(浙江工業(yè)大學 海洋學院，浙江 杭州，310014)

珊瑚菌，泛指子實體直立，呈簡單棒狀、珊瑚狀、片狀、角狀、甚至猴頭狀的一類腐生或土生的真菌[1]，隸屬珊瑚菌科。珊瑚菌營養(yǎng)豐富，功能性物質種類較多，具有較好的醫(yī)用價值及保健功效[2-3]。研究表明，從珊瑚菌子實體和菌絲體中得到的多糖具有抗氧化活性[4-6]。目前，對于珊瑚菌的研究多限于資源調查、鑒定分類、液體培養(yǎng)、大分子物質提取工藝及化學成分的研究，關于珊瑚菌多糖純化的研究也有過報道[7-10]。董芳等[11]采用熱水浸提法提取珊瑚菌多糖，經(jīng)樹脂脫色、醇沉、Sevage法脫蛋白、DEAE-52柱層析和蒸餾水透析得到多糖RBP-I。

筆者采用水提醇沉法從珊瑚菌中提取粗多糖，再經(jīng)DEAE sepharose fast flow離子柱、Sephacryl G-25和S-400 High-resolution凝膠柱進一步分離純化，得到均一多糖RFPF2A，此前關于該多糖組分的研究還未見報道。采用紅外光譜掃描(IR)、高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)、核磁共振(NMR)分析其結構及單糖組成。通過不同的抗氧化試驗方法測定了RFPF2A的羥基自由基清除能力、超氧陰離子清除能力、亞鐵離子金屬螯合能力和總還原力，為珊瑚菌多糖用于保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

珊瑚菌子實體干品(Ramariaflava)購于四川省川珍實業(yè)有限公司；填料DEAE-sepharose fast flow，Sephacryl G-25和S-400 High-resolutuion購于美國GE公司；吩嗪硫酸鉀脂(PMS)、還原型輔酶(NADH)、氯化硝基四氮唑蘭(NBT)、硫代巴比妥酸(TBA)、菲咯嗪、脫氧核糖、葡聚糖、三氟乙酸(TFA)和單糖標準品(L-鼠李糖(L-Rha)、L-阿拉伯糖(L-Ara)、L-巖藻糖(D-Fuc)、D-葡萄糖(D-Glc)、D-木糖(D-Xyl)、D-半乳糖(D-Gal)、D-甘露糖(D-Man))購于美國Sigma-Aldrich化學試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設備

高效液相色譜柱TSKgel G4000PWXL，日本TOSOH公司；傅里葉紅外光譜儀(Nicolet 6700)，Nicolet Continu μm紅外顯微系統(tǒng)，Thermo Electron公司；AVANCE III傅里葉超導核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司；XK 16 mm×100 cm、XK 26 mm×100 cm層析柱，美國GE公司；Finnigan Trace Ultra-DSQ II氣相質譜聯(lián)用儀，氣相柱采用TG-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Thermo Fisher公司。

1.3 方 法

1.3.1 珊瑚菌均一多糖RFPF2A的制備

取珊瑚菌子實體干品600 g，0.45 mm過篩，25 ℃下用10倍體積的95%乙醇(體積分數(shù))脫脂12 h。脫脂后加入25倍蒸餾水，沸水提取2 h，過濾，收集清液，再加入95%乙醇進行分級醇沉，冷凍干燥后得到粗多糖RFPF30，上清液繼續(xù)加入95%乙醇至終體積分數(shù)達到60%，得到粗多糖RFPF60。采用DEAE sepharose fast flow離子柱、Sephacryl G-25和S-400 High-resolution凝膠柱層析對RFPF60進行分離純化得到均一性多糖RFPF2A[12]。

1.3.2 RFPF2A分子質量的測定

采用高效液相色譜法測定RFPF2A分子質量[13]。高效液相色譜系統(tǒng)：Water 1525，色譜柱TSKgel G4000PWXL，示差檢測器Water 2414，以超純水為流動相，流速為1 mL/min，樣品進樣量為1 μL，柱溫(30.0±0.1) ℃。

