郝語晨 畢愷欣 劉曉青 徐毅 陶新楠 張亞芬山西醫(yī)科大學(xué)（太原030000）；山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院（太原0300）

國際癌癥研究中心發(fā)布的2018年全球癌癥統(tǒng)計報告顯示乳腺癌居于全球女性癌癥發(fā)病率首位，而我國人口基數(shù)龐大是不容忽視的乳腺癌大國［1］。根據(jù)世界癌癥生存研究CONCORD發(fā)布的最新數(shù)據(jù)，我國乳腺癌年齡標(biāo)化生存率為83.2%，比澳大利亞、美國等西方發(fā)達國家的同期數(shù)據(jù)落后6%左右［2］，延長生存時間、降低病死率是我國乳腺癌疾病管理的重點。PD-1/PD-L1檢查點（programmed cell death-1/programmed death ligand-1 checkpoint）及其抑制劑是最近幾年腫瘤免疫學(xué)中備受矚目的研究熱點［3-4］，其理論基礎(chǔ)是腫瘤的免疫逃逸機制：正常生理條件下，人體免疫系統(tǒng)存在促進自我耐受防止自身免疫的機制，即T細(xì)胞被激活時其表面PD-1表達增加，而攻擊性炎癥因子IFN-γ、TNF-α等刺激特異性免疫細(xì)胞表達其配體PD-L1和PD-L2，其中主要為PD-L1，當(dāng)PD-1與其配體PD-L1結(jié)合時，經(jīng)過一系列酶聯(lián)反應(yīng)抑制下游的PI3K/AKt/mTOR通路，進而抑制T細(xì)胞功能，而腫瘤細(xì)胞恰恰習(xí)得這種逃避免疫攻擊的方法，在其細(xì)胞表面大量表達PD-L1，實現(xiàn)免疫逃逸，參與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為［5-6］。

腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）均有PD-L1表達［5-6］，本研究關(guān)注PD-L1在上述兩類細(xì)胞的表達特點，分別探索對生存預(yù)后有無預(yù)測價值。PD-L1在三陰性、Her-2過表達型乳腺癌的預(yù)后預(yù)測價值已被大量研究［7-13］證實，即PD-L1表達越多，提示預(yù)后越差。然而三陰性、Her-2過表達型并非最常見亞型，僅占乳腺癌總體的不到30%，上述研究發(fā)現(xiàn)的普適意義有限，因此筆者認(rèn)為，進一步研究最常見亞型（即Luminal型）對臨床的預(yù)后預(yù)測和治療指導(dǎo)意義更大。為避免Her-2陽性患者赫賽汀治療不規(guī)范影響預(yù)后分析，本研究僅納入Luminal（Her-2陰性）型病例。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究為歷史前瞻性研究。本研究入組2013年1-12月于山西省人民醫(yī)院乳腺外科住院治療的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌病例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）女性；（2）乳腺癌分期較早可行規(guī)范手術(shù)治療者；（3）病理類型為浸潤性導(dǎo)管癌；（4）分子類型為Luminal（Her-2陰性）型；（5）相關(guān)病例資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）本次診斷為雙側(cè)乳腺癌；（2）既往或本次治療期間有乳腺或其他原發(fā)惡性腫瘤病史；（3）因患者無法承受或患者意愿等行姑息性手術(shù)者；（4）內(nèi)分泌治療不規(guī)范。

1.2 方法

1.2.1 臨床數(shù)據(jù)年齡（以身份證出生年月為準(zhǔn)）；月經(jīng)狀態(tài)（絕經(jīng)定義為雙側(cè)卵巢切除術(shù)后/年齡≥60歲/年齡＜60歲，自然停經(jīng)≥12個月/FSH和雌二醇處于絕經(jīng)后范圍）；乳腺/婦科合并癥（定義為乳腺纖維瘤、乳管內(nèi)乳頭狀瘤/子宮肌瘤、卵巢囊腫等與雌性激素紊亂相關(guān)的乳腺/婦科良性疾?。?；家族史（定義為直系親屬有惡性腫瘤病史）。

