劉微，張景，李姝薈，張宇昊,2，劉曉竹，馬良,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(西南大學(xué)生物科學(xué)研究中心，重慶，400715) 3(重慶微奧云生物技術(shù)有限公司，重慶，400039)

黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是各種黃曲霉毒素中危害最大最受關(guān)注的毒素，早在1993年就被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)劃定為Ⅰ類致癌物[1-2]。AFB1廣泛存在于花生、玉米等油料作物中，對人類健康和牲畜安全造成了嚴(yán)重威脅[3]。在我國，花生油作為產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的植物油脂之一，其質(zhì)量安全問題備受關(guān)注。因花生在貯運(yùn)過程中易受黃曲霉等微生物的侵染，加工后的花生油若不經(jīng)去毒處理，易含超標(biāo)的黃曲霉毒素(主要為AFB1)，因此許多國家和組織都對AFB1在花生油中的限量標(biāo)準(zhǔn)做出了嚴(yán)格規(guī)定[4]，我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017[5]中規(guī)定：花生油、花生及其制品中的AFB1檢出量≤20 μg/kg；而歐盟更加嚴(yán)格地限定為≤2 μg/kg[6]。嚴(yán)格的限定標(biāo)準(zhǔn)意味著需要更精準(zhǔn)的檢測技術(shù)作為支持，因此研究建立靈敏、準(zhǔn)確、快速的黃曲霉毒素檢測方法，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的現(xiàn)實意義。

目前基于電化學(xué)的AFB1檢測法擁有快速、靈敏等顯著優(yōu)勢，尤其是以電化學(xué)傳感器為基礎(chǔ)的各種檢測技術(shù)是近幾年的研究熱點(diǎn)。利用標(biāo)記抗體、適配體、酶等生物分子作為識別元件構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器[7]、電化學(xué)適體傳感器[8-9]、電化學(xué)酶傳感器[10-11]具有快速、高靈敏度、高特異性的檢測特性，但是樣品的前處理過程以及敏感元件與靶標(biāo)物質(zhì)的反應(yīng)時間仍然較長。

交流電動(AC electrokinetics，ACEK)可以通過交流電場作用對被測分子進(jìn)行富集并促進(jìn)其與捕獲元件的快速、充分結(jié)合，提升檢測速度、靈敏度和可靠性[12]。使用ACEK作為待測物的富集方法，通過電容變化來判斷被測物的反應(yīng)情況，目前已被用于檢測蛋白質(zhì)[13]，雙酚A[14-15]，黃體酮[16]等物質(zhì)，但在食品安全尤其是真菌毒素檢測中目前尚未有研究。

本研究采用微電極上負(fù)載抗AFB1單抗的形式，引入交流電信號，使被測液體產(chǎn)生局部流體運(yùn)動，促進(jìn)AFB1分子的定向運(yùn)動和富集，通過測定微電極上抗原-抗體結(jié)合前后的電容變化來對AFB1進(jìn)行定量，從而開發(fā)出基于ACEK電容式感應(yīng)原理的快速、高靈敏檢測AFB1的免疫傳感方法，尤其適用于食用油等液態(tài)食品中AFB1的快速前處理及檢測，實現(xiàn)花生油中AFB1的快速高靈敏檢測，同時為微芯片的商品化應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)標(biāo)準(zhǔn)品(AFB1、AFB2、AFG1、AFM1)；赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，新加坡Pribolab公司；抗AFB1單克隆抗體(6 mg/mL)，北京沫之東生物技術(shù)有限公司；硫脲(thiourea，TU)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；戊二醛(glutaric dialdehyde，GA)、丙酮、無水乙醇、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O，成都市科龍化工試劑廠；6-巰基己醇(MCH)，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；Super Block-Blocking Buffer，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；壓榨花生油，當(dāng)?shù)厥惺?。所有試劑均為分析純，試驗用水為超純水?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

