王維杰，金婉婉，潘潔，王立博，朱榮濤，李健，張弛弦，梁若鵬

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052，1.肝膽胰外科，2.急診科）

肝細(xì)胞癌（HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，占全球新增病例的50%以上，具有高侵襲性和高病死率的特點(diǎn)。盡管近年來HCC的治療取得了顯著進(jìn)步，但肝癌切除術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%，且大多數(shù)患者于術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)[1-3]。我國(guó)是乙肝大國(guó)，每年約有35/10萬人因HCC死亡，僅次于肺癌[4]。盡管醫(yī)學(xué)研究不斷深入，但HCC的早期診斷率依然偏低，即使對(duì)早期的HCC行根治性切除，五年生存率也僅為60%左右[5-6]。

毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變基因（ataxia telangiectasia-mutated，ATM）和共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張以及Rad3相關(guān)基因（ataxia telangiectasia-mutated and Rad-3 related，ATR）是DNA損傷反應(yīng)中的兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)，ATM和ATR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于中心支架蛋白（replication protein A，RPA）。近期的研究發(fā)現(xiàn)，RFWD3能介導(dǎo)RPA的泛素化，并通過作用于多重賴氨酸殘基參與到ATM/ATR通路，應(yīng)對(duì)DNA損傷反應(yīng)[7-9]，而DNA損傷反應(yīng)異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。目前RFWD3在HCC中的具體作用仍不明確，其表達(dá)情況及其與HCC預(yù)后的關(guān)系也尚不清楚，本研究旨在通過檢測(cè)HCC臨床標(biāo)本中RFWD3的表達(dá)情況，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫資源和臨床資料，探索RFWD3與HCC預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本和資料收集

本研究中所有標(biāo)本均來源于2014年1月至2017年12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科接受HCC切除術(shù)的患者，且已于術(shù)前取得了患者的知情同意。入組標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均為初次手術(shù)，且術(shù)前未進(jìn)行放化療，無其他相關(guān)合并癥。標(biāo)本切除后立即在-80 ℃環(huán)境中妥善保存，術(shù)后病理皆證實(shí)為HCC。隨機(jī)選取40對(duì)HCC組織及癌旁正常肝臟組織進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，同時(shí)采集患者的性別、年齡、乙肝表面抗原表達(dá)、和腫瘤大小及分期等資料。

1.2 RT-PCR法測(cè)定RFWD3轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)

采用TRIzol（Invitrogen公司）提取組織總RNA，進(jìn)而用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司），依照說明書步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。之后利用qRT-PCR測(cè)定雙鏈DNA染料SYBR Green PCR Master Mixture（美國(guó)AB公司）。

1.3 Western blotting和免疫組化（immunohistochemistry，IHC）法檢測(cè)RFWD3的表達(dá)

（1）Western blotting：將HCC組織和癌旁組織分別制成勻漿，提取蛋白質(zhì)并采用分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，分別計(jì)算標(biāo)本的上樣量。利用SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜），再將膜放入用1×TBST配制的5%脫脂牛奶中，室溫下封閉2 h，之后棄牛奶加入一抗（1:400稀釋）和GAPDH（1:3 000稀釋），接著置于4 ℃搖床上孵育過夜，用1×TBST洗滌3次，于室溫下加入用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:3 000稀釋），孵育2 h，再次用1×TBST洗滌3次后檢測(cè)抗原抗體的免疫反應(yīng)活性。將上述步驟于相同條件下重復(fù)3次，結(jié)果取均值。（2）IHC：肝癌和癌旁組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋及切片。4 μm石蠟切片用于RFWD3免疫組化染色，光鏡下捕片、觀察并分析。

1.4 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析

在GEPIA數(shù)據(jù)庫中檢索RFWD3在HCC以及癌旁正常肝組織中的生物學(xué)信息，計(jì)算RFWD3的表達(dá)量，分析其與HCC總生存率和無瘤生存期的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad-Prism（Windows version-5.0）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果用（±s）表示，用Mann Whitneyt檢驗(yàn)比較不同樣本之間的差異，采用Pearsonχ2檢驗(yàn)分析臨床特征與RFWD3表達(dá)的相關(guān)性，以上結(jié)果均設(shè)定P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)各樣品中RFWD3基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)