1.2.2 病理數(shù)據(jù)病理學(xué)分級、ER%、PR%、TIL%、Ki-67、TNM分期（依據(jù)AJCC第九版，記為Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期）、分子分型［將Luminal型分為Luminal A型，即ER和/或PR陽性、Ki-67＜14%且Her2陰性；Luminal B（Her2-），即ER和（或）PR陽性、Ki-67≥14%且Her2陰性］。

1.2.3 治療情況手術(shù)時間及方式、術(shù)后輔助治療類型、具體藥物方案。

1.3 免疫組化本研究采用免疫組化二步法。PD-L1抗體試劑選用中山金橋兔單克隆一抗，克隆號為SP142。PD-L1在腫瘤細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)表達記為TC（tumor-cell），在TILs表達記為IC（immuno-cell），采用David E等的評分方法［14］，即計算PD-L1表達細(xì)胞在腫瘤區(qū)域的占比，以百分比表示（即TC%/IC%）；選取1%、5%、10%為截點，即＜1%記為TC/IC0分，≥1%且＜5%記為TC/IC1分，≥5%且＜10%記為TC/IC2分，≥10%記為TC/IC3分。TC和IC的cut-off值均為1，即0分為陰性表達，1、2、3分為陽性表達。

查閱病理報告并記錄病理學(xué)分級，調(diào)取原始H&E切片判讀ER%、PR%、Her-2±FISH、Ki-67、TIL%。ER、PR判讀參照我國《乳腺癌雌、孕激素免疫組織化學(xué)檢測指南（2015版）》。Her-2判讀采用2017年ASCO-CAP會議發(fā)布的最新指南［15］。TILs%判讀根據(jù)國際TILs工作組2015年版的推薦進行［16］。閱片結(jié)果由高年資病理科醫(yī)師審核確認(rèn)。

ER%、PR%、Ki-67采用SOFT&TEXT試驗［17］的截點進行分層，即：ER%分層為＜50、≥50；PR%分層為＜20、20～ 49、≥ 50；Ki-67分層為＜14、14～ 19、20～25、≥26。病理學(xué)分級分為1/2/3級。TIL%選取30%、60%為截點，即＜30%記為TIL（1+），≥30%且＜60%記為TIL（2+），≥60%記為TIL（3+）。

1.4 隨訪通過電話、門診等方式隨訪患者院外內(nèi)分泌治療情況及生存情況。生存事件定義為與乳腺癌疾病進展相關(guān)的死亡。隨訪時間為開始內(nèi)分泌治療到內(nèi)分泌治療滿5年。計算總生存期（overall survival，OS）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 25.0進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對其進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)性分布者進行獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)性分布者進行秩和檢驗。計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗。運用Cox生存分析判斷復(fù)發(fā)和生存預(yù)后的獨立因素。運用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較使用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料本研究共納入225例Luminal型乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者，年齡21～78歲，平均（51.17±11.32）歲，中位年齡50歲；左乳癌109例，右乳癌117例。5年生存率為88.9%（200/225）。OS事件23例；刪失19例，其中16例失訪，3例死于其他疾病。

2.2 腫瘤組織中PD-L1表達特點PD-L1在腫瘤細(xì)胞和TILs均有表達，見圖1。225個樣本中有86（38.2%）個樣本的腫瘤細(xì)胞PD-L1陽性表達，24（10.7%）個樣本的TILs PD-L1陽性表達。納入指標(biāo)的賦值見表1。

