馬夢嬌，荊慧娟，符安衛(wèi)，王洪新,3，呂文平*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(廣西億泰寧生物科技有限公司，廣西 南寧，530029) 3(江南大學國家功能食品工程技術研究中心，江蘇 無錫，214122)

中華鱉(Chinese soft-shelled turtle)又稱甲魚，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，自古就是我國傳統(tǒng)食療滋補佳品[1]，具有提高免疫力、促進傷口愈合與新陳代謝、抗疲勞等功效[2]。

目前，對于中華鱉肉的研究大多集中在營養(yǎng)成分的分析等方面[3-4]。而中華鱉蛋白組成及其結構表征和功能特性等方面的研究鮮有報道[1，5]本研究以中華鱉肉為原料，對其蛋白質的氨基酸組成及蛋白組分進行了分析，并通過堿溶酸沉法提取得到鱉肉蛋白，并對其結構與功能特性進行研究，為鱉肉蛋白的綜合利用提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華鱉，廣西億泰寧生物科技有限公司提供；標準分子質量蛋白，大連寶生物試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(2×)、蛋白質濃度測定試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司；Na2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4、KI、十二烷基硫酸鈉(SDS)，國藥化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

氨基酸分析儀，美國Agilent公司；M5全波長酶標儀，美國Molecular Devices公司；Chirascan V100圓二色光譜儀，英國Applied Photophysics公司；Q200差示掃描量熱儀，美國TA Instruments公司；NEXUS傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet公司；SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；MBL50實驗室高剪切分散乳化機，默格機械上海有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料的預處理

新鮮的中華鱉宰殺、放血并洗凈血水，去除內臟及附帶筋皮，取腿肉，組織搗碎制成肉糜。

1.3.2 營養(yǎng)成分測定

水分含量的測定，GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》；灰分含量的測定，GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》；蛋白質含量的測定：GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》；脂肪含量的測定，GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》。水解氨基酸的測定，參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》并略作修改。

其中，利用氨基酸評分(amino acid score，AAS)、化學評分(chemical score，CS)和氨基酸的支/芳值(BCAA/AAA)對中華鱉肉的氨基酸營養(yǎng)進行評價。

(1)

(2)

(3)

1.3.3 肌紅蛋白含量測定

稱取2.0 g樣品，加入20 mL磷酸緩沖液(0.04 mol/L，pH 6.8)，10 000 r/min均質25 s，冰浴靜置1 h，10 000 r/min離心30 min(4℃)，用Whatman Grade 1濾紙過濾，濾液用緩沖液定容至25 mL，分別測定572、565、545和525 nm處的吸光值[6]。肌紅蛋白(myoglobin，Mb)、脫氧肌紅蛋白(deoxymyoglobin，DMb)、氧合肌紅蛋白(oxymyoglobin，MbO2)和高鐵肌紅蛋白的(metmyoglobin，MMb)含量按照公式(4)、(5)、(6)和(7)計算：

Mb/(mmol·L-1)=-0.166A572+0.086A565+0.088A545

+0.099A525

(4)

DMb/%=(0.361R1+1.140R2-0.941R3+0.015)×100

(5)

MbO2/%=(0.882R1-1.267R2+0.809R3-0.361)×100

(6)

MMb/%=(-2.541R1+0.777R2+0.800R3+1.098)×

100

(7)

式中：A572、A565、A545和A525分別為572、565、545和525 nm處的吸光值；R1=A572/A525，R2=A565/A525，R3=A545/A525。

1.3.4 蛋白質組成分析

取樣品20 g，分別以10倍體積的0.03 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.4)，10 000 rpm勻漿1 min，4℃提取1.5 h，5000 rpm離心20 min取上清液，重復2次，上清液為肌漿蛋白；在肌漿蛋白中加入30 g/L三氯乙酸(使三氯乙酸終濃度為100 g/L)，3 000 r/min離心15 min，上清液為非蛋白氮。向提取肌漿蛋白后所得的沉淀中加入10倍體積0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(含1.1 mol/L KI，pH 7.4)，提取方法同上，上清液為肌原纖維蛋白；沉淀用去離子水洗滌2次后分成3份。第1份溶于10倍體積氯仿-甲醇(體積比3∶1)溶液，60℃水浴1 h除去脂肪，得總基質蛋白；第2份溶于10倍體積0.1 mol/L乙酸溶液，25℃提取24 h(200 r/min振搖)，5 000 r/min離心20 min取上清液，得酸溶性基質蛋白；第3份溶于10倍體積0.1 mol/LNaOH溶液，25℃提取10 h(200 r/min振搖)，5 000 r/min離心20 min，上清液為堿溶性基質蛋白，沉淀經(jīng)中和、水洗及除去脂肪后，得堿不溶性基質蛋白。采用凱氏定氮法分別測定非蛋白氮、肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、酸溶蛋白和堿溶蛋白的含量，總基質蛋白與堿不溶蛋白于105℃恒重測定其含量[7-8]。