運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)40例HCC組織及其癌旁組織中RFWD3的mRNA表達(dá)量，如圖1所示，RFWD3的mRNA在HCC組織中的相對(duì)表達(dá)水平為（1.19±0.11），在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)水平為（0.35±0.04）。與癌旁組織相比，HCC組織中RFWD3的mRNA表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.2 Western blotting和IHC檢測(cè)各樣品的RFWD3表達(dá)量和臨床相關(guān)性分析

圖1 40例HCC組織及其癌旁組織的RT-PCR顯示，與癌旁組織相比，RFWD3的mRNA在HCC組織中的表達(dá)顯著升高（P＜0.001）

運(yùn)用Western blotting和IHC技術(shù)檢測(cè)40對(duì)HCC組織及其癌旁組織中RFWD3的表達(dá)量，如圖2所示，HCC組織及其癌旁組織中均有RFWD3表達(dá)，通過灰度值分析發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，HCC組織中RFWD3的表達(dá)顯著升高（P＜0.001），IHC染色進(jìn)一步證實(shí)HCC癌組織中RFWD3陽性率顯著增加。

圖2 40例HCC組織及其癌旁組織的Western boltting和IHC顯示，與癌旁組織相比，RFWD3在HCC組織中的表達(dá)量顯著升高（P＜0.001）

臨床資料（表1）分析發(fā)現(xiàn)，RFWD3的表達(dá)情況與HCC腫瘤大小之間存在顯著相關(guān)性（P=0.033），然而與患者的性別、年齡、乙肝表面抗原表達(dá)情況和TNM分期之間無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

為消除抽樣誤差對(duì)研究結(jié)果的影響，我們從GEPIA數(shù)據(jù)庫中提取了部分關(guān)于RFWD3在HCC組織以及正常肝組織中表達(dá)的數(shù)據(jù)[10]，分析結(jié)果顯示，與正常肝組織相比，RFWD3在HCC組織中的表達(dá)量顯著增高（圖3A），同時(shí)，在HCC患者中，RFWD3的高表達(dá)也伴隨著更低的總體生存率和無瘤生存期（P＜0.05） （圖3B和3C）。

3 討論

HCC是最常見的癌癥之一，具有高發(fā)病率、易轉(zhuǎn)移和預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害著人類的健康[11-13]。研究表明，HCC術(shù)后復(fù)發(fā)涉及腫瘤自身特征、手術(shù)相關(guān)因素及患者自身情況等諸多方面，早期復(fù)發(fā)多表現(xiàn)為局部浸潤(rùn)、肝內(nèi)播散和腫瘤自身生物學(xué)特征改變，晚期復(fù)發(fā)則主要表現(xiàn)為致癌因素如肝炎、肝硬化等導(dǎo)致的新發(fā)病灶形成[3]。為了更好地治療和預(yù)防HCC，目前已有很多研究試圖闡明其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，目前已知的HCC的發(fā)生發(fā)展與抑癌基因缺失、原癌基因激活、DNA甲基化、腫瘤的血管生成等多種因素密切相關(guān)，但主導(dǎo)因素并不明確。隨著分子生物學(xué)研究的不斷進(jìn)展，現(xiàn)認(rèn)為HCC是體內(nèi)諸多生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相互作用下所產(chǎn)生的結(jié)果[14-15]。細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過一系列的正負(fù)反饋行為相互作用，從而調(diào)控細(xì)胞的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等一系列生物學(xué)行為，影響著HCC的侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥和腫瘤的復(fù)發(fā)[16-18]。因此，探索HCC發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控基因，明確其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而闡明其調(diào)控機(jī)制，對(duì)提高HCC的早期診斷率和改善患者預(yù)后有著極為重要的臨床意義。

