陳永勝 曾珊珊 鄭文英 賈小婷

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，廣州惡性腫瘤治療轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室（廣州510095）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤［1］。全國腫瘤登記中心公布我國2014年女性乳腺癌的發(fā)病率（新增病例27.89萬例）大約占到整個女性腫瘤的16.51%［2］。手術(shù)、放/化療以及免疫治療是乳腺癌常見的治療方式，但90%的乳腺癌患者還是死于遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移［3］。轉(zhuǎn)移是一個多基因多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過程［4］：細(xì)胞丟失其上皮細(xì)胞-細(xì)胞連接和頂端-基底細(xì)胞極性并轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂屑忓N狀細(xì)胞形狀和增加的低增殖狀態(tài)，從而遷移和侵入以產(chǎn)生或再生新的組織。轉(zhuǎn)移一直被認(rèn)為是進(jìn)展性乳腺癌的最終步驟［5］。但是目前轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未完全闡明，針對已有的靶點無法滿足臨床的治療需求。因此，闡述乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對于降低乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移率，提高乳腺癌診治水平具有非常重要的意義，也是醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域面臨的十分緊迫的重大課題。

筆者在前期通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)黏蛋白5B（mucin 5B，MUC5B）在乳腺癌組織中顯著高表達(dá)。MUC5B是黏蛋白家族蛋白，屬于高分子量的O-糖蛋白，通常在上皮細(xì)胞表面表達(dá)［6-8］。黏蛋白參與多種細(xì)胞基本的生命活動：保護(hù)和潤滑上皮細(xì)胞、維持上皮特征、細(xì)胞黏附、分化和免疫［9-12］。已顯示黏蛋白的表達(dá)在許多病理狀況如炎性腸病和瘤體形成中被改變［13-15］。筆者通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)MUC5B在乳腺癌中的表達(dá)量顯著高于其在正常組織中的表達(dá)量，且生物信息學(xué)預(yù)測MUC5B可能與高遷移率族蛋白組A1（human high mobility group A1，HMGA1）的表達(dá)正相關(guān)。本文擬在上述基礎(chǔ)上，探討MUC5B在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及具體的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞T47D、MDA-MB-231、MCF-7、HCC1937、ZR-75-30、BT549和 SKBR3均由本實驗室保存。乳腺癌細(xì)胞由1640（Gibco公司）完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的培養(yǎng)基配置如下：含有5%馬血清的DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基，依次加入表皮生長因子（20 ng/mL）、氫化可的松（0.5 μg/mL）和胰島素（10 μg/mL），培養(yǎng)條件與乳腺癌細(xì)胞一致。

1.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄購買RNA Isolation Kit I試劑盒（Omega公司）用于細(xì)胞總RNAs的提取。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，700 μL RTK裂解液處理細(xì)胞，加入700 μL無水乙醇，12 000g，4 ℃離心15 min。上清加入柱中，10 000g離心1 min。500 μL RW1洗滌柱子，10 000g離心 1 min。700 μL RW2洗滌柱子兩次?？账?，12 000g，3 min。用30 μL無核酶水溶解RNA，靜置2 min。12 000g離心2 min。-80℃保存RNA樣品。

根據(jù)說明書，配置逆轉(zhuǎn)錄體系如下：Random Primer 1 μL，RNA 4 μg，水補(bǔ)足12 μL。65 ℃ 5 min，立即冰置 2 min。加入 4 μL Reaction Buffer，1 μL RNase inhibitor，2 μL dNTP，1μL Reverse trscriptase。42℃ 1 h，70℃ 5 min。-20℃保存cDNA。

1.3 qRT-PCR方法根據(jù)說明書，配置qRT-PCR檢測體系：Forward primer 0.8 μL，SYBR 10 μL，cDNA 1 μL，Reverse primer 0.8 μL，用水補(bǔ)足20 μL體系。運(yùn)行程序：50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃15 s，60 ℃ 30 s（40個循環(huán)）。引物序列見表1，根據(jù) 2-ΔΔct值計算相對表達(dá)量。

表1 引物序列匯總Tab.1 Summary of primers in this study

1.4 Transwell將Transwell小室放在corning 24孔板中，50 μL無血清培養(yǎng)基加入上室，水化基底膜（置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中）。30 min后，給上室加入1×105細(xì)胞，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基。24 h后，固定小室（甲醇）10 min，棉簽擦拭上室的細(xì)胞，1%結(jié)晶紫染色細(xì)胞10 min，流動水沖洗小室，室溫晾干。

1.5 生物信息學(xué)預(yù)測UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）；The Human Protein Altas（https：//www.proteinatlas.org/）；starBase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法所有實驗重復(fù)3次以上，所有的數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MUC5B在乳腺癌中高表達(dá)如圖1A所示：在線數(shù)據(jù)庫UALCAN展示了MUC5B在1 097例乳腺癌組織中的表達(dá)量顯著高于其在144例癌旁組織中的表達(dá)量（P＜0.000 1）。這是MUC5B mRNA水平的表達(dá)模式，相同的蛋白質(zhì)水平表達(dá)模式見圖1B。在線數(shù)據(jù)庫The human altas通過免疫組化的方法證實MUC5B在7例乳腺癌中高表達(dá)，1例中表達(dá)，僅4例低表達(dá)。最后，本研究在乳腺正常上皮細(xì)胞MCF-10A及多種乳腺癌細(xì)胞中檢測MUC5B的表達(dá)量。qRT-PCR結(jié)果證實MUC5B在乳腺癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)。與MCF-10A相比，MUC5B在MDA-MB-231中的表達(dá)量上調(diào)7.31倍，在MCF-7中的表達(dá)量上調(diào)2.20倍（圖1C）。

