陳細羽，焦必寧，張耀海

1(西南大學/中國農業(yè)科學院柑桔研究所，重慶，400712)2(農業(yè)農村部柑桔產品質量安全風險評估實驗室，重慶，400712)3(農業(yè)農村部柑桔及苗木質量監(jiān)督檢測測試中心，重慶，400712)

柑橘是世界第一大水果，是第三大國際貿易農產品，僅次于小麥和玉米[1]。我國柑橘種植面積和總產量均居世界第一，其中寬皮柑橘約占年產量的60%。柑橘果實營養(yǎng)豐富，富含類黃酮[2-6]、酚酸[5-6]、類檸檬苦素[5]、香豆素[6]、類胡蘿卜素[7]、生物堿[8]、肌醇[9]和揮發(fā)性物質[10]等多種生物活性成分。目前，國內外主要集中于類黃酮和酚酸等活性物質的鑒定分析[2-6]。

類胡蘿卜素是一類C40類萜化合物及其衍生物，是胡蘿卜素和葉黃素2大類色素的總稱。類胡蘿卜素既是決定水果、蔬菜內在營養(yǎng)品質的重要指標，也是影響果實外觀品質和花卉觀賞價值的重要因素[11]。醫(yī)學研究表明，許多類胡蘿卜素在猝滅自由基、增強人體免疫力、預防心血管疾病和防癌抗癌等方面起著重要的作用，β-胡蘿卜素還是維生素A的前體[12]。日本的農研機構已明確證實經常食用溫州蜜柑(1 d攝入3～4 mg功效成分的β-隱黃質)，可以顯著降低骨質疏松、動脈硬化、吸煙者代謝癥候群和胰島素抵抗性等風險。

植物源食品中類胡蘿卜素的檢測方法主要有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[7,13-14]、超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography, UPLC)[15-17]和液相色譜-串聯(lián)質譜法(liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer, LC-MS/MS)[18-20]。高效液相色譜法是最常用的方法，具有價廉、易操作和穩(wěn)定性好等優(yōu)點。胡建中等[13]利用HPLC對大葉尾張寬皮柑橘汁中18種類胡蘿卜素做了定性研究；ATTILA等[14]對金柑、葡萄柚、檸檬等6個柑橘品種的果皮、果肉中類胡蘿卜素組成進行了比較，但涵蓋的品種較少；陶俊等[7]分析了我國53個柑橘品種的6種類胡蘿卜素組成，其中寬皮柑橘就有19種。然而HPLC存在溶劑用量大、分離度差、耗時長等缺點。UPLC具有高效、分離度高、峰形尖銳、成本低、環(huán)境友好、結果精確等特點，已逐漸成為食品分析檢測的有效工具[4-6]。李文爽等[15]利用UPLC測定小麥中的4種類胡蘿卜素，僅需25 min，而HPLC需要60 min以上。液相色譜-質譜聯(lián)用技術結合了色譜和質譜兩者的優(yōu)點，將色譜的高分離性能和質譜的高鑒別特點相結合，已成為準確定性檢測類胡蘿卜素的技術之一。MATSUMOTO等[18]分析了39個柑橘品種的18種類胡蘿卜素，并研究了類胡蘿卜素含量隨季節(jié)變化的規(guī)律。但液相色譜-串聯(lián)質譜儀價格昂貴，并不常用。目前國外對柑橘中類胡蘿卜素的研究主要集中于橙汁[21-22]，且國內還未有UPLC快速檢測柑橘中類胡蘿卜素的相關報道，特別是產量最大的寬皮柑橘。

本研究在前人基礎上，優(yōu)化了寬皮柑橘中類胡蘿卜素的提取條件，建立快速、有效的UPLC方法,對我國34個寬皮柑橘品種中的主要類胡蘿卜素物質含量進行測定，并分析比較不同寬皮柑橘品種的不同部位(果肉和果皮)中類胡蘿卜素物質的種類和含量差異，探究類胡蘿卜素與寬皮柑橘品種的相互關系，旨在充實寬皮柑橘功能性成分數(shù)據(jù)庫，為合理開發(fā)利用柑橘資源、提高柑橘綜合利用價值提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

34個寬皮柑橘品種均來自國家果樹種質資源(重慶)柑橘圃，樣品信息如表1。在果實成熟期，選擇樹勢相對一致的3～5株樹，在樹冠中外圍的中上部隨機挑選大小、成熟度相對一致的果實。

葉黃素(純度≧97%)、玉米黃質(純度≧95%)、β-隱黃質(純度≧97%)、α-胡蘿卜素(純度≧98%)、β-胡蘿卜素(純度≧97%)，美國Sigma-Adrich公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT，純度≧99%)，德國CNW Technologies GmbH公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚(MTBE)、正己烷，均為色譜純，德國CNW Technologies GmbH公司；丙酮、四氫呋喃、乙醇、KOH、Na2SO4，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

