姚佳玲，龔海燕

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室，上海200241）

蜱為專性吸血的節(jié)肢動物，屬于動物界節(jié)肢動物門、蛛形綱、蜱螨亞綱、寄螨目、蜱總科。全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)18屬897種，我國已發(fā)現(xiàn)10屬119種，包括100種硬蜱和10余種軟蜱[1]。蜱的發(fā)育階段主要包括卵、幼蜱、若蜱和成蜱，每個發(fā)育階段均需吸血才能完成。蜱的宿主非常廣泛，且與人類疾病關(guān)系密切，是許多重要病原的傳播媒介，可攜帶和傳播病毒、細菌、真菌、立克次氏體、螺旋體及原蟲等[2]，給人類健康、畜牧業(yè)生產(chǎn)及野生動物帶來極大危害。

蜱傳病中，巴貝斯蟲病是由頂復(fù)門巴貝斯蟲引起的一類血液原蟲病，傳播媒介為硬蜱，因人獸共患而受到國內(nèi)外越來越多的關(guān)注[3]。根據(jù)目前文獻記載，硬蜱科的扇頭蜱（Rhipicephalus）、硬蜱（Ixodes）、血蜱（Haemaphysalis）、璃眼蜱（Hyalomma）是巴貝斯蟲的媒介宿主[4]。巴貝斯蟲除少數(shù)經(jīng)輸血傳播以外，主要通過感染蜱的叮咬傳播[5-6]。蜱在吸血過程中大量攝入蟲體，但巴貝斯蟲隨紅細胞到達蜱中腸后，大部分將被消滅或者退化，僅少數(shù)發(fā)育為配子體，隨后融合成合子才能穿透蜱中腸圍食膜并遷移到血淋巴中的各個器官[7-9]。這些“幸存者”會給媒介宿主帶來哪些影響，自身又有哪些變化？本文將對蜱的各個器官和巴貝斯蟲中涉及的互作分子進行闡述，以期為阻斷巴貝斯蟲的傳播提供信息和基礎(chǔ)。

1 蜱體內(nèi)互作相關(guān)分子

1.1 中腸 防御素和抗菌肽類：中腸不僅是蜱的主要消化器官，而且是營養(yǎng)物質(zhì)的貯存庫，更是多種病原的載體。原蟲入侵時，刺激蜱的先天免疫反應(yīng)，快速合成防御素和蜱抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs），由此構(gòu)成了重要的體液防御機制。此類分子不僅對原蟲有抑制作用，且對細胞內(nèi)的細菌和真菌同樣具有抗性[10-12]。中腸細胞內(nèi)有一種類防御素蛋白（Longicin），最初發(fā)現(xiàn)于長角血蜱（H.longicornis），研究表明重組Longicin在體外可有效抑制裂殖子增殖，且接種該蛋白質(zhì)使得感染小鼠體內(nèi)的田鼠巴貝斯蟲（B.microti）減少；而Longicin沉默則導(dǎo)致蜱的中腸、卵巢和卵等多個組織中染蟲率增加[13]。Longipain也是長角血蜱中分離出來的一種蛋白，屬于中腸半胱氨酸蛋白酶，功能與Longicin相似[14]。Microplusin是微小扇頭蜱（R.microplus）中富含半胱氨酸的AMPs家族中的一員[15]，研究發(fā)現(xiàn)具環(huán)扇頭蜱（R.annulatus）感染雙芽巴貝斯蟲（B.bigemina）時，Microplusin會過度表達[10]。

蛋白酶和蛋白酶抑制劑類：半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin, cyst），可有效抑制木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶。在多種蜱中發(fā)現(xiàn)了編碼半光氨酸蛋白酶抑制劑的基因[16-17]；Hlcyst-2來自于長角血蜱中腸，在吉氏巴貝斯蟲（B.gibsoni）感染的幼蜱中表達量比正常幼蜱高1.8倍，其重組蛋白對體外培養(yǎng)的巴貝斯蟲表現(xiàn)出明顯的生長抑制作用，這些結(jié)果表明Hlcyst-2參與蜱的先天免疫[18]；鐮形扇頭蜱（R.haemaphysaloides）的Cystatin分子RHcyst-1和RHcyst-2在感染與未感染巴貝斯蟲蜱體內(nèi)的基因表達量分析表明，在半飽血若蜱階段，RHcyst-1和RHcyst-2基因顯著上調(diào)，在飽血若蜱及蛻皮后的成蜱階段，基因顯著下調(diào)，體外實驗表明蜱的Cystatin可抑制巴貝斯蟲的半胱氨酸蛋白酶[19]；此外，中腸中還存在其他保護蜱免受病原攻擊的蛋白酶和蛋白酶抑制劑[7,10-11,20]。

