺癌細(xì)胞周期的微陣列芯片分析（A）和細(xì)胞株（B和C）細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effects of LSINCT5 on cell cycle by microarray chip analysis（A）and on pancreatic cancer cell lines and（B and C）

圖6 LSINCT5對(duì)細(xì)胞周期關(guān)鍵因子蛋白質(zhì)表達(dá)（A和C）和mRNA表達(dá)（B和D）的影響Fig.6 Effects of LSINCT5 on protein expression levels（A and C）and mRNA expression levels（B and D）of key cell cycle factors

3 討論

圖7 川陳皮素對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響及與LSINCT5的關(guān)系Fig.7 Effect of nobiletin on the proliferation of pancreatic cancer cells and its relationship with LSINCT5

LncRNA對(duì)細(xì)胞多個(gè)環(huán)節(jié)的生物學(xué)過(guò)程中所展現(xiàn)的調(diào)節(jié)功能逐漸受到醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、分子支架、DNA甲基化/去甲基化平衡、轉(zhuǎn)錄基因沉默等［13-17］。研究［18］顯示，LncRNA在不同的腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)出現(xiàn)異常，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA LSINCT5的表達(dá)量在正常細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)量具有顯著差異，隨后的功能研究揭示LSINCT5能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、提升細(xì)胞活力、刺激細(xì)胞周期進(jìn)展，在胰腺癌中可能起到促癌因子的作用。與LONG等［19］在乳腺癌和宮頸癌中的研究結(jié)論相一致。

LncRNAs在調(diào)控抑癌基因或者促癌基因表達(dá)中發(fā)揮了重要作用，可作為腫瘤診斷、治療方案選擇和預(yù)后判斷等的重要分子標(biāo)記物［20］。LncRNAs在中藥單體防治癌癥過(guò)程中是否發(fā)揮作用值得探討。本研究首先采用川陳皮素干預(yù)胰腺癌細(xì)胞株MIAPaCa-2和PANC1，篩選出最佳的藥物作用濃度及表達(dá)量變化最明顯的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。微陣列芯片發(fā)現(xiàn)川陳皮素干預(yù)后，多個(gè)LncRNAs的表達(dá)發(fā)生變化，其中以LSINCT5表達(dá)變化最為明顯。為了進(jìn)一步探明LSINCT5在川陳皮素抑制胰腺癌細(xì)胞增殖中的作用，筆者加入si-LSINCT5阻斷其表達(dá)豐度，發(fā)現(xiàn)川陳皮素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯降低。因此，筆者推測(cè)川陳皮素抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和LSINCT5明顯相關(guān)。

由于胰腺癌細(xì)胞中LSINCT5在川陳皮素處理后，表達(dá)下調(diào)最為明顯，其潛在機(jī)制與細(xì)胞生物學(xué)功能相關(guān)，功能研究表明抑制LSINCT5表達(dá)能夠明顯導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，處于G0/G1期的細(xì)胞百分比顯著增加。進(jìn)一步采用Western Blot和RT-PCR檢測(cè)抑制LSINCT5表達(dá)后，細(xì)胞周期變化相關(guān)基因表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)CyclinB1、CyclinE的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著降低，P21的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均升高。LSINCT5調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞增殖機(jī)制可能與細(xì)胞周期進(jìn)展有關(guān)，涉及到調(diào)控G1、S和M期進(jìn)展關(guān)鍵基因表達(dá)水平，與魏等在黑色素瘤中的研究結(jié)論相似［21］。

綜上所述，本研究首次報(bào)道LSINCT5調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞多個(gè)功能，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、刺激細(xì)胞周期進(jìn)展，LSINCT5可作為重要的促癌調(diào)節(jié)因子，可能是一個(gè)有效的治療胰腺癌的分子靶點(diǎn)；筆者還發(fā)現(xiàn)川陳皮素通過(guò)調(diào)控LSINCT5表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力，進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期，發(fā)揮抗腫瘤作用；為尋找有效的靶向作用LSINCT5的抑制劑或者天然抗腫瘤中藥提供了新思路，為胰腺癌的防治提供新的途徑和策略。本研究的不足之處未在體內(nèi)研究LSINCT5在胰腺癌中的功能，后續(xù)筆者將采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證LSINCT5的功能及川陳皮素抗腫瘤的新機(jī)制及途徑。