肖丹,普紅梅,田浩,楊德志,楊亞玲,李宏*

1(云南省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,云南 昆明, 650221) 2 (昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 昆明, 650500)

芒果原產(chǎn)于東南亞熱帶地區(qū)，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)價值較高，特別是芒果所含有的VC和VA的前體胡蘿卜素的含量特別高，有“熱帶水果之王”的美譽。芒果品種繁多，在我國云南、廣西、廣東、福建、臺灣和海南等省份廣泛種植，是我國極為重要的熱帶水果，經(jīng)濟價值較高[1-2]。芒果生長在高溫高濕地區(qū)，果實容易受到微生物的侵染，其又屬于呼吸躍變型水果，導(dǎo)致芒果不易存儲，易于腐爛變質(zhì)[3]。我國國土面積遼闊，很多水果需要從出產(chǎn)地運輸?shù)狡渌胤戒N售，而芒果的這一特點，造成芒果在運輸和儲存過程中發(fā)生較大損耗，嚴重影響芒果的經(jīng)濟效益[4]。目前，已有多種技術(shù)和材料被用于芒果采后保鮮，它們基本上都是從不同方面降低芒果的新陳代謝，以達到延緩芒果的失水、腐爛和褐變等目的。研究者多以殼聚糖、羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉和魔芋葡甘聚糖等天然大分子多糖類材料為覆膜劑，與檸檬酸、CaCl2或抗壞血酸等材料進行復(fù)配，制備成復(fù)合涂膜保鮮劑對水果進行保鮮[4-7]。隨著人們生活水平的提高，加強水果保鮮技術(shù)的研發(fā)，開發(fā)出安全、高效、低廉的芒果保鮮技術(shù)，對產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

碳量子點(carbon dots, CDs)，是一種尺寸小于10 nm的碳納米顆粒，與傳統(tǒng)半導(dǎo)體量子點不同的是，它不會引起環(huán)境、健康及生物毒性問題[8]。碳量子點光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且表面富含多種官能團(如：羧基、羥基和羰基等)，易于實現(xiàn)表面功能化，從而使其具有一定的化學(xué)特性[9-11]。碳量子點具有良好的水溶性，優(yōu)異的生物相容性，低毒性，出色的光穩(wěn)定性和高量子產(chǎn)率，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物成像、化學(xué)傳感和光催化等諸多領(lǐng)域[12]。目前，已有研究者利用光催化技術(shù)催化降解果蔬儲藏期間產(chǎn)生的乙烯，并通過光催化作用達到抑制果肉褐變的目的[13-14]。但是將碳量子點應(yīng)用于水果保鮮上的研究，尚未有所報道。碳量子點，除了在光催化、生物成像等領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用之外，也有研究者將碳量子點進行摻雜化學(xué)改性，而改性的碳量子點在微生物抑菌、殺菌方面表現(xiàn)出較大優(yōu)勢[15-16]。

此研究中，我們選擇以海帶作為碳量子點的合成材料，與天然大分子多糖，如殼聚糖、檸檬酸、抗壞血酸和CaCl2等材料進行復(fù)配，制備成納米復(fù)合涂膜劑用于芒果保鮮，并通過各項指標研究其保鮮效果，以期為芒果保鮮提供新的技術(shù)方法與思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芒果，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供，大小均勻、成熟度基本一致，并且表面無損傷、無蟲害、未經(jīng)化學(xué)藥液處理；海帶(市售)，購自附近超市，清水洗凈后，備用。

殼聚糖、冰醋酸，均為國產(chǎn)食品級；檸檬酸、抗壞血酸、乙二胺、CaCl2均為分析純，購自上海麥克林生物科技有限公司；黑曲霉(Aspergillusniger)，由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

SX2-2.5-10高溫馬弗爐，重慶市松朗電子儀器有限公司；FA1004電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；IKA RW 20 digital機械攪拌器，德國IKA集團；HC-3018R高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；TU-19型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；pHS-3B酸度計，梅特勒-托利多儀器有限公司；VS-1300型潔凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Tecnai G2 F20型透射電子顯微鏡，美國FEI公司；D/Max 2200型X射線衍射儀，美國Rigaku公司；Hitachi S-3400N掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 碳量子點的制備