1.3.5 蛋白質溶解性測定

取等量樣品，加入9倍體積去離子水，10 000 r/min勻漿2 min，分別調節(jié)pH為2.0～12.0，4℃浸提30 min，10 000 r/min離心20 min取上清液，BCA(bicinchoninic acid)法測定蛋白含量，根據(jù)公式(8)計算蛋白質的溶解度。

(8)

1.3.6 蛋白質的提取

通過堿溶酸沉法提取鱉肉蛋白，加入2倍體積的去離子水，調節(jié)pH至中性，用30倍體積的去離子水透析，冷凍干燥后得到鱉肉蛋白，凱氏定氮法測定其蛋白含量，計算提取率。

1.3.7 SDS-PAGE分析

參考LAEMMLI[9]和YONGSAWATDIGUL等[10]的方法。配制2 mg/mL的蛋白溶液，與上樣緩沖液以體積比4∶1混合，100℃預熱10 min，取上清液10 μL進行電泳，濃縮膠與分離膠的質量分數(shù)分別為5%和12%?？捡R斯亮藍R-250(質量分數(shù)0.1%)染色，甲醇-乙酸脫色液脫色。

1.3.8 紅外光譜測定

稱取1 mg蛋白樣品與一定量光譜純溴化鉀于瑪瑙研缽中研磨至粉末狀，裝樣并壓制成透明薄片，在400～4 000 cm-1進行掃描。對酰胺Ι帶(1 600～1 700 cm-1)作傅里葉去卷積與二階導數(shù)圖譜，并采用Gausse函數(shù)擬合，計算各二級結構的相對百分含量[11-12]。

1.3.9 熱特性分析

稱取5 mg蛋白于鋁制坩堝中，壓制密封，以空鋁坩堝為空白對照，利用差式掃描量熱儀進行分析，掃描范圍40～100℃、升溫速率10℃/min。

1.3.10 乳化性與乳化穩(wěn)定性

將蛋白溶于30 mmol/L的磷酸緩沖液(含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0)，配制1 mg/mL蛋白溶液25 mL，加入10 mL葵花油，10 000 r/min均質1 min，分別在乳化0和10 min時于底部吸取200 μL，以0.1% SDS稀釋至10 mL，在500 nm處測定吸光值，乳化活性(emulsification activity，EA)與乳化穩(wěn)定性(emulsification stabitity，ES)按照式(9)和(10)計算[13-14]：

(9)

(10)

式中：φ為油相體積分數(shù)，φ=2/7；C為蛋白質質量濃度，g/mL；A0與A10分別為乳狀液在0 min和10 min的吸光值。

1.3.11 起泡性與起泡穩(wěn)定性

配制質量濃度1 mg/mL的蛋白溶液(方法同1.3.10)100 mL于量筒中，10 000 r/min均質2 min，記錄均質后的體積，靜置30 min后再次記錄體積。起泡能力(foaming capacity，F(xiàn)C)和泡沫穩(wěn)定性(foaming stabitity，F(xiàn)S)的計算公式(11)和(12)如下[15]：

(11)

(12)

式中：V0，初始體積，V1和V2分別為均質后和靜置30 min后的體積。

1.3.12 表面疏水性

取1 mg/mL的鱉肉蛋白溶液1 mL，加入1 mg/mL的溴酚藍溶液200 μL混合，室溫振蕩10 min，2 000×g離心15 min，取上清液1 mL稀釋10倍，以磷酸鹽緩沖液作為對照，于595 nm處測定其吸光度值A，蛋白表面疏水性以蛋白結合溴酚藍的量(BPB)表示，按公式(13)計算：

(13)

1.3.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗均重復3次，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示，采用SPSS 17.0和Origin 8.2進行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結果與分析

2.1 基本成分分析

由表1可得，中華鱉肉中的蛋白質含量為(18.61±0.67)%，明顯高于豬肉(肥瘦)13.2%、鴨肉15.5%以及河蝦16.4%、草魚16.6%和河蟹17.5%，略低于羊肉(肥瘦)19.0%、牛肉(肥瘦)19.9%和雞肉19.3%[16]，因此中華鱉肉是一種高蛋白、低脂肪的肉類食品原料。