通道蛋白和受體類：微小扇頭蜱中腸中的BmVDAC，線粒體電壓依賴性陰離子選擇性通道多肽（也稱為線粒體孔蛋白），可與雙芽巴貝斯蟲有性階段蛋白結(jié)合，蟲體入侵時，BmVDAC過量表達[21-22]。VDAC被認為位于線粒體外膜中，調(diào)節(jié)小分子進入線粒體膜間隙的通量，并在細胞代謝和細胞凋亡中起作用[23]。在蚊子中，VDAC在瘧原蟲入侵中腸的過程中發(fā)揮作用。同樣，伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）通過蜱中腸的傳播可能與VDAC結(jié)合組織型纖溶酶原激活物的能力有關(guān)[24-25]。此外，在肩突硬蜱（I.scapularis）中腸上皮細胞中鑒定到伯氏疏螺旋體外膜蛋白A的蜱受體（TROSPA），且此蛋白可能控制蜱體內(nèi)的細菌感染[26-28]。在具環(huán)扇頭蜱中，TROSPA的直系同源基因在雙芽巴貝斯蟲感染期間過表達，而基因敲除則使微小扇頭蜱和具環(huán)扇頭蜱中的巴貝斯蟲感染率分別降低了70%和83%[10]。用TROSPA免疫接種牛后，雙芽巴貝斯蟲從牛向蜱的傳播概率下降了80%[29]。在具環(huán)扇頭蜱中，這種受體不僅存在于中腸，還存在于唾液腺（salivary glands，SGs）和卵巢中[30]。在長角血蜱中，還鑒定出富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白（LRR），其重組蛋白對吉氏巴貝斯蟲具有生長抑制作用，且效果與傳統(tǒng)的抗生素藥物相似甚至更好[31]。中腸中還存在其他帶有結(jié)構(gòu)域的具有保護作用的分子，如MD-2相關(guān)的脂質(zhì)識別（ML）結(jié)構(gòu)域分子，含有與脂質(zhì)識別相關(guān)的蛋白質(zhì)[32]。

其他分子：Bm86為膜結(jié)合糖蛋白，在微小扇頭蜱中腸細胞中首次發(fā)現(xiàn)，其可能參與中腸內(nèi)血液的內(nèi)吞作用[33-35]。在使用基于Bm86抗原的疫苗Gavac?R的一項研究中，接種疫苗的與未接種的狗相比，接種疫苗的狗體表的若蜱呈現(xiàn)更低水平的犬巴貝斯蟲（B.canis）感染。而攜帶Bm86抗體的牛喂食蜱后，抗體引起蜱中腸消化細胞裂解，進而血液滲漏到蜱淋巴中[36]。由此可以推測，中腸細胞的裂解可能抑制了合子的進入和/或下游動合子的分化，從而損害了若蟲對犬巴貝斯蟲的獲取。但也有研究表明，Bm86的RNA干擾不影響牛巴貝斯蟲（B.bovis）經(jīng)卵傳播[34]。Subolesin，最先發(fā)現(xiàn)于肩突硬蜱，經(jīng)鑒定為昆蟲和脊椎動物中先天性免疫相關(guān)分子Akirin的直系同源基因[37-38]，在真核生物包括蜱類高度保守[30,39]，是抗蜱和蜱傳播?。═TBP）候選抗原中很有潛力的分子之一。Subolesin家族蛋白在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)病原體感染反應(yīng)的細胞通路中的相關(guān)蛋白質(zhì)表達[40-41]。Subolesin沉默引起微小扇頭蜱中雙芽巴貝斯蟲感染水平下降[42]，但具環(huán)扇頭蜱中雙芽巴貝斯蟲的感染水平降低不顯著[10]。Subolesin和含有Subolesin保護性表位（Q38）的嵌合體進行疫苗接種，影響了雙芽巴貝斯蟲向蜱傳播[29]，由此表明，Subolesin與巴貝斯蟲的感染有一定關(guān)系。

蜱中腸是巴貝斯蟲穿越媒介宿主，上行到唾液腺的第一道屏障，了解腸上皮細胞和內(nèi)容物中的蛋白分子與巴貝斯蟲的互作，將有助于抗巴貝斯蟲疫苗的研發(fā)，從而阻斷巴貝斯蟲在蜱體內(nèi)的遷移以進一步阻斷巴貝斯蟲的傳播。

1.2 血淋巴與卵巢 巴貝斯蟲成功入侵蜱中腸上皮后，其合子在血淋巴的幫助下，通過減數(shù)分裂，成為動合子。在淋巴液中，巴貝斯蟲經(jīng)無性繁殖，從而產(chǎn)生多個孢子囊并經(jīng)卵傳播，導(dǎo)致在蜱所有生命階段及蜱所有器官中都可攜帶孢子囊[43]。