稱取20.0 g洗凈的海帶，剪碎，加入100 mL去離子水后打碎。然后加入0.5 mL乙二胺混勻，再將其轉(zhuǎn)移到150 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，置于馬弗爐中，在180 ℃下反應(yīng)6 h。待反應(yīng)結(jié)束后冷卻到室溫，最后，所得溶液于10 000 r/min條件下離心20 min，接著用0.22 μm濾膜過濾以除去不溶性顆粒，即制得海帶碳量子點溶液。

1.3.2 涂膜劑的制備

在弱酸性條件下(100 mL H2O中加0.2 mL冰醋酸)，將涂膜材料——殼聚糖溶解，并根據(jù)以下配比制備涂膜劑：涂膜劑Ⅰ，10 g/L殼聚糖；涂膜劑Ⅱ，15 g/L殼聚糖；涂膜劑Ⅲ，2 g/L殼聚糖；涂膜劑Ⅳ，15 g/L殼聚糖+4 g/L CaCl2+4 g/L檸檬酸+5 g/L抗壞血酸；涂膜劑Ⅴ，15 g/L殼聚糖+4 g/L CaCl2+4 g/L檸檬酸+5 g/L抗壞血酸+1.5%(體積分數(shù))海帶碳量子點(每100 mL涂膜劑溶液中含1.5 mL碳量子點溶液)；涂膜劑Ⅵ，15 g/L殼聚糖+4 g/L CaCl2+4 g/L檸檬酸+5 g/L抗壞血酸+3.0%(體積分數(shù))海帶碳量子點(每100 mL涂膜劑溶液中含3 mL碳量子點溶液)；

以不作處理的為對照組。

1.3.3 保鮮處理與測定方法

芒果經(jīng)過自來水沖洗，晾干明水后，進行分組，每組50個。首先，將6組芒果分別放入不同的涂膜劑中，浸泡2 min，使涂膜劑均勻覆蓋在芒果表面。撈出后，放于通風(fēng)處自然晾干。將上述處理好的芒果放置于托盤，室溫(25℃)下保存。對照組不作處理，直接放置于室溫條件下保存。所有上述試驗均重復(fù)3次。

上述芒果，每組分為2份，第一份30個，每天對其進行稱重，并統(tǒng)計其腐爛個數(shù)，計算其腐爛率；第二份20個，用于測定分析芒果在儲藏期間的生理生化指標情況。主要測定指標：(1)VC含量變化(2,6-二氯酚靛酚滴定法測定)；(2)芒果總糖(手持糖量計測量)和含酸量變化(滴定法測量)；(3)過氧化物酶活性[17]。

1.4 菌種的分離培養(yǎng)和抑菌試驗

事先按照文獻中方法配制LB培養(yǎng)基[18]和PDA培養(yǎng)基。試驗中，以75%酒精、無菌水先后清洗芒果表皮3次，然后以無菌鑷子取芒果表皮腐爛的部分，然后以5 mL生理鹽水清洗腐爛表皮，此步驟重復(fù)3次，最后收集洗脫液(此過程在酒精燈火焰旁操作，防止空氣中的微生物污染洗脫液)。

真菌的分離：取100 μL上述洗脫液，使用涂布環(huán)均勻接種到LB培養(yǎng)基上(在酒精燈火焰旁操作)，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基上細菌和真菌的形態(tài)。再使用消毒牙簽挑選培養(yǎng)基上的真菌轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進行轉(zhuǎn)接、純化。將此純化的真菌進行培養(yǎng)，作為真菌對照組Ⅱ。

試驗分組：對照組Ⅰ取5 mL上述含菌洗脫液，加1 mL無菌水，混勻備用。試驗組Ⅰ取5 mL上述含菌洗脫液，加1 mL碳量子點(2種不同濃度2.5 mg/L和5 mg/L)，混勻備用；試驗組Ⅱ取5 mL上述含菌洗脫液，加1 mL15 g/L殼聚糖溶液，混勻備用；試驗組Ⅲ取5 mL上述含菌洗脫液，加1 mL15 g/L殼聚糖(含4 g/LCaCl2+4 g/L檸檬酸+5 g/L抗壞血酸)溶液，混勻備用；試驗組Ⅳ取5 mL無菌水，加入1 mL碳量子點(濃度為5 mg/L)，混勻備用。