準確稱取分子質量已知的T-系列Dextran標準品(分子質量分別為1，5，12，80，150，270，670 kDa)，將各標準品用超純水溶解，配制成2 mg/mL的標準品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾后進樣。以多糖標樣的保留時間(min)為橫坐標、以lgMw為縱坐標制作標準曲線圖。

1.3.3 單糖組成分析

采用氣相色譜-質譜聯(lián)用法分析RFPF2A組分的單糖組成。根據(jù)何晉浙等[14]試驗方法進行乙?；瘜嶒?。乙酰化后的產(chǎn)物使用Trace 1300/ISQ氣相-質譜聯(lián)用色譜儀進行分析，檢測器為氫火焰離子檢測器(FID)，色譜柱采用TG-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為高純氮氣，流速為1.0 mL/min。溫度程序設定為：初始溫度120 ℃保持1 min，以10 ℃/min升溫至240 ℃，保持6.5 min。接口溫度、離子源溫度定為250 ℃，1.0 μL進樣，分流比1∶30，質量掃描范圍40～500 amu，掃描時間0.28 s。

標準單糖樣品乙?；壕_稱量等摩爾(2 mmol/L)單糖標品(L-Rha，L-Ara，L-Fuc，D-Glc，D-Xyl，D-Gal，D-Man)分別溶于3 mL蒸餾水中，配制成單糖的單標溶液；精確稱量等摩爾(2 mmol/L)單糖標品(L-Rha，L-Ara，L-Fuc，D-Glc，D-Xyl，D-Gal，D-Man)混合溶于3 mL蒸餾水中，配制成單糖的混標溶液。加入適量硼氫化鈉后密封并間歇振蕩3 h，后用冰醋酸中和過量的NaBH4。加入少量甲醇混勻并減壓蒸干，真空干燥器中靜置24 h，110 ℃烘箱干燥15 min，后加入4.0 mL醋酐，100 ℃下反應1 h。冷卻至室溫后加入甲苯，減壓蒸干。用氯仿溶解后加入等體積蒸餾水充分混勻，加入適量無水硫酸鈉干燥，過0.45 μm有機膜待GC-MS分析。

樣品乙?；? mg樣品用TFA(2 mol/mL，4 mL)110 ℃水解2 h，用甲醇夾帶旋干TFA，加入30 mg NaBH4，后續(xù)與標準單糖乙?；襟E相同。

樣品甲基化：2 mg多糖樣品溶于0.5 mL DMSO中，加入0.6 mL NaOH-DMSO(0.025 g/mL)和0.6 mL 碘甲烷進行甲基化反應[15]。

1.3.4 紅外光譜分析

稱取2 mg多糖純品，放入真空干燥器中過夜以除去多余水分，用溴化鉀壓片后進行紅外光譜掃描，掃描波長范圍選擇400～4 000 cm-1。

1.3.5 核磁共振分析

稱量多糖樣品30 mg，用0.5 mL重水(D2O)溶解，重復凍干，D2O復溶3次，采用500 MHz核磁共振儀測定，25 ℃lH NMR用HDOδ為內標，13C NMR的化學位移用飽和3-三甲基硅丙烷磺酸鈉的重水溶液(D2O+DSS)為外標[16]。

