劉超，景贊，黃志勇

（樂山食品藥品檢驗檢測中心，四川樂山 614000）

食用植物油在家庭廚房里不可缺少，同時它也是人體所需營養(yǎng)的重要來源。隨著近代工業(yè)的發(fā)展，為了增加食用植物油的保質(zhì)期，允許往食用植物油中添加丁基羥基茴香醚（BHA）、2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）、二丁基羥基甲苯（TBHQ）、特丁基對苯二酚等抗氧化劑。與BHA、BHT相比，TBHQ更安全，對人體健康影響更小[1]，因此，更受廣大生產(chǎn)廠家的喜愛。有報道研究TBHQ對實驗動物的胃具有一定的副作用[2]，在不同國家的使用規(guī)則不同，在歐盟和日本禁止在食品中使用[3]，我國食品添加劑使用標準規(guī)定，在食用植物油中TBHQ最大使用限量為0.2 g/kg[4]。

目前，TBHQ常用檢測方法有高效液相色譜法[5]、氣相色譜法[6]、液質(zhì)聯(lián)用法[7]等。高效液相色譜法具有操作簡單、穩(wěn)定性高等特點；液質(zhì)聯(lián)用法具有定性能力高、選擇性高、靈敏度高等特點。本文在GB 5009.32-2016[8]基礎(chǔ)上，對兩種方法進行了比較，以期探索TBHQ檢測的最適宜方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇，99.9%，色譜純，天津康科德科技有限公司；乙腈，99.9%，色譜純，天津康科德科技有限公司；甲酸，色譜純，天津市大茂化學試劑廠；叔丁基對羥基苯二酚（TBHQ）（0.25 g、99.2%，Lot：G162174 Dr.Ehrenstorfer GmbH，12/2021）；水，實驗室用超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，配有紫外檢測器，島津公司DGU-20A；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，DGU-20A-API3200，AB公司；電子天平（精確度0.01 mg），XSE205，梅特勒-托利多集團；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EVA50A，北京普立泰科儀器有限公司；凝膠滲透色譜儀，P270II，大連依利特分析儀器有限公司；微孔濾膜，有機相、0.22 μm。

1.3 高效液相色譜法測定食用植物油中TBHQ

1.3.1 色譜條件的確定

液相色譜柱：Kromasil 100-5-C18（3.9 mm×150 mm，5μm）；流動相：A-甲醇，B-0.5%甲酸；流速為1.0 mL/min；進樣體積為10 μL，采用梯度洗脫，洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition

1.3.2 對照品溶液的配制

準確稱取12.5 mg TBHQ至25 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，即制得對照品儲備液（500 μg/mL），避光，0～4 ℃儲存。分別準確移取0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL對照品儲溶液至5 mL棕色容量瓶中，乙腈定容，配成10、20、50、100、150、200 μg/mL的對照品使用液。

1.3.3 樣品的制備

（1）提取

精密稱取混勻的食用油10 g于100 mL容量瓶中，以乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1）定容至刻度，搖勻，備用。從中取5 mL溶液至10 mL容量瓶中，以乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1）定容至刻度，待凈化。

（2）凈化

取10 mL待凈化液加入凝膠色譜進樣管中，使用凝膠色譜凈化，收集流出液，40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加2 mL乙腈溶解，用甲醇定容至5 mL，過0.22 μm的有機相微孔濾膜，備用。

凝膠色譜條件如下：凝膠色譜柱為300 mm×20 mm玻璃柱，Bio Beads（S-X3），40～70 μm；流動相為乙酸乙酯:環(huán)己烷（1:1）；流速為5 mL/min；流出液收集時間為7～17.5 min；紫外檢測波長為280 nm。

1.3.4 方法的檢出限

精密稱取混勻的食用油10 g于100 mL容量瓶中，加入0.5 mL、5.0 μg/mL的TBHQ對照品使用液，以乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1）定容至刻度，搖勻，備用。從中取5 mL溶液至10 mL容量瓶中，以乙酸乙酯-環(huán)己烷（1+1）定容至刻度。取10 mL待凈化液加入凝膠色譜進樣管中，使用凝膠色譜凈化，收集流出液，40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加2 mL乙腈溶解，過0.22 μm的有機相微孔濾膜，進樣，信噪比S/N≥3即可。

1.3.5 方法的回收率和重復(fù)性

為驗證方法的穩(wěn)定性和準確性，對食用油分別進行10、20、30 μg/mL這3個水平加標回收試驗，測得TBHQ的峰面積代入隨行的基質(zhì)標準曲線，計算濃度及其RSD，獲得準確性及重復(fù)性結(jié)果。