表1 寬皮柑橘品種的樣品信息Table 1 Experimental materials

1.2 儀器與設備

Waters ACQUITY UPLC色譜儀(2996 PDA檢測器，version 4.1 Empour工作站)，美國Waters公司，配YMC類胡蘿卜素C30分析柱(4.6 mm×100 mm, 3 μm),日本YMC公司；Milli-Q Advantage A10超純水器，美國Millpore公司；XS205電子天平(感量0.01 mg)、PB3002-S/FACT分析天平(感量0.01 g)，瑞士梅特勒-托利多公司；0.22 μm有機相針式濾器，上海安譜科學儀器有限公司；KS260搖床，德國IKA公司；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；3K15高速冷凍離心機，美國Sigma-Aldrich公司；WD-12氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 儀器條件

儀器條件參考文獻[15]：流動相A為V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)∶V(三乙胺)=81∶14∶5∶0.05，流動相B為V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(三乙胺)=68∶32∶0.05。洗脫梯度：0 min，100%A；0.3 min，100%A；12 min，0%A；20 min，0%A；22 min，100%A；25 min，100%A。柱溫35℃，流速0.5 mL/min，進樣量3 μL，檢測波長450 nm。根據(jù)標準樣品的保留時間判斷樣品中類胡蘿卜素的組分，并采用不同濃度的混合標準樣品與對應的峰面積值間的關系制作標準曲線(R2>0.999 0)，采用積分獲取樣品的峰面積，再根據(jù)標準曲線計算樣品相關組分含量。

1.3.2 標準溶液的配制

準確稱取5種類胡蘿卜素標準物質各2 mg，于10 mL容量瓶中分別用四氫呋喃(含體積分數(shù)為0.1%BHT)溶解并定容至刻度，配制成200 mg/L的標準品母液。以上標準品母液均存放于棕色瓶中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品前處理

樣品的取樣參考相關標準[23]。用干凈紗布輕輕擦去柑橘樣品表面附著物，采用對角線分割法，取對角部分，將果皮和果肉分開(果肉保留囊衣，剔除種子)，將其切碎、混勻，放入食品加工器中徹底粉碎，制成待測樣，放入分裝容器中備用。前處理參照相關方法[24]，并作一定的改進：(1)提取：準確稱取樣品5.00 g于離心管中，加入25 mLV(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙醇)=2∶1∶1(含體積分數(shù)為0.1%BHT)，高速勻漿提取8 min，離心分層，收集有機相，旋轉蒸發(fā)(40 ℃)濃縮至干，用約2 mL MTBE(含體積分數(shù)為0.1%BHT)洗滌燒瓶。(2)皂化：提取液中加入2 mL 10%(體積分數(shù))KOH-甲醇溶液(含體積分數(shù)為0.1%BHT)，避光反應12 h。(3)萃?。杭尤? mL水和2 mL MTBE(含體積分數(shù)為0.1%BHT)，收集有機相，加入4 mL MTBE(含體積分數(shù)為0.1%BHT)再洗滌1次，收集有機相。合并后的有機相用5 mL水洗滌2次，收集有機相，無水Na2SO4干燥，氮吹至干(40 ℃)，用MTBE(含體積分數(shù)為0.1%BHT)定容至1.0 mL，經0.22 μm微孔有機濾膜過濾后上機檢測。

加標實驗：果肉的加標水平為0.2和1 mg/kg，分別向5 g空白果肉樣品(旭柑)中加入100 μL的10 mg/L和50 μL的100 mg/L標準溶液；果皮的加標水平為1和5 mg/kg，分別向5 g空白果皮樣品(旭柑)中加入50 μL的100 mg/L和250 μL的100 mg/L標準溶液，混勻備用。前處理如上。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0軟件繪圖、數(shù)據(jù)統(tǒng)計；應用SPSS 24.0軟件計算標準誤差，并進行方差分析(ANOVA)，利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行分析(P<0.05)。所有樣品均為3次平行，測定結果以平均值±標準差(mean±SD表示)。

2 結果與討論

2.1 標準色譜圖

類胡蘿卜素均為脂溶性化合物，在C30色譜柱有較好的保留，因此本實驗選擇類胡蘿卜素專用柱C30液相色譜柱，標準色譜圖見圖1。5種類胡蘿卜素在22 min內達到完全的基線分離，與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC方法的分離時間只有原來的1/3[5, 7]，大大縮短了分析時間。

1-葉黃素; 2-玉米黃質; 3-β-隱黃質; 4-α-胡蘿卜素;5-β-胡蘿卜素圖1 五種類胡蘿卜素的標準圖譜Fig.1 Chromatogram of a standard mixture peakidentification