當(dāng)蜱被微生物，如巴貝斯蟲入侵時，血淋巴細胞增加其循環(huán)次數(shù)以破壞和控制入侵者，吞噬小顆粒物質(zhì)和微生物[44-45]。除了吞噬作用外，血淋巴中還通過其他方式保護自身，如形成結(jié)節(jié)和包囊，或通過血淋巴中存在的分子AMPs、溶菌酶、蛋白酶、蛋白酶抑制劑和凝集素等直接作用于病原體[46-47]。雙芽巴貝斯蟲在到達血淋巴時表現(xiàn)出運動性并黏附于微小扇頭蜱血細胞膜上[48]，但蜱是如何在血淋巴水平上控制病原的還不得而知。

幾乎所有巴貝斯蟲種均可在雌蜱中垂直傳播，這是該屬的獨有特征[8,49]，可視為病原為了長期存在于生態(tài)系統(tǒng)中而進化出來的適應(yīng)性[8]。感染巴貝斯蟲的蜱卵巢蛋白組學(xué)研究鑒定出多個顯著差異表達的蛋白質(zhì)，包括鈣網(wǎng)蛋白、谷氨酰胺合成酶和Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族；其次為蜱溶菌酶和一組可能屬于AMPs家族的小蛋白質(zhì)[50]。巴貝斯蟲感染可能影響蜱卵巢中參與應(yīng)激反應(yīng)、解毒和免疫反應(yīng)相關(guān)的基因[51]，這些基因大部分可翻譯得到參與卵巢免疫反應(yīng)的蛋白酶和蛋白酶抑制劑。當(dāng)蜱卵巢被感染時，發(fā)現(xiàn)假定的免疫親和素（Imnp）和Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑（Spi）基因表達上調(diào)[50]。Imnp基因敲除導(dǎo)致子代幼蟲感染水平顯著上升，表明此分子可能控制原蟲入侵蜱卵巢，并影響子代幼蟲發(fā)育。

蜱的卵黃蛋白原受體（vitellogenin receptor，VgR）與巴貝斯蟲的垂直傳播有關(guān)。VgR沉默后，未能檢測到叮咬感染犬的長角血蜱體內(nèi)的吉氏巴貝斯蟲DNA[52]，由此可能表明巴貝斯蟲分子對蜱VgR具有配體結(jié)合活性，從而侵入正在發(fā)育的卵母細胞。

卵巢是雌蜱生殖系統(tǒng)中的一個主要結(jié)構(gòu)，包括巴貝斯蟲在內(nèi)的很多病原體可以經(jīng)卵傳播，新孵化的帶蟲幼蜱可將病原傳染給宿主，而卵巢中的一些分子可通過減少卵和胚胎發(fā)育，從而降低蜱的繁殖率并阻斷蜱媒病原經(jīng)卵傳播，所以卵巢中與病原體相互作用的分子將有望成為疫苗開發(fā)的靶標。

1.3 唾液腺 當(dāng)巴貝斯蟲上行到達唾液腺時，經(jīng)歷最后的增殖階段并產(chǎn)生子孢子，成為具有感染性的蟲體。SGs是巴貝斯蟲完成媒介中生活史所必須克服的最后一道屏障，且與中腸中所面臨的障礙相似[8]。

軟蜱和硬蜱的唾液組學(xué)研究多有被報道[53-60]，其中研究表明AMPs，包括防御素、microplusin/hebraein（一種抗菌肽）、含Kunitz結(jié)構(gòu)域的蛋白、脂質(zhì)運載蛋白、蛋白酶等分子參與蜱的防御機制。盡管已知唾液腺分子對巴貝斯蟲的傳播尤為重要，但關(guān)于唾液腺分子對巴貝斯蟲感染的影響的報道卻十分少見。

在帕氏鈍緣蜱（Ornithodoros parkeri）的唾液轉(zhuǎn)錄組和肩突硬蜱基因組中均發(fā)現(xiàn)一種假定的血清淀粉樣蛋白A，在脊椎動物中，這種蛋白質(zhì)在炎癥反應(yīng)的急性期發(fā)揮作用[10,53]。在抗蜱感染的牛中發(fā)現(xiàn)其血清淀粉樣蛋白A表達增加表明其參與由蜱感染產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)[61]。當(dāng)具環(huán)扇頭蜱感染雙芽巴貝斯蟲時，血清淀粉樣蛋白A基因的表達會因感染而上升，基因敲除導(dǎo)致微小扇頭蜱和具環(huán)扇頭蜱中感染水平分別降低66%和86%[10]。