圖1 MUC5B在乳腺癌中高表達(dá)Fig.1 MUC5B is enhanced in breast cancer

2.2 MUC5B促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲本研究在MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中干預(yù)MUC5B的表達(dá)。在MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MUC5B過表達(dá)質(zhì)粒，MUC5B表達(dá)量較對照組上調(diào)8.44倍（圖2A）。Transwell實驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比，MUC5B可明顯增加該細(xì)胞的侵襲能力（圖2B）。同樣的，在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染靶向MUC5B的干擾質(zhì)粒，qRT-PCR結(jié)果證實sh-MUC5B-1#沉默效果最好，可敲低81.67%的MUC5B表達(dá)量，用于后續(xù)研究（圖2C）。Transwell實驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比，敲低MUC5B后該細(xì)胞的侵襲能力較對照組明顯降低（圖2D）。

圖2 MUC5B調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力Fig.2 MUC5B modulated invasion of breast cancer cells

2.3 MUC5B促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制明確了MUC5B可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的作用后，本研究將重點探討其發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制。在線軟件starbase預(yù)測到MUC5B與HMGA1在1 104例乳腺癌組織中表達(dá)正相關(guān)（圖3A）。在MCF-7中過表達(dá)MUC5B，可上調(diào)HMGA1表達(dá)量至4.53倍，而在MDA-MB-231細(xì)胞中敲低MUC5B則可大大降低HMGA1的表達(dá)量（圖3B）。此外，本研究在MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)HMGA1，在MDAMB-231中敲低HMGA1。WB結(jié)果證實HMGA1表達(dá)量及敲低模型均成功建立（圖3C）。最后，通過transwell實驗發(fā)現(xiàn)：在MCF-7中過表達(dá)MUC5B，可明顯增加該細(xì)胞侵襲能力，但是同時過表達(dá)MUC5B和敲低HMGA1，可大大降低該細(xì)胞的侵襲能力（圖3D）；同樣的，在MDA-MB-231細(xì)胞中敲低MUC5B，則該細(xì)胞侵襲能力減弱，但若同時敲低MUC5B和過表達(dá)HMGA1，又可以逆轉(zhuǎn)該細(xì)胞的侵襲能力（圖3D）。提示MUC5B通過HMGA1發(fā)揮促乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

圖3 MUC5B通過調(diào)控HMGA1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移Fig.3 MUC5B promoted breast cancer cells invasion via accelerating HMGA1

3 討論

MUC5B在乳腺癌中的作用備受關(guān)注。有學(xué)者在乳腺癌細(xì)胞中敲低MUC5B的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞的黏附性、細(xì)胞生長、克隆形成能力均較對照組顯著降低，但是細(xì)胞并未發(fā)生凋亡。同時還發(fā)現(xiàn)MUC5B與乳腺癌較差的化療敏感性有關(guān)，降低MUC5B將促進(jìn)乳腺癌化療增敏［16］。MUC5B在體外側(cè)近細(xì)胞增殖和浸潤，在體內(nèi)可促進(jìn)瘤體生長和細(xì)胞擴(kuò)散［17］。與此相一致的是，本研究在乳腺癌細(xì)胞中敲低MUC5B，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞的侵襲能力降低，反之亦然。為探討MUC5B在乳腺癌中的作用機(jī)制，本研究通過生物信息學(xué)及實驗驗證發(fā)現(xiàn)MUC5B上調(diào)HMGA1。HMGA1是核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合到富含AT區(qū)域的DNA鏈上，調(diào)控下游效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄活性［18］。HMGA1通常在胚胎發(fā)育中表達(dá)量較高，而在成熟組織中低表達(dá)［19］。HMGA1在多種腫瘤中高表達(dá)，且HMGA1通常與轉(zhuǎn)移和患者較差的預(yù)后正相關(guān)［20］。這是因為HMGA1可以調(diào)控多種參與細(xì)胞增殖和DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)［21］。此外，還發(fā)現(xiàn)HMGA1是晚期糖基化終產(chǎn)物特異性受體（receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）的配體，可以活化ERK信號通路，參與細(xì)胞黏附、遷移與轉(zhuǎn)移等能力［22］。與這些結(jié)果一致的是，在本研究中發(fā)現(xiàn)HMGA1可以逆轉(zhuǎn)敲低MUC5B引起的乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱。而在MCF-7細(xì)胞中敲低HMGA1可以逆轉(zhuǎn)因過表達(dá)MUC5B而引起的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。后續(xù)筆者將進(jìn)一步探討MUC5B調(diào)控HMGA1的分子機(jī)制。