1.4 抗氧化實驗

1.4.1 羥基自由基清除能力

參照Chen等[17]的方法測定。樣品溶解于蒸餾水中使樣品質量濃度為0～5.0 mg/mL，0.2 mol/L pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，2.67 mmol/L脫氧核糖和0.13 mmol/L EDTA混合配成反應緩沖溶液。取0.1 mL樣品溶液與0.6 mL反應緩沖液混合，依次添加0.2 mL 0.4 mmol/L的亞鐵硫酸銨，0.05 mL 2.0 mmol/L的抗壞血酸以及0.05 mL 20 mmol/L的H2O2。反應體系在37 ℃下反應15 min。然后向混合物中加入1 mL 10 g/L的TBA，1 mL 20 g/L的TCA。渦旋振蕩后，沸水浴15 min，然后在冰水浴中冷卻。在532 nm處測定其吸光度?？寡趸钚?AA)用羥基自由基清除能力表示，其計算公式為

(1)

式中：A樣品表示被測樣品的吸光度；A空白表示以去離子水代替樣品的空白吸光度。

1.4.2 超氧自由基清除能力

參考Jia等[18]的方法測定。將樣品溶于蒸餾水中使樣品質量濃度為0～5.0 mg/mL，配制16 mmol/L，pH 8.0的Tris-HCl，分別取0.1 mL各質量濃度的樣品溶液，依次加入含557 μmol/L NADH的Tris-HCl 1 mL，含45 μmol/L PMS的Tris-HCl 1 mL，含108 μmol/L NBT的Tris-HCl 1 mL。在25 ℃水浴條件下恒溫反應5 min，測定560 nm處的吸光度。按照上述式(1)計算超氧自由基清除能力。

1.4.3 亞鐵離子金屬螯合能力測定

參考Gao等[19]的方法測定。1 mL不同質量濃度的樣品(0～5.0 mg/mL)與3.7 mL甲醇，0.1 mL 2 mmol/L FeCl2混合，加入0.2 mL 5 mmol/L的菲洛嗪觸發(fā)反應，室溫下高速振蕩10 min，在562 nm處測定吸光度。吸光度越低表示螯合能力越強。按照上述式(1)計算亞鐵離子螯合能力。

1.4.4 還原力測定

參照吳振等[20]的方法測定。配制質量濃度為0～5.0 mg/mL的樣品。分別取2.5 mL樣品，加入2.5 mL pH值為6.6，濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 10 g/L的K3Fe(CN)6，混合后在50 ℃下水浴20 min。加入2.5 mL 100 g/L的TCA終止反應，離心10 min，取上清液加5 mL水和1.2 mL 1 g/L的FeCl3，振蕩混勻，在700 nm處測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 RFPF2A結構分析

2.1.1 RFPF2A相對分子質量的測定

RFPF2A的高效液相色譜圖如圖1所示，RFPF2A的洗脫譜圖呈對稱峰，由此判斷其為均一組分的多糖。通過峰面積計算表明多糖的純度達到90%以上，RFPF2A保留時間為6.582 min，根據(jù)保留時間計算得到分子量為9.87×102kDa。

圖1 RFPF2A的HPLC曲線Fig.1 Curve of RFPF2A with HPLC

2.1.2 RFPF2A單糖組成分析

7 種單糖混標的GC-MS譜圖如圖2所示，由表1和圖2確定混標中各單糖的出峰順序依次為L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、L-巖藻糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖。表1中的RSD1為6 次重復試驗的相對標準偏差值，RSD2為6 次平行試驗的相對標準偏差值，兩個相對標準偏差RSD1和RSD2均小于5%，說明本實驗采用的乙?；椒刹僮餍暂^好，可用于后續(xù)實驗分析。

圖2 混合標準品乙?；苌锏臍赓|色譜圖Fig.2 GC-MS of acetyl derivatives of complex standard monosaccharides

表1 混合標準品氣相色譜結果及分析Table 1 Results and analysis of the monosaccharides in standard sample

RFPF2A的氣質譜圖如圖3所示，通過與混標譜圖及各個峰保留時間處的質譜圖對比可知：RFPF2A主要含有D-葡萄糖，另外還含有少量的D-半乳糖、D-甘露糖，其摩爾比為1.00∶0.15∶0.26。董芳等[11]通過熱水浸提、樹脂脫色、分級醇沉和脫蛋白后得到均一多糖組分RBP-I，其分子質量為15 857 Da，主要由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其摩爾比為1.00∶6.53∶1.99∶8.29∶70.05∶53.80。分析原因，可能是因為原料來源及提取方法不同，從而得到的多糖組分結構存在差異性。