對于實驗組Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ以及對照組Ⅰ，分別取100 μL的含菌溶液，使用涂布環(huán)接種到LB培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)48 h后，觀察期抑菌效果。肉眼觀察菌體生長情況，試驗組有菌落生長則為無抑制作用，無菌落生長則為有抑制作用。對于試驗組Ⅳ，取100 μL溶液，涂布于經(jīng)過真菌接種之后的培養(yǎng)基上。觀察真菌生長狀況。

1.5 孢子萌發(fā)率的測定試驗

采用孢子萌發(fā)法進行碳量子點的抑菌效果研究，在培養(yǎng)皿中間的凹玻片中分別加入50 μL的黑曲霉孢子懸液和50 μL不同濃度的碳量子點溶液，濃度分別為0.5、1、1.5、2、2.5和5 mg/L，28 ℃培養(yǎng)。每個玻片孢子總數(shù)為100個，當(dāng)對照組孢子萌發(fā)率為70%～80%時，使用顯微鏡觀察不同碳量子點濃度下孢子的萌發(fā)數(shù)，并計算孢子萌發(fā)抑制率,如公式(1)、(2)所示。

(1)

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶碳量子點的表征和芒果表面真菌形態(tài)的觀察

圖1-a為所制備的海帶碳量子點的高分辨透射電鏡圖(TEM)，用于分析碳量子點的形貌和粒徑分布。如圖所示，海帶碳量子點呈球形，尺寸均勻，且分散性好，平均粒徑為3.1 nm。圖1-a中插圖顯示，碳量子點的晶格間距為0.23 nm，與石墨烯的晶體結(jié)構(gòu)相對應(yīng)[19]。研究中，X射線衍射圖譜(XRD)也被用于進一步研究海帶碳量子點的組成。如圖1-b所示，碳量子點在2θ=23.6°出現(xiàn)一個較寬的峰，這與石墨烯的結(jié)構(gòu)相對應(yīng)[20]。上述結(jié)果均表明，海帶成功合成了碳量子點。圖1-c為芒果表面分離純化的真菌的掃描電子顯微鏡(SEM)圖。芒果貯藏期病害主要是病原物，主要有曲霉病、炭疽病和蒂腐病等[21]。芒果曲霉病病原菌屬于半知菌亞門，分別為黑曲霉和黃曲霉，其中黑曲霉最為常見[22]，通過與黑曲霉真菌形態(tài)等相對比，可知芒果表皮分離的真菌是黑曲霉。

a-碳量子點高分辨透射電鏡圖；b-碳量子點X衍射圖譜；c-芒果表面的真菌掃描電子顯微鏡圖；d-碳量子點對黑曲霉孢子萌發(fā)的抑制率圖1 碳量子點和芒果表皮上真菌的表征與碳量子點對真菌的抑制效果Fig.1 Characterization of carbon dots and fungi, and inhibition effect of CDs on fungi

由圖1-d可知，隨著碳量子點濃度的升高，其對黑曲霉孢子萌發(fā)抑制率顯著提高。當(dāng)碳量子點濃度為5 mg/L時，孢子萌發(fā)抑制率為82.06%。

2.2 碳量子點的抑菌效果研究

圖2-b和2-c所示分別為試驗組Ⅰ中2.5 mg/L和5 mg/L的碳量子點的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)與對照組Ⅰ相比，碳量子點的加入能顯著抑制菌落的生長，并且隨著濃度的增加，抑菌效果增加。與對照組Ⅰ相比，加1 mL 5 mg/L的碳量子點時，培養(yǎng)基表面已無細菌生長(見圖2-c)；而加入1 mL 2.5 mg/L碳量子點時，仍有極個別菌落出現(xiàn)(見圖2-b)。圖2-d和2-e所示為抑菌研究試驗組Ⅱ和試驗組Ⅲ結(jié)果，發(fā)現(xiàn)殼聚糖具有一定的抑菌效果，可能原因是殼聚糖對革蘭氏陰性菌的抑菌作用的結(jié)果[23]。試驗組Ⅲ的結(jié)果，從側(cè)面說明CaCl2、檸檬酸和抗壞血酸的加入，并沒有進一步提高抑菌效果。以上結(jié)果說明，海帶碳量子點能有效限制芒果表面細菌的生長。