表1 中華鱉肉基本營養(yǎng)成分Table 1 The nutritional components of Chinesesoft-shelled tutle meat

2.2 氨基酸組成分析

中華鱉肉的氨基酸的組成如表2所示。由氨基酸組成可知，谷氨酸是鱉肉中含量最豐富的氨基酸，占氨基酸總量(total amino acid,TAA)的18.52%，其次為天冬氨酸9.29%、賴氨酸9.15%、亮氨酸8.23%以及精氨酸6.13%。其中必需氨基酸總含量(essential amino acid,EAA)占氨基酸總量的40.82%，非必需氨基酸含量(nonessential amino acid,NEAA)占氨基酸總量的49.32%。根據(jù)FAO/WHO的理想模式，蛋白質氨基酸組成的EAA與TAA的比值在0.4左右且EAA與NEAA的比值在0.6以上的蛋白質為優(yōu)質蛋白質。中華鱉肉中EAA/TAA為0.41，EAA/NEAA為0.83，均優(yōu)于FAO/WHO推薦標準。由此可見，中華鱉肉不僅氨基酸種類齊全，而且氨基酸之間的比例適宜，可以作為補充氨基酸的優(yōu)質蛋白源。

表2 中華鱉肉的氨基酸組成Table 2 Amino acids composition of Chinesesoft-shelled tutle meat

2.3 氨基酸營養(yǎng)評價

本試驗以FAO/WHO于1973年建議的每克氮中氨基酸評分標準模式和中國預防醫(yī)學科學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所提出的全雞蛋蛋白質氨基酸模式為依據(jù)，對中華鱉肉所含的人體必需氨基酸進行營養(yǎng)價值評定。將必需氨基酸含量(%，以干重計)數(shù)據(jù)乘以 0.625 換算成每克氮中含氨基酸的毫克數(shù)后，分別計算出它們的氨基酸評分(amino acid score,AAS)、化學評分(chemical score,CS)和必需氨基酸指數(shù)(essential amino acid index,EAAI)，結果見表3。

表3 中華鱉肉的氨基酸營養(yǎng)評價Table 3 Amino acids nutrition valuation of Chinesesoft-shelled tutle meat

由表3可知，中華鱉肉必需氨基酸中蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、色氨酸、蛋氨酸+半胱氨酸以及苯丙氨酸+酪氨酸的AAS均接近或大于1，CS除色氨酸和蛋氨酸+半胱氨酸外均大于0.5。這表明其必需氨基酸組成與人體的需求模式(FAO/WHO氨基酸評分標準模式)相對平衡，且含量也比較豐富。其中賴氨酸與異亮氨酸的氨基酸評分和化學評分均較高，明顯高于FAO/ WHO理想蛋白模式。根據(jù)AAS結果和CS結果，中華鱉肉的第一限制性氨基酸均為色氨酸，第二限制性氨基酸均為蛋氨酸+半胱氨酸。

2.4 肌紅蛋白含量

動物肌肉中的肌紅蛋白含量是影響肉色的主要因素。中華鱉肉中肌紅蛋白含量處于較高的水平(2.22±0.04)mg/g，明顯高于豬肉1.26 mg/g、雞肉0.99 mg/g[17]以及鰹魚0.55 mg/g[18]，這可能與肌紅蛋白的貯氧功能以及中華鱉獨特的呼吸方式有關。正常肌肉的色澤不僅與肌紅蛋白含量有關還與其氧化還原狀態(tài)有關。肌紅蛋白在還原態(tài)時，為暗紅色的脫氧肌紅蛋白；在充氧狀態(tài)時，為鮮紅色的氧合肌紅蛋白；在氧化狀態(tài)，為褐色的高鐵肌紅蛋白[19]。如圖1所示,中華鱉肉中肌紅蛋白大多以氧合肌紅蛋白的形式存在(69.57%)，小部分以脫氧肌紅蛋白的形式存在(15.63%)，高鐵肌紅蛋白含量很少(0.97%)，鱉肉整體顏色發(fā)亮發(fā)紅，具有誘人的色澤，是新鮮肉的主要特征。