圖3 RFPF2A的乙酰化衍生物的氣質譜圖Fig.3 The GC-MS spectrum of acetyl derivatives from RFPF2A

2.1.3 RFPF2A甲基化分析

表2顯示的是RFPF2A甲基化單糖以及單糖連接位點。多糖經(jīng)兩次酸水解的甲基化之后，部分甲基化的糖成為甲基化糖醇乙酸酯。由甲基化分析的最終結果得出RFPF2A的糖殘基是由2,3,6-三-O-甲基化甘露糖，3,4-二-O-甲基化半乳糖和2,3,4-三-O-甲基化葡萄糖組成。

表2 RFPF2A的甲基化分析結果Table 2 Results of methylation analysis of RFPF2A

2.1.4 紅外光譜分析

圖4 RFPF2A的紅外光譜分析Fig.4 IR spectra of RFPF2A

2.1.5 核磁共振分析

NMR是主要用于解釋多糖結構中糖苷鍵的構型和重復結構單元中單糖數(shù)目的一種分析方法[27-28]。圖5(a)為RFPF2A 25 ℃的1H NMR譜，從圖中可知：RFPF2A在異頭氫區(qū)的共振區(qū)域主要有一個異頭氫的共振峰，且裂分為δ=4.48和δ=4.50的兩個峰，在δ=4.69處有一個強的HDO的共振峰，為了避免強HDO峰掩蓋部分異頭氫的信號，采用圖5(b)60 ℃的1H NMR譜與其進行比較。比較圖5(a)和圖5(b)，發(fā)現(xiàn)主要有一個異頭氫δ=4.53的共振峰，此外還有含量很低的兩個小振動峰，此外還可以發(fā)現(xiàn)無氧甲基信號，主要的殘基C裂分為兩個峰，且J1,2約為8 Hz，說明其為β-吡喃葡萄糖構型，與紅外光譜分析結果相符。

圖5 RFPF2A的1H NMR圖譜Fig.5 1H NMR spectra of RFPF2A

糖的異頭碳信號在δ為100.71～104.26區(qū)域，參考13C NMR譜圖6(a)可知，在δ=105.79處有一明顯異頭碳，另外兩異頭碳不明顯。13C NMR 譜上δ為82～88處無共振信號，說明糖殘基為吡喃型糖苷。從13C NMR譜的DEPT-135譜圖6(b)可知：在δ=71.64處出現(xiàn)反峰，說明該組分含六位取代的殘基，而δ=63.45處負峰為六位未取代的碳信號，結果與甲基化分析結果相符。

圖6 RFPF2A的13C-NMR圖譜Fig.6 13C-NMR spectra of RFPF2A

2.2 RFPF2A抗氧化活性

2.2.1 羥基自由基清除能力

羥基自由基是活性氧中最活潑的自由基，也是毒性最大的自由基，幾乎能與活細胞中任何分子發(fā)生反應，對于篩選、評價具有清除自由基能力的功能食品有著重要意義。RFPF2A的羥基自由基清除能力如圖7所示，由圖7可知：RFPF2A具有一定的清除羥基自由基的能力，且隨著質量濃度的增加而增加。王麗娟等[4]以珊瑚菌為原料，研究了珊瑚菌多糖的提取及其對羥自由基的清除作用，發(fā)現(xiàn)當粗多糖的質量濃度為5 mg/mL時，羥基自由基清除能力可達到60%以上，說明經(jīng)本實驗分離純化后的珊瑚菌多糖RFPF2A清除羥基自由基的能力明顯高于同質量濃度的珊瑚菌粗多糖，有著較好的羥基自由基清除能力。