RFWD3作為ATM/ATR的磷酸化底物作用于多重賴氨酸殘基，從而參與DNA損傷修復(fù)的過程[8，19-20]。查閱RFWD3相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，缺乏RFWD3表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致一系列疾病，尤其是惡性腫瘤的發(fā)生[19-20]。Fu等[21]學(xué)者率先報(bào)道RFWD3可與Mdm2形成RFWD3-Mdm2泛素酶復(fù)合物，從而正向調(diào)節(jié)P53的穩(wěn)定性來應(yīng)對(duì)DNA損傷修復(fù)。Elia和Feeney等學(xué)者的研究表明，在DNA損傷發(fā)生后，RFWD3在被停止的復(fù)制叉處聚積，與復(fù)制蛋白A （RPA）共同定位，并通過其WD40域在C端與RPA相結(jié)合，在同源重組之后促進(jìn)復(fù)制叉的重新啟動(dòng)[7]，同時(shí)促進(jìn)RPA介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)[22]，而DNA損傷修復(fù)異常是腫瘤進(jìn)展的重要機(jī)制之一。目前RFWD3的功能尚不明確，且無研究證實(shí)其在 HCC中的表達(dá)水平及與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性。

表1 臨床資料參數(shù)和RFWD3表達(dá)相關(guān)性

我們首先利用RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)了40例接受手術(shù)切除的HCC患者的癌及癌旁組織中RFWD3的mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示HCC標(biāo)本中RFWD3的mRNA表達(dá)量明顯高于癌旁組織。同時(shí)，運(yùn)用Western boltting和IHC技術(shù)，對(duì)40例HCC組織和癌旁組織進(jìn)行RFWD3蛋白的定量檢測(cè)，從表達(dá)水平上得到了相同的結(jié)果。以上結(jié)果提示RFWD3基因的上調(diào)可能參與了HCC的發(fā)生發(fā)展。

此外，我們根據(jù)HCC組織和癌旁組織中RFWD3的表達(dá)情況，結(jié)合臨床資料，運(yùn)用Pearson Chi-Squared檢驗(yàn)分析RFWD3的表達(dá)量與HCC預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示HCC組織中RFWD3的高表達(dá)與腫瘤大小之間存在顯著相關(guān)，與腫瘤的TNM分期有正相關(guān)趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示RFWD3的高表達(dá)很可能是HCC的一個(gè)不良預(yù)后因素；與此相對(duì)應(yīng)，HCC組織中RFWD3的表達(dá)量與患者的性別、年齡以及乙肝表面抗原表達(dá)情況之間無顯著相關(guān)性。以上結(jié)果提示RFWD3基因的上調(diào)可能參與了HCC的發(fā)生和發(fā)展，與HCC患者的預(yù)后密切相關(guān)。

圖3 GEPIA數(shù)據(jù)庫結(jié)果

鑒于本研究樣本量偏小，我們從GEPIA數(shù)據(jù)庫中提取大量HCC患者的數(shù)據(jù)來進(jìn)一步驗(yàn)證我們的結(jié)果，以減小抽樣誤差[10]。首先選取369例HCC組織和160例正常肝臟組織的數(shù)據(jù)，分析結(jié)果顯示RFWD3在HCC組織中的表達(dá)量顯著高于正常肝臟組織，該結(jié)果與我們的研究結(jié)果相互印證。之后我們又從HCC患者中分別選取RFWD3高表達(dá)和低表達(dá)數(shù)據(jù)各91例，分析結(jié)果顯示，RFWD3高表達(dá)的HCC患者總體生存率和無瘤生存期遠(yuǎn)低于RFWD3低表達(dá)的患者，提示RFWD3的高表達(dá)是HCC的一個(gè)重要不良預(yù)后因素，這與我們的研究結(jié)果RFWD3高表達(dá)和HCC腫瘤大小呈成正相關(guān)這一結(jié)果也是一致的。因此，RFWD3基因的高表達(dá)可能參與了HCC的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)也可能是HCC一個(gè)重要的不良預(yù)后因素。

綜上所述，RFWD3基因的高表達(dá)可能是HCC一個(gè)重要的不良預(yù)后因素，以RFWD3這一功能基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，進(jìn)一步揭示其介導(dǎo)HCC進(jìn)展的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制，將可能成為認(rèn)識(shí)和探索HCC發(fā)病機(jī)制的一個(gè)新的研究方向，為HCC的臨床診治提供新的理論基礎(chǔ)。