圖1 PD-L1在乳腺癌組織的表達Fig.1 PD-L1 expression in breast cancer tissue

表1 相關(guān)因素賦值說明Tab.1 Related factors and assignment instructions

2.2.1 PD-L1的表達與臨床指標(biāo)的關(guān)系對年齡、月經(jīng)狀態(tài)、合并癥、家族史、分期分析顯示：腫瘤細(xì)胞和TILs中PD-L1的表達僅在不同分期時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.2.2 PD-L1的表達與病理指標(biāo)的關(guān)系對ER%、PR%、Her2狀態(tài)、TIL評分、Ki-67、分子分型統(tǒng)計學(xué)分析顯示，不同PR%、TIL評分、Ki-67、分子分型的PD-L1在腫瘤細(xì)胞和TILs的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），另外ER%（P=0.046）也是TILs中PD-L1表達的影響因素，見表3。

2.3 Cox回歸分析計算生存狀態(tài)的危險因素，由結(jié)果可見，IC評分（RR=2.375，P＜0.01）、PR（RR=0.926，P＜0.01）、Ki-67（RR=1.026，P=0.01）和病理學(xué)分級（RR=4.137，P＜0.01）是生存的獨立危險因素，而TC評分在單因素分析時有意義，多因素分析時差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明其受其他混雜因素影響，不能獨立影響生存預(yù)后。見表4。

表2 PD-L1表達與臨床指標(biāo)的關(guān)系Tab.2 Relationship between PD-L1 expression and clinical indicators 例（%）

表3 PD-L1表達與病理指標(biāo)的關(guān)系Tab.3 Relationship between PD-L1 expression and pathological indicators 例（%）

表4 生存狀態(tài)的危險因素分析Tab.4 Risk factor analysis of survival status

2.4 生存情況的比較對生存情況分析發(fā)現(xiàn)，IC陽性組患者生存率為37.5%（9/24），低于IC陰性組患者生存率96.0%（193/201），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=117.7，P＜0.001）。生存曲線見圖2。

3 討論

圖2 IC陰性組（n=201）和陽性組（n=24）（TILs中PD-L1表達陰性/陽性）的生存曲線Fig.2 Survival curves of IC negative group（n=201）and positive group（n=24）（negative/positive PD-L1 expression in TILs）

既往研究［7，12，18-19］報道 PD-L1 在 Luminal型乳腺癌細(xì)胞的陽性率為14.8%～53.1%，本研究中PD-L1在腫瘤細(xì)胞陽性率為38.2%，與上述報道基本一致。之前的研究［12，18，20］僅統(tǒng)計腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達，或不區(qū)分腫瘤細(xì)胞和TILs，籠統(tǒng)地記為腫瘤組織的表達［21］，據(jù)筆者所知，大部分學(xué)者沒有關(guān)注PD-L1在TILs的表達并作為一個獨立指標(biāo)進行研究，因而其陽性率鮮有報道。筆者認(rèn)為腫瘤微環(huán)境的主要有形成分為腫瘤細(xì)胞和TILs，綜合考慮兩者的PD-L1表達情況不僅能反映腫瘤的免疫逃逸能力，而且能夠研究免疫系統(tǒng)的應(yīng)答狀態(tài)，與單獨研究腫瘤細(xì)胞相比更為嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)。目前腫瘤細(xì)胞陽性表達的判讀標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，有的研究［7，21］僅認(rèn)可細(xì)胞膜的著色，而有的研究［10，12，18，22］將細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)的著色均判定為陽性表達，因此相關(guān)研究結(jié)果可比性較低，難以匯總分析形成大數(shù)據(jù)支持的結(jié)論，亟待統(tǒng)一公認(rèn)的判讀標(biāo)準(zhǔn)。

本研究發(fā)現(xiàn)：PD-L1表達水平與病理學(xué)分級、ER、PR、Ki-67、分期顯著相關(guān)，PD-L1陽性組織較陰性組織病理學(xué)分級較高、ER%較低、PR%較低、TIL評分較高、Ki-67較高、分期較晚，Luminal B（Her2-）型陽性率顯著高于Luminal A型，換言之，無論腫瘤組織或TILs中，PD-L1陽性均提示腫瘤惡性程度較高，預(yù)后預(yù)期較差，這一結(jié)論可用腫瘤免疫逃逸來解釋。