圖1 不同形式肌紅蛋白的含量Fig.1 The content of different forms of myoglobin

2.5 蛋白質組成分析

中華鱉肉的蛋白質組成如圖2所示。中華鱉肉中各組分蛋白的含量為：肌原纖維蛋白>總基質蛋白>堿溶蛋白>堿不溶蛋白>肌漿蛋白>酸溶蛋白，分別占總蛋白含量的48.35%、17.25%、11.84%、10.84%、10.04%和1.54%。肌原纖維蛋白是組成鱉肉最主要的蛋白質，在很大程度上決定了蛋白質的功能特性。其次為總基質蛋白，主要由膠原蛋白及彈性蛋白組成，因此賦予鱉肉以具有較好的彈性口感[20]。堿不溶性蛋白的含量也與肉質有關，中華鱉肉中堿不溶性蛋白含量明顯低于畜禽動物蛋白的16%～18%，高于魚蝦蛋白的3%～4%，即其肉質軟嫩程度位于魚蝦和畜禽肉類之間[2,21]。

圖2 中華鱉肉的蛋白質組成Fig.2 Protein components of Chinese soft-shelled turtle

2.6 蛋白質溶解度分析

根據(jù)蛋白質的pH溶解曲線可以確定蛋白質的最佳溶解及沉淀pH值。如圖3所示，在pH 2.0～12.0，蛋白質的溶解度呈“U形”變化。當pH為5.0～6.0時，鱉肉蛋白質的溶解度最小，因此鱉肉蛋白質的等電點pI位于5.0～6.0，屬于偏酸性蛋白。考慮到蛋白質較長時間處于極端pH條件下可能會發(fā)生變性或水解，且為了提高蛋白的提取率，一般選擇堿性溶液提取酸性蛋白[22]。因此分別選用11.0和5.0作為蛋白質的溶解和沉淀的pH值。

2.7 蛋白提取效果

根據(jù)凱氏定氮法求得，利用堿溶酸沉法得到的鱉肉蛋白其蛋白含量為(77.58±1.43)%，蛋白提取率為(43.19±0.68)%。

圖3 鱉肉蛋白在不同pH下溶解性的變化Fig.3 Solubility of Chinese soft-shelled turtle protein at a various pH

2.8 SDS-PAGE分析

鱉肉蛋白的電泳條帶如圖4所示。鱉肉蛋白的分子質量主要集中分布在29.0～200 kDa，在14.3～29.0 kDa也有小量條帶分布。其中分子質量分別為36、43、200 kDa的原肌球蛋白(trpomyosin，Tm)、肌動蛋白(actin)和肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)是圖譜中濃度較深的3條條帶。鱉肉蛋白條帶中還含有106.9 kDa的α-輔肌動蛋白(α-actinin)、70 kDa的原彈性蛋白(tropoelastin)、51 kDa的結蛋白(desmin)、30.2～35.5 kDa的α-原肌球蛋白(α-tropomyosin)、23 kDa與18 kDa的肌鈣蛋白(troponin，TnI；tropninC,TnC)以及15～25 kDa的肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)[23-24]，60～95 kDa的不明條帶則可能由于肌原纖維蛋白降解產(chǎn)生的。其中，肌球蛋白、原肌球蛋白、肌動蛋白等是構成肌原纖維蛋白的主要蛋白質，因此可以判斷肌原纖維蛋白是組成鱉肉蛋白的主要蛋白質，這與2.5蛋白組成分析中的結論相一致。

圖4 鱉肉蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE pattern of Chinese soft-shelled turtle protein

2.9 紅外光譜與二級結構分析

圖5為鱉肉蛋白的紅外光譜圖，該蛋白質的酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)的強吸收峰位于1 654 cm-1處，是由C=O伸縮振動引起的；酰胺Ⅱ帶(1 600～1 500 cm-1)出現(xiàn)在1 534 cm-1處，是由C—N伸縮振動、N—H彎曲振動、CH2彎曲和COO—對稱伸縮共同引起的。酰胺Ⅲ帶(1 330～1 220 cm-1)位于1 309 cm-1和1 237 cm-1處，主要是由同相N—H彎曲振動和C—N伸縮振動共同引起的。其中由于酰胺Ⅰ帶通常不受肽鏈側基影響，振動頻率取決于肽鏈構型，因此常用其來分析蛋白質的二級結構。

圖5 鱉肉蛋白的傅里葉變換紅外光譜Fig.5 Infrared spectra of Chinese soft-shelled turtle protein

已有文獻[12]證明，紅外光譜擬合曲線各子峰位置與二級結構有如下對應關系：(1 694±2)cm-1、(1 689±2)cm-1、(1 683±2)cm-1、(1 671±3)cm-1和(1 663±4)cm-1為β-轉角；(1 653±4)cm-1為α-螺旋；(1 645±4)cm-1為不規(guī)則卷曲；(1 675±5)cm-1和(1 630±10)cm-1為β-折疊。依次對酰胺Ⅰ帶進行傅里葉去卷積、二階導數(shù)和Guassian擬合，得到鱉肉蛋白的酰胺Ⅰ帶擬合結果如表3所示。鱉肉蛋白二級結構主要以α-螺旋為主，含量為59.39%，其次是β-折疊34.92%和β-轉角5.69%。由于α-螺旋為緊密無腔的結構，結構穩(wěn)定，不利于鱉肉蛋白發(fā)揮其功能特性，而β-結構(40.61%)的緊密程度和構象穩(wěn)定性比α-螺旋差，使得鱉肉蛋白柔韌性得到改善[25]。