圖2-f和2-g所示為真菌對照組Ⅱ和試驗組Ⅳ的抑菌效果圖。在相同條件下，加入5 mg/L的海帶碳量子點之后，與對照組Ⅱ相比，抑菌效果明顯，PDA培養(yǎng)基上只出現(xiàn)極個別菌落。此結(jié)果表明，海帶碳量子點對芒果表面分離出的真菌有明顯的抑制作用。

a-取自芒果表面的細菌培養(yǎng)結(jié)果(對照組Ⅰ)；b和c-碳量子點的抑菌效果圖(試驗組Ⅰ)；d和e-不同涂膜劑的抑菌效果圖(試驗組Ⅱ和試驗組Ⅲ)；f-芒果表面真菌培養(yǎng)結(jié)果(對照組Ⅱ)；g-碳量子點對真菌的抑菌效果圖(試驗組Ⅳ)圖2 碳量子點的抑菌效果研究Fig.2 Study on the antibacterial effect of CDs

2.3 涂膜劑對芒果理化指標的影響

2.3.1 不同涂膜劑對芒果失水率的影響

芒果水分的散失，會造成其表皮干癟。由圖3可知，經(jīng)過不同的涂膜劑處理之后，會顯著降低芒果的失水率。在室溫保存8 d后，對照組芒果水分損失高達13.30%，而試驗組中芒果水分損失最大也只有8.91%。保存18 d之后，試驗組(涂膜劑Ⅴ)的芒果幾乎無皺紋出現(xiàn)，而對照組芒果已出現(xiàn)明顯褶皺且腐爛。結(jié)果表明，隨著殼聚糖含量的增加，在一定程度上，保水效果也逐漸增加。但殼聚糖含量的增加，也會導(dǎo)致涂膜劑的黏度增加，涂層也變厚，涂布效果較差，不利于實際操作。在放置多天之后，2.0%殼聚糖含量的涂膜劑涂層變脆，輕微碰撞之后涂層即破損并出現(xiàn)裂紋。故研究中選擇1.5%的殼聚糖作為成膜材料。

圖3 不同涂膜劑對芒果失水率的影響Fig.3 Effect of different coatings on water-loss rate of mango

2.3.2 不同涂膜劑對芒果腐爛率的影響

芒果本身屬于呼吸躍變型水果，再加上其生長在高溫高濕的環(huán)境中，易于受到微生物、細菌等的侵擾，造成芒果不易儲存，易于腐爛。試驗中，我們分別用上述5種涂膜劑處理芒果。由圖4可以看出，在放置20 d后，經(jīng)過復(fù)配涂膜劑處理的試驗組(腐爛率12.1%～22.3%)芒果腐爛率明顯低于未經(jīng)處理的對照組(腐爛率73%)。

圖4 不同涂膜劑對芒果腐爛率的影響Fig.4 Effect of different coatings on rotting rate of mango

涂膜劑Ⅰ和涂膜劑Ⅲ處理10 d之后芒果保鮮結(jié)果表明，單獨使用殼聚糖作為涂膜劑會出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。與之相反，其他復(fù)配涂膜劑涂膜的試驗組芒果則沒有出現(xiàn)褐變。其原因可能是，CaCl2、檸檬酸和抗壞血酸的加入，能有效防止褐變產(chǎn)生[5, 24]。到第20天時，涂膜劑Ⅳ試驗組腐爛率為22.3%，而涂膜劑Ⅴ和涂膜劑Ⅵ試驗組在20 d后腐爛率才達到12.1%～13.4%。結(jié)果表明，加入少量碳量子點后，即能顯著提高涂膜劑的保鮮效果。其原因可能是，碳量子點具有一定的抑菌、殺菌作用，能抑制或殺滅芒果表面可能存在的細菌等，從而降低芒果的腐爛率[14-15]。