單因素和多因素生存分析均顯示TIL不是生存的影響因素，與其他研究［8，23-24］的發(fā)現(xiàn)一致。而χ2檢驗提示不同TILs評分組織的PD-L1表達顯著不同，TILs中PD-L1的表達是死亡的獨立危險因素，因此筆者推測結(jié)合TILs和PD-L1能夠提供預(yù)后預(yù)測的額外信息。本研究發(fā)現(xiàn)TILs中PD-L1表達是生存的獨立危險因素，腫瘤細(xì)胞的PD-L1表達僅在單因素生存分析時是獨立危險因素，而Luminal A型和Luminal B Her2-型的PD-L1在腫瘤細(xì)胞和TILs的表達情況差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，因此筆者考慮該結(jié)論與入組人群中Luminal A型和Luminal B Her2-型相對比例有關(guān)，后續(xù)研究將對Luminal型進一步細(xì)化分析。

PR狀態(tài)、Ki-67和病理學(xué)分級是公認(rèn)的預(yù)后預(yù)測因素。PAN等［25］對EBCTCG數(shù)據(jù)庫中500 692例激素受體陽性早期乳癌患者內(nèi)分泌治療5年后20年隨訪研究發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)狀態(tài)在任意時間段都是強預(yù)測因子，組織學(xué)分級和Ki-67是最初5年預(yù)后的重要獨立預(yù)測因子，但在后續(xù)時間段僅具有中等預(yù)測效力。ORUCEVIC等［26］根據(jù)TAILORx研究的最新結(jié)果對復(fù)發(fā)預(yù)測風(fēng)險評分檢驗，納入年齡、腫瘤大小、病理學(xué)分級、PR狀態(tài)和組織學(xué)類型分析發(fā)現(xiàn)病理學(xué)分級和PR狀態(tài)是5個臨床病理特征中復(fù)發(fā)風(fēng)險評分高低的最強預(yù)測因素。本研究對納入人群隨訪5年，生存分析結(jié)果與上述研究相一致，由于Luminal型乳腺癌與其他亞型相比5年后仍有較高復(fù)發(fā)率，筆者將繼續(xù)隨訪以獲取各個時間段腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞PD-L1表達預(yù)測意義的變化。

腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞都能激活PD-1/PD-L1檢查點，上調(diào)PD-L1的表達，負(fù)性調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)［20］。目前研究較為透徹的機制主要為兩條信號通路的激活［27］：PI3K/AKt/mTOR激活介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號通路和IFNGRs/JAK/STAT激活介導(dǎo)的細(xì)胞外信號通路。CHEN等［28］報道IFNγ上調(diào)外泌體PD-L1表達水平，抑制免疫和促瘤生長；外泌體PD-L1水平變化能夠預(yù)測治療后腫瘤細(xì)胞對T細(xì)胞再活化的適應(yīng)性反應(yīng)水平。筆者認(rèn)為，TILs和外泌體中的PD-L1水平都能反映腫瘤與免疫系統(tǒng)抗衡的結(jié)果，其變化規(guī)律是治療反應(yīng)性的重要預(yù)測因子，對指導(dǎo)臨床工作具有重要意義，例如對于需要新輔助治療的晚期乳腺癌患者，穿刺獲取組織中PD-L1的表達情況，為患者初始治療時選擇的個體化治療方案，未來條件允許時，密切檢測血液中PD-L1水平變化，掌握免疫系統(tǒng)受壓制程度變化，及時調(diào)整用藥選擇。

綜上，PD-L1在TILs的表達對生存預(yù)后具有一定的預(yù)測價值，可為臨床醫(yī)師預(yù)后判斷及治療選擇提供一定指導(dǎo)。