圖7 RFPF2A對羥基自由基的清除能力Fig.7 Hydroxyl radical scavenging ability of RFPF2A

2.2.2 超氧陰離子清除能力

在細胞的氧化反應中，通常首先形成的是超氧自由基，當產(chǎn)生其他類型的細胞損壞自由基和氧化物質時，其對細胞的破壞效果更大。加入抗氧化劑會引起吸光度值的下降，表明混合物中的超氧陰離子自由基被消耗。RFPF2A的超氧陰離子清除能力如圖8所示，實驗表明：隨著樣品質量濃度的增加，RFPF2A對超氧陰離子的清除能力也隨之加強。在低質量濃度時Vc的清除能力明顯優(yōu)于RFPF2A，當質量濃度為2.5 mg/mL時，RFPF2A對超氧陰離子自由基的清除率為51.6%，高于相同質量濃度的米胚多糖對超氧陰離子自由基的清除能力[29]。當質量濃度達到5 mg/mL時RFPF2A的清除能力達到74.47%，說明RFPF2A的超氧陰離子清除能力較好。

圖8 RFPF2A對超氧陰離子的清除能力Fig.8 The ability of RFPF2A to remove superoxide anions

2.2.3 亞鐵離子金屬螯合能力

鐵離子在生物體內能夠引發(fā)脂質過氧化，并導致羥基自由基的產(chǎn)生，因此鐵離子鰲合能力也是一個重要的評價抗氧化能力的指標。RFPF2A的亞鐵離子金屬螯合能力如圖9所示，隨著質量濃度的增加，RFPF2A對金屬的螯合能力逐漸加強；當RFPF2A達到最高質量濃度5 mg/mL時，它的螯合能力達到61.82%，高于同質量濃度蛹蟲草多糖的螯合能力[30]，說明RFPF2A具有較好的亞鐵離子螯合能力。

圖9 RFPF2A的金屬螯合能力Fig.9 Metal chelation capabilities of RFPF2A

2.2.4 還原力

化合物的還原力可作為化合物具有潛在抗氧化活性的重要指標。RFPF2A的還原力如圖10所示，結果顯示：RFPF2A具有較強的還原力作用，且還原力與多糖質量濃度呈正相關，隨著質量濃度的上升RFPF2A還原力作用增強。當RFPF2A質量濃度為2 mg/mL時，其還原力吸光值達到1.106，明顯大于同質量濃度下虎斑烏賊肌肉多糖的還原力吸光值[31]；且當RFPF2A質量濃度為5 mg/mL時，其還原力吸光值達到1.506，基本與Vc相同。

圖10 RFPF2A的還原力Fig.10 Reducing power of RFPF2A

3 結 論

通過水提醇沉法提取RFPF60組分，再經(jīng)DEAE-sepharose fast flow離子柱、Sephacryl G-25和S-400 High-resolution凝膠柱層析進一步分離純化得均一多糖組分RFPF2A；通過HPLC得RFPF2A平均分子質量為9.87×102kDa；乙?；Y果得出RFPF2A多糖由D-葡萄糖、D-半乳糖和D-甘露糖組成，其摩爾比為1∶0.15∶0.26；甲基化分析RFPF2A主要由1，6連接的葡萄糖構成，此外還有少量1，4連接的甘露糖和少量1，2，6連接的半乳糖；由核磁共振分析得出，葡萄糖為β-吡喃構型，半乳糖是α-構型，甘露糖是β-構型。另外通過不同種類的抗氧化實驗證明了均一多糖RFPF2A具有一定的抗氧化活性，并且抗氧化活性與其質量濃度呈正相關。本研究為珊瑚菌作為潛在功能性食品原輔料提供科學依據(jù)，關于珊瑚菌活性與結構的對應關系，還有待后續(xù)進一步研究，從而能夠更加科學合理地開發(fā)利用珊瑚菌資源。