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

2.2.1 提取劑的類型

實驗選擇3種不同的有機提取劑，以考察不同提取劑對柑橘(黃巖蜜桔果肉)中類胡蘿卜素提取效果的影響，從而確定適合的提取劑，結果如圖2所示。同一條件下，正己烷的提取效果最差，V(正己烷)∶V(丙酮)=1∶1的提取效果較好，使用V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙醇)=2∶1∶1提取獲得的類胡蘿卜素的總量最高。因此，選擇V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙醇)=2∶1∶1作為柑橘中類胡蘿卜素的提取劑。

圖2 不同提取劑對提取效率的影響Fig.2 Effect of different extractants on the efficiency

2.2.2 不同處理方法提取效果

類胡蘿卜素如β-隱黃質含有1個羥基，葉黃素和玉米黃質含有2個羥基，在基質內多被酯化，而皂化反應可以去除脂質、脂肪酸和葉綠素，并水解類胡蘿卜素酯。實驗采用皂化和非皂化2種處理方法，考察了不同處理方法對柑橘(黃巖蜜桔果肉)中類胡蘿卜素提取效率的影響，結果如圖3所示。皂化后測得的類胡蘿卜素總含量明顯高于未經皂化的，說明通過皂化能更有效地提取柑橘中的類胡蘿卜素[20, 25]。

圖3 非皂化和皂化對提取效率的影響Fig.3 Effect of non-saponification and saponificationon the efficiency

2.3 方法評價

在優(yōu)化的實驗條件下，對系列濃度標準溶液進行檢測，結果見表2。5種類胡蘿卜素在0.1～20 mg/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數(shù)達到0.999以上。儀器的檢出限(S/N=3)為0.05 mg/L，定量限(S/N=10)為0.1 mg/L。保留時間和峰面積的日內偏差分別為0.6%～1.3%和1.4%～3.4%；日間偏差分別為0.9%～2.3%和4.1%～7.1%。

表2 五種類胡蘿卜素的線性范圍、線性方程、檢出限和定量限Table 2 Linear range, equation, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ)of five carotenoids

采用對空白基質(類胡蘿卜素含量較低的旭柑)加標的方法進行回收率和精密度實驗。分別對果皮和果肉樣品進行2個水平的加標回收實驗，以1.3.3節(jié)的方法對樣品進行前處理，平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差(表3)。結果表明：在果肉樣品中，2種添加水平的回收率在80.5%～92.3% 之間，相對標準偏差在3.2%～7.1%之間；在果皮樣品中，2種添加水平的回收率在81.3%～91.5%之間，相對標準偏差在2.6%～7.9%之間。本方法有較好的準確度和精密度，滿足柑橘中類胡蘿卜素定量分析的要求。此方法的檢出限為0.01 mg/kg，定量限為0.02 mg/kg。

2.4 實際樣品測定

從國家果樹種質資源(重慶)柑橘圃抽取34個寬皮柑橘樣品，采用上述方法進行測定，不同品種果肉中類胡蘿卜素的含量如表4所示，不同品種果皮中類胡蘿卜素的含量如表5所示。實際樣品(黃巖蜜桔)果肉和果皮的色譜圖如圖4所示。

表3 五種類胡蘿卜素的平均回收率、相對標準偏差、檢出限和定量限Table 3 Mean recovery, relative standard deviation, LOD and LOQ of five carotenoids

表4 我國34個寬皮柑橘品種果肉中類胡蘿卜素的含量 單位：mg/kg Fw

ND：未檢出(低于定量限)

表5 我國34個寬皮柑橘品種果皮中類胡蘿卜素的含量 單位：mg/kg Fw

ND：未檢出(低于定量限)

a-果肉；b-果皮圖4 實際樣品(黃巖蜜桔)果肉和果皮的色譜圖Fig.4 Chromatograms of pulp and peel of Huang Yan Mi Ju

2.5 寬皮柑橘中類胡蘿卜素含量

寬皮柑橘中類胡蘿卜素含量豐富，果肉和果皮中的平均總量分別為12.41和37.87 mg/kg FW，普遍高于文獻報道的其他品種。果肉和果皮中類胡蘿卜素分布均呈以下規(guī)律：β-隱黃質>玉米黃質>葉黃素>β-胡蘿卜素>α-胡蘿卜素。