1.4 LC－MS/MS測定食用植物油中TBHQ

1.4.1 液相色譜條件

液相色譜柱：Kromasil 100-5-C18（3.9 mm×150 mm，5 μm）；流動相：A-乙腈，B-水；流速：0.4 mL/min；進樣體積：10 μL。梯度洗脫，條件見表2。

表2 梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution condition

1.4.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜模式為ESI負離子模式，離子源參數(shù)見表3，多反應(yīng)檢測參數(shù)見表4。

表3 離子源參數(shù)Table 3 Ion source parameters

表4 多反應(yīng)檢測參數(shù)Table 4 Detection parameters of multiple reaction

1.4.3 對照品溶液的配制

準確稱取10 mg TBHQ至100 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，制得對照品儲備液（100 μg/mL），避光，-20 ℃儲存。移取一定體積的對照品儲備液至50 mL容量瓶中，空白基質(zhì)溶液定容，配成濃度為1、2、5、10、20、50 ng/mL的標準曲線。

1.4.4 樣品的制備

同1.3.3高效液相色譜樣品制備方法。

1.4.5 方法的檢出限

同1.3.4高效液相色譜檢出限的制備方法。

1.4.6 方法的回收率和重復(fù)性

為驗證方法的穩(wěn)定性和準確性，對食用油分別進行2、4、16 ng/mL這三水平的加標回收試驗，測得TBHQ的峰面積代入隨行的基質(zhì)標準曲線，計算濃度及其RSD，獲得準確性及重復(fù)性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜方法

2.1.1 標準曲線

圖1 液相色譜檢測TBHQ的標準曲線Fig.1 Standard curve of TBHQ by HPLC

從圖1可以看出，TBHQ在10～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi)R值為0.999 9＞0.99，線性范圍良好[9]。選取10～200 μg/mL為本試驗的線性范圍。

2.1.2 檢出限

信噪比S/N=42.5，達到GB 5009.32-2016確定的檢出限為10 mg/kg。

2.1.3 方法回收率和重復(fù)性

TBHQ在10、20、30 μg/mL這3個水平的回收率依次為71.7%、82.4%、87.5%，重復(fù)性依次為2.4%、1.9%、1.0%。數(shù)據(jù)顯示該方法的回收率整體偏低，可能存在的原因是樣品經(jīng)過GPC凈化，損失較大；重復(fù)性RSD＜5%，表明該方法的重復(fù)性良好[10]。

2.2 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

2.1.1 標準曲線

從圖2可以看出，TBHQ在濃度1～50 ng/mL范圍內(nèi)R值為0.999 7＞0.99，可見TBHQ在上述線性范圍良好。因此，選取1～50 ng/mL為本試驗的線性范圍。

圖2 液質(zhì)聯(lián)用檢測TBHQ的標準曲線Fig.2 Standard curve of TBHQ by LC-MS/MS

2.1.2 檢出限

采用空白加標方法測定檢出限[11-12]，按1.3.4制備，進樣，信噪比S/N=42.5，檢出限結(jié)果為1.08 μg/kg。

2.1.3 方法的準確性及重復(fù)性

表5 不同水平濃度下的TBHQ回收率和穩(wěn)定性（n=6）Table 5 Recoveries and stability of TBHQ at diffterent levels concentration（n=6）

TBHQ在2.0、4.0、16.0 ng/mL這3個水平的回收率分別為58.2%、65.5%、69.3%，重復(fù)性分別為3.9%、3.7%、1.0%?；厥章瘦^液相色譜法略低，這可能是液質(zhì)聯(lián)用存在基質(zhì)效應(yīng)的原因，雖然采取基質(zhì)溶液配標，但是不能徹底消除基質(zhì)效應(yīng)。重復(fù)性RSD＜5%，表明該方法重復(fù)性良好。

3 結(jié)論

本試驗用高效液相色譜法檢測食用油中TBHQ，對液相色譜法檢測食用油中TBHQ方法學進行了考察。結(jié)果顯示，GB 5009.32-2016中液相色譜法采用凝膠色譜的凈化方法，有效避免了假陽性的現(xiàn)象；但是回收率略低，原因在于凝膠色譜凈化回收率太低。本試驗還采用液質(zhì)聯(lián)用法檢測了食用油中TBHQ，并對該法檢測食用油中TBHQ方法學進行了考察。結(jié)果顯示，GB5009.32-2016中液質(zhì)聯(lián)用法回收率太低，原因可能是由于基質(zhì)效應(yīng)的存在及凝膠色譜的應(yīng)用。總的來說，液相色譜法測定TBHQ回收率較高，建議用液相色譜法檢測食品中TBHQ。