E4990A阻抗分析儀(20 Hz-110 MHz)，德科技(中國)有限公司；CHI610E電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司；叉指金微電極陣列芯片(金電極寬度為5 μm，厚度約 100～200 nm，指間距為5 μm，成對的金電極周期性地分布在石英基底上形成電極陣列，四周以陶瓷作為邊界材料構(gòu)建免疫反應(yīng)室微腔，該微腔尺寸約為 4.5 mm×3 mm×1 mm，固定于可連儀器進(jìn)行檢測的配套芯片)，重慶微奧云生物技術(shù)有限公司；KW-4AC紫外固化機(jī)，上海凱美特功能陶瓷技術(shù)有限公司；KQ3200DV型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AFB1免疫傳感器的構(gòu)建和電信號表征

微電極芯片經(jīng)丙酮浸泡20 min，無水乙醇、超純水依次沖洗20 s后氮?dú)獯蹈?，紫外固化機(jī)對電極表面改性20 min后浸入250 mmol/L TU水溶液中，室溫放置24 h后超純水沖洗晾干，滴加10 μL 5%(GA與水的體積比)的GA水溶液，25 ℃放置10 min，10 μL 1 mmol/L pH 7.0的PBS溶液清洗2～3次，吸水紙吸干后滴加10 μL、10 μg/mL的抗AFB1單抗溶液，25 ℃放置18 h，PBS清洗2～3次后用吸水紙吸干，再滴加10 μL、10%Super Block室溫放置30 min，PBS清洗2～3次，吸水紙吸干。

在前述每一步驟修飾后的微電極芯片中滴加10 μL PBS，使用電化學(xué)工作站cyclic voltammetric(CV)掃描模式，在-0.6～+0.6 V電位范圍，以50 mV/s對微電極芯片進(jìn)行電信號表征。

1.3.2 TU、GA修飾濃度和時間對傳感及富集效果的影響研究

依據(jù)1.3.1對芯片進(jìn)行預(yù)處理后滴加10 μL PBS，用阻抗儀測定電極表面電容值Cz，對TU的修飾濃度和時間、GA的修飾濃度和時間等進(jìn)行研究，相應(yīng)處理后測定電極表面電容值Ci，根據(jù)公式(1)計算電容變化率[15-17]:

(1)

式中：Ci修飾ih后的電極表面電容值;Cz修飾0 h后的電極表面電容值。

各因素研究條件如下：

TU濃度：10、25、50、100、250、500 mmol/L

TU修飾時間：0.5、1、3、6、12、24、36、48 h

GA濃度：1%、5%、10%(GA與水的體積比)

GA修飾時間：5、10、20、30、60、120 min

1.3.3 抗AFB1單抗修飾濃度和時間對傳感及富集效果的影響研究

研究不同AFB1單抗?jié)舛?1、2、3、6、10、20 μg/mL)和孵育時間(3、6、12、18、24 h)對傳感及富集效果的影響。處理已修飾好TU和GA的芯片，封閉后用阻抗儀測定芯片表面電容C0。之后滴加固定濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待免疫反應(yīng)結(jié)束后再次測定芯片表面電容C，根據(jù)(2)式計算歸一化電容變化率(dC/dt(%/min))[15, 17]。

(2)

式中：C0，免疫反應(yīng)前電極表面電容;C，免疫反應(yīng)后電極表面電容;dAFB1、dAb和dEDL分別為目標(biāo)物AFB1、特異性抗AFB1單抗和雙電層的厚度；εAFB1、εAb和εEDL分別為目標(biāo)物AFB1、抗體和樣品溶液的介電常數(shù)。

1.3.4 抗AFB1單抗修飾濃度和時間對傳感及富集效果的影響研究

將交流電頻率(0.5、1、3、5、50 kHz)和電壓(5、10、50、100、200、300 mV)分別作為變量，施加在構(gòu)建好的免疫傳感器上，測定固定濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測定免疫反應(yīng)前后的芯片表面電容C0和C，根據(jù)(2)式計算歸一化電容變化率，并設(shè)置空白組，以測定背景液的電容響應(yīng)值。