表4 中華鱉肉蛋白酰胺Ⅰ帶擬合結果Table 4 Amide Ι band fitting results of Chinesesoft-shelled turtle protein

2.10 熱特性分析

如圖6所示，鱉肉蛋白的熱變性是一個吸熱的過程。在溫度分別為49.45℃(Tmax1，峰Ⅰ)和83.56℃(Tmax2，峰Ⅱ)時可以觀察到2個峰。峰Ⅰ反映了肌球蛋白的熱變性，其變性焓為0.147 4 J/g；而峰Ⅱ則反映了肌動蛋白的熱變性，其變性焓為0.089 J/g，肌動蛋白的穩(wěn)定性比肌球蛋白的熱穩(wěn)定性好[26-27]。

圖6 鱉肉蛋白的DSC圖譜Fig.6 DSC thermograms of Chinese soft-shelled turtle protein

2.11 功能特性

鱉肉蛋白和大豆分離蛋白的乳化性與起泡性如表5所示。蛋白質的乳化性主要表現(xiàn)為其固定脂肪的能力，而蛋白質的起泡性是指蛋白質降低氣-液界面張力形成氣泡的能力[28]。由表5可知，與大豆分離蛋白相比，鱉肉蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性均高于大豆分離蛋白，這可能與鱉肉中富含肌原纖維蛋白有關，由2.5和2.8可知，肌原纖維蛋白是鱉肉蛋白中含量最多的蛋白組分，其能夠形成穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)狀結構，緊密地包裹脂質顆粒[29]，從而發(fā)揮其良好的乳化性。蛋白質的表面疏水性也是影響其乳化性的主要因素，蛋白表面的疏水性氨基酸含量越多，即其表面疏水性越大。由表5可知，鱉肉蛋白的表面疏水性>大豆分離蛋白，這可能是由于鱉肉蛋白表面的疏水基團更易與磷脂發(fā)揮作用，從而具有較好的乳化性[30]。鱉肉蛋白起泡能力遠遠低于大豆分離蛋白，這可能是由于蛋白的起泡性主要與其溶解性有關，鱉肉蛋白暴露出更多的疏水基團，使得蛋白質溶解度較小，導致起泡性也比較小。

表5 中華鱉肉蛋白的功能特性Table 5 Properties of Chinese soft-shelled turtle protein

3 結論

本研究測定鱉肉的蛋白質含量為(18.61±0.67)%，其氨基酸組成符合FAO/WHO的理想模式。鱉肉中肌紅蛋白的含量為(2.22±0.04)mg/g，且大多以氧合肌紅蛋白的形式存在(69.57%)，小部分以脫氧肌紅蛋白的形式存在(15.63%)，高鐵肌紅蛋白含量很少(0.97%)；組成中華鱉肉的蛋白組分含量分別為：肌原纖維蛋白(48.35%)、總基質蛋白(17.25%)、堿溶蛋白(11.84%)、堿不溶蛋白(10.84%)、肌漿蛋白(10.04%)和酸溶蛋白(1.54%)。通過分別在pH 11.0和pH 5.0利用堿溶酸沉法提取得到鱉肉蛋白，其蛋白含量為(77.58±1.43)%，提取率為(43.19%)。鱉肉蛋白的SDS-PAGE顯示其分子質量主要集中在29.0～200 kDa，蛋白條帶主要為肌球蛋白、肌動蛋白和原肌球蛋白。鱉肉蛋白的二級結構中α-螺旋、β-折疊和β-轉角的相對含量分別為59.39%、34.92%和5.69%。鱉肉蛋白的DSC結果主要體現(xiàn)為肌球蛋白和肌動蛋白的熱變性，其變性溫度分別為49.45℃和83.56℃。通過與大豆分離蛋白相比，鱉肉蛋白的乳化性能優(yōu)于大豆分離蛋白，而起泡性能則相反。綜上，鱉肉蛋白是一種營養(yǎng)豐富且加工性能良好的蛋白質。