在蜱卵巢、中腸和唾液腺中均存在鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin）[10,62]，其作用尚不清楚。有些研究表明其在唾液腺和唾液中的存在可能與逃避宿主防御反應(yīng)有關(guān)[61-63]，但不具備抗血栓和補體抑制功能[64]。此基因在感染雙芽巴貝斯蟲的具環(huán)扇頭蜱中過表達。鈣網(wǎng)蛋白下調(diào)對微小扇頭蜱中的病原體感染具有顯著影響，但對具環(huán)扇頭蜱感染率影響不顯著[10]。據(jù)此，認為鈣網(wǎng)蛋白參與蜱吸血過程[10,65]，且可能在巴貝斯蟲感染過程中改變鈣的代謝。巴貝斯蟲可能和馬泰勒蟲（T.equi）（以前稱為馬巴貝斯蟲（B.equi）一樣，在侵入蜱細胞時需要鈣離子。重組鈣網(wǎng)蛋白免疫接種牛后，未能減少蜱對巴貝斯蟲的感染，這可能是由于蛋白質(zhì)的免疫原性低所致[65]。鈣網(wǎng)蛋白抗血清也不能顯著降低微小扇頭蜱中的雙芽巴貝斯蟲感染[62]。其他分子，例如已經(jīng)討論過的TROSPA，也存在于蜱唾液腺，其可能是巴貝斯蟲的受體。

唾液腺是分泌唾液的主要器官，也是傳播巴貝斯蟲的主要載體，在病原-載體-宿主相互作用中起到關(guān)鍵性的橋梁作用，因此了解并解析蜱唾液腺分子與巴貝斯蟲的互作，將有利于發(fā)現(xiàn)或開發(fā)有效的藥物及疫苗，阻斷病原體向宿主的傳播。

2 巴貝斯蟲體內(nèi)與蜱的互作分子

巴貝斯蟲進入中腸后，由于大多數(shù)死亡或者退化，不易分離，因此巴貝斯蟲在蜱蟲期的分子研究相對困難，報道也較少。在蜱中腸內(nèi)，僅少數(shù)巴貝斯蟲發(fā)育成配子，進一步以合子形式穿透中腸上皮細胞。目前，已在牛巴貝斯蟲基因組中鑒定出10個6-Cys基因（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J），其中A、B、E、H、I和J基因在牛巴貝斯蟲感染的蜱中腸中轉(zhuǎn)錄，并且基因A、B和E也在隨后的牛巴貝斯蟲動合子期轉(zhuǎn)錄，而基因C僅在動合子中轉(zhuǎn)錄表達。這些結(jié)果表明，巴貝斯蟲6-Cys基因在有性階段與蜱中腸存在一定聯(lián)系[66]。近年，對牛巴貝斯蟲的紅細胞期和蜱蟲期的細胞表面蛋白的蛋白組學(xué)分析和比較，表明有兩種蛋白（BBOV_I002220和BBOV_IV006250）在蜱蟲期表達量顯著增加，且在雙芽巴貝斯蟲中呈現(xiàn)相似的表達模式[67]。預(yù)示這兩種蛋白為巴貝斯蟲在蜱體內(nèi)存活所必須，與蜱的互作存在一定關(guān)系。此外，雙芽巴貝斯蟲在有性繁殖期，即蜱蟲期特異表達一種轉(zhuǎn)甲基酶（BBBOND_0204030），但在紅細胞期無表達，因此，此基因即可作為蜱感染巴貝斯蟲的分子標記，也可為蜱-巴貝斯蟲互作提供新的信息[68]。此外，研究發(fā)現(xiàn)雙芽巴貝斯蟲的HAP2在體外誘導(dǎo)的有性繁殖階段及感染的蜱中均有表達，而在紅細胞期不表達，并且抗HAP2特異性抗體能夠在體外阻斷合子的形成，這說明該蛋白可能與蜱存在互作關(guān)系[69]。

了解巴貝斯蟲在蜱蟲期差異表達的分子，可以為解析蜱與巴貝斯蟲的互作機制提供前期信息，也為疫苗的研發(fā)提供新的信息和潛在的靶點。

3 小結(jié)

目前，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多蜱與病原體的相互作用被發(fā)掘出來，但是關(guān)于蜱-巴貝斯蟲的互作機制信息卻相對較少。而阻斷蜱載入和傳播巴貝斯蟲的關(guān)鍵是新疫苗的研發(fā)，而新疫苗的研發(fā)需要篩選出潛在的候選抗原。本綜述收集蜱與巴貝斯蟲互作相關(guān)分子的相關(guān)信息，為后期篩選與鑒定新的候選抗原提供基礎(chǔ)和依據(jù)。