2.5.1 果肉中類胡蘿卜素含量

果肉中β-隱黃質的平均含量達8.44 mg/kg FW，占果肉總類胡蘿卜素含量的68.0%，四會柑最高，達18.74 mg/kg FW，旭柑最低，僅為0.30 mg/kg FW。玉米黃質含量次之，其平均含量為2.19 mg/kg FW，占果肉總類胡蘿卜含量的17.6%，蕉柑最為豐富(7.69 mg/kg FW)，旭柑最低(0.033 mg/kg FW)。葉黃素含量相對較低，其平均含量僅為1.04 mg/kg FW，僅占果肉總類胡蘿卜含量的8.4%，貢柑最高(3.00 mg/kg FW)，旭柑最低(0.067 mg/kg FW)。β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素的總平均含量僅為0.75 mg/kg FW，占5種類胡蘿卜素總含量的6.0%。除旭柑外，其他樣品均檢測出β-胡蘿卜素，而滿頭紅、莽山野桔、少核朱紅橘、椪柑、旭柑、春見、不知火、清見和愛媛38等9個品種中均未檢出α-胡蘿卜素。

2.5.2 果皮中類胡蘿卜素含量

與果肉一致，β-隱黃質也是果皮中最主要的類胡蘿卜素，其平均含量為23.73 mg/kg FW，占果皮總類胡蘿卜素的62.7%，椪柑最高(47.32 mg/kg FW)，晚蜜一號最低(2.59 mg/kg FW)。玉米黃質含量次之，其平均含量為9.16 mg/kg FW，占果皮總類胡蘿卜素的24.2%，八月桔最高(29.31 mg/kg FW)，愛媛38最低(1.35 mg/kg FW)。葉黃素平均含量為4.15 mg/kg FW，占果皮總類胡蘿卜素的11.0%，八月桔最高(13.27 mg/kg FW)，晚蜜一號最低(0.78 mg/kg FW)。β-胡蘿卜素含量較低，其平均含量為0.74 mg/kg FW，僅占總類胡蘿卜素的2.0%。與果肉中一致，α-胡蘿卜素的含量最低，平均含量為0.09 mg/kg FW，在晚蜜一號和清見中均未檢出。從總量上看，果皮中類胡蘿卜素含量普遍高于果肉(總含量比值變幅為0.78～23.30 mg/kg FW)。

2.5.3 不同品種果肉中類胡蘿卜素含量差異

從總量上看，四會柑果肉中類胡蘿卜素含量最高，可達27.04 mg/kg FW，旭柑最低(0.40 mg/kg FW)。34種寬皮柑橘可分為橘類(編號1～18)、柑類(編號19～23)和雜柑(編號24～34)三大類，品種之間的含量差異顯著(橘類>柑類>雜柑類)。橘類的類胡蘿卜素含量最為豐富，平均含量為14.73 mg/kg FW，柑類(13.51 mg/kg FW)略低于橘類，最低的為雜柑類(8.11 mg/kg FW)。橘類中β-隱黃質除馬水桔和砂糖桔(低于5.00 mg/kg FW)，其他品種的β-隱黃質均高于5.00 mg/kg FW，變幅為5.34～18.74 mg/kg FW；柑類中，與蕉柑和貢柑(β-隱黃質含量分別為6.76和3.09 mg/kg FW)相比，溫州蜜柑(編號19～21)富含較多的類胡蘿卜素，3個品種的β-隱黃質的變幅為8.92～14.29 mg/kg FW；雜柑中，類胡蘿卜素含量普遍較低，除蜜可露和默科特(β-隱黃質分別為15.25和14.34 mg/kg FW)，其余品種β-隱黃質的變幅為0.30～5.30 mg/kg FW，旭柑最低。

2.5.4 不同品種果皮中類胡蘿卜素含量差異

從總量上看，八月桔果皮中類胡蘿卜素含量最高，高達80.85 mg/kg FW，愛媛38最低(7.02 mg/kg FW)。橘類的類胡蘿卜素含量最為豐富，平均含量為47.94 mg/kg FW；與果肉中不同，雜柑果皮中的類胡蘿卜素平均含量(28.71 mg/kg FW)略高于柑類(21.80 mg/kg FW)。橘類的β-隱黃質平均含量為30.70 mg/kg FW，約為柑類的2.29倍，雜柑類的1.80倍。橘類的玉米黃質的平均含量為11.18 mg/kg FW，明顯高于雜柑類(7.52 mg/kg FW)和柑類(5.44 mg/kg FW)。橘類的葉黃素的平均含量為5.00 mg/kg FW，明顯高于雜柑類(3.56 mg/kg FW)和柑類(2.39 mg/kg FW)。與陶俊報道的結果[7]相比：總體上類胡蘿卜素含量相當，橘類中南豐蜜桔總量偏低，本地早的β-隱黃質和總量均偏低，雜柑類中默科特的β-隱黃質和總量均偏高。

3 結論

寬皮柑橘果實中含有豐富的類胡蘿卜素物質，但生長環(huán)境和基因差異導致不同寬皮柑橘品種類胡蘿卜素的含量存在明顯差異。寬皮柑橘中類胡蘿卜素以β-隱黃質為主，果皮中含量普遍高于果肉。