2.3.3 VC含量的變化

貯藏期間，芒果中VC的含量，會隨著時間的增長逐漸出現(xiàn)下降的趨勢。由圖5可知，經(jīng)過不同涂膜劑處理的芒果，VC含量明顯高于對照組。原因可能是，經(jīng)過涂膜劑處理過后的芒果，表面會形成一層膜，在膜內(nèi)層會形成低氧氣、高二氧化碳濃度的環(huán)境，可以有效降低VC的氧化速度[25-26]。但單獨使用殼聚糖作為涂膜材料時，與其他試驗組相比，芒果中VC含量下降稍快。第8天時，涂膜劑Ⅱ試驗組中VC含量為43.16 mg/100 g，涂膜劑Ⅳ試驗組中VC含量為47.32 mg/100 g，而涂膜劑Ⅴ試驗組中維生素含量最高，含量為54.22 mg/100 g。此結(jié)果說明，在殼聚糖成膜材料中復(fù)配少量碳量子點后，能進一步減緩芒果VC含量的降低。其原因可能是：一方面，通過在涂膜劑中加入抗壞血酸、檸檬酸和CaCl2，能有效抑制芒果的褐變反應(yīng)，降低芒果中抗壞血酸的氧化[5, 22]；另一方面，可能是海帶碳量子點具有一定的抑菌、殺菌作用，通過抑制或殺菌作用，降低細菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，最終達到延緩VC氧化的目的。

圖5 不同涂膜劑對芒果中VC含量的影響Fig.5 Effect of different coatings on VCcontent in mango

2.3.4 芒果中總糖和含酸量的變化

芒果的呼吸作用會消耗總糖和酸，其含量的變化速度也可用來反映呼吸作用的強弱。芒果采后的貯藏期間，總糖含量首先會明顯上升，達到一定峰值后會逐漸降低并趨于平穩(wěn)。由圖6可知，對照組在第4天總糖即達到峰值，而涂膜劑處理后，在第5天或6天總糖才到達峰值。相對來講，涂膜劑Ⅴ和涂膜劑Ⅵ試驗組中，芒果總糖達到峰值的時間比其他組稍慢，達到峰值后下降的趨勢也相對緩和，保鮮效果最好。此外，由圖7可以看出，在第8天時，涂膜劑Ⅱ、涂膜劑Ⅳ、涂膜劑Ⅴ和涂膜劑Ⅵ試驗組含酸量，分別為0.38、0.48、1.39和0.53 g/100 g，對照組芒果含酸量僅為0.17 g，差異顯著。酸度以檸檬酸計，每100 g樣品。結(jié)果表明，涂膜劑能有效降低或延緩芒果中酸的轉(zhuǎn)化與降解過程。

圖6 不同涂膜劑對芒果中總糖含量的影響Fig.6 Effect of different coatings on total sugar content in mango

圖7 不同涂膜劑對芒果中酸含量的影響Fig.7 Effect of different coatings on acid content in mango

2.3.5 過氧化物酶活性的變化

芒果在呼吸躍變之前，組織中存在許多酶抑制劑，酶活性的變化與呼吸作用密切相關(guān)。但芒果成熟后，組織中的酶抑制劑會逐漸失活，酶活性則會增加，最終會加快芒果的成熟。如圖8所示，對照組芒果中過氧化物酶活性變化最大，而經(jīng)過不同涂膜劑處理后，均能在一定程度上抑制過氧化酶的活性。

圖8 不同涂膜劑對芒果中過氧化物酶活性的影響Fig.8 Effect of different coatings on peroxidase activity in mango

3 結(jié)論

本研究利用天然高分子多糖物質(zhì)—殼聚糖為涂膜材料，和天然綠色的海帶為碳量子點合成原料，先通過水熱法制備海帶碳量子點，然后再將少量碳量子點與檸檬酸、抗壞血酸和CaCl2等材料進行復(fù)配，制備出了碳量子點/殼聚糖涂膜劑。該涂膜劑能有效降低芒果的腐爛率和失水率，抑制了VC、酸和總糖含量的下降，延緩了芒果的后熟過程，最重要的是合成的海帶碳量子點，能夠有效抑制芒果表面的細菌和真菌的生長。并且，該種納米乳涂膜劑制備簡單、原料易得、無毒無害、天然綠色，對環(huán)境無污染，具有良好的保鮮效果。將無毒無害的碳量子點作為復(fù)配材料，應(yīng)用于果蔬涂膜保鮮材料，具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>