1.3.5 實際樣品檢測

稱取1.00 g花生油，加入3 mL正己烷和5 mL 70%甲醇水溶液，超聲功率60%處理10 min，10 000 r/min離心10 min，取下層溶液10 μL用PBS稀釋100倍，取10 μL滴加于處理好的微電極芯片表面，在交流頻率和電壓分別為3 kHz和50 mV的條件下，用阻抗分析儀檢測免疫反應(yīng)前后電極表面電容，根據(jù)(2)式計算歸一化電容變化率，利用線性關(guān)系式計算出AFB1含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1免疫傳感器的構(gòu)建與表征

電極表面修飾過程如圖1所示。TU首先與金電極反應(yīng)形成硫金鍵；繼而GA中的醛基與TU中的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)；最后GA另一端暴露的醛基與抗體中氨基進(jìn)行席夫堿反應(yīng)，從而將抗體固定在電極表面。

圖1 免疫傳感器構(gòu)建示意圖Fig.1 Immunosensor construction diagram

用1.3.1中的方法對電極進(jìn)行表征，由圖2可知，當(dāng)工作電極為裸金電極時，響應(yīng)電流最大， 而TU通過巰基自組裝到金電極上后響應(yīng)電流減小，表明金電極表面形成了有序、致密的巰基單層膜，使得金電極表面電阻增大，從而使響應(yīng)電流減小。當(dāng)電極上TU的氨基與GA的醛基結(jié)合后，形成的修飾膜電阻繼續(xù)增大，電流繼續(xù)減小?？笰FB1單抗與封閉蛋白通過氨基與GA尾端的醛基共價結(jié)合后，電極響應(yīng)電流均進(jìn)一步減小，因為蛋白是非導(dǎo)電物質(zhì)，會使電極電阻持續(xù)增大。

圖2 修飾電極的循環(huán)伏安法表征Fig.2 Cyclic voltammetric characterization of modified electrode

2.2 傳感及富集效果的影響因素研究

2.2.1 TU修飾濃度及時間

由圖3-a可知，0～250 mmol/L的TU修飾電極24 h，電容變化率一直減小，說明TU的濃度越高，固定在電極表面的分子就越多，導(dǎo)致界面雙電層厚度不斷增加，電容也就隨之減小。在TU濃度達(dá)到250 mmol/L后電容變化率趨于穩(wěn)定，說明250 mmol/L濃度的TU可能使電極表面位點(diǎn)基本被占滿，達(dá)到飽和狀態(tài)。

由圖3-b可知，固定TU濃度為250 mmol/L，修飾時間少于6 h時，電容變化率逐漸增加，說明TU分子不斷固定在電極表面，電極表面的界面雙電層電容逐漸增大，但由于時間較短，排布不均，此時雙電層電容器的面積變化是制約電容變化的主要因素，電容隨著電極表面積的增加而增大；修飾時間大于6 h時，電容變化率開始減小，說明此時TU排布趨于均勻，表面電容主要受雙電層厚度變化影響，隨著更多TU分子的均勻組裝，電極表面的界面雙電層厚度增大，電容減??；修飾時間達(dá)到24 h以上，電容變化率趨于穩(wěn)定，表明TU已較均勻地固定在電極表面。故TU修飾濃度和時間分別確定為250 mmol/L、24 h。

圖3 TU不同修飾濃度及時間對電極表面電容變化率的影響Fig.3 Effect of different modification concentration and time of TU on the change rate of surface capacitance

2.2.2 GA修飾濃度及時間

由圖4可知，從修飾時間上看，電容變化率均隨著時間的延長先增后減，這是由于雙電層電容器的面積大小及界面雙電層厚度兩者同時制約電容的變化，隨著時間的推移，主導(dǎo)因素由電容器的面積逐漸轉(zhuǎn)向雙電層厚度。10 min是電容變化率由增到減的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，說明此時界面雙電層電容器的面積最大，可以提高抗體的固定量并最大程度保持抗體抗原結(jié)合能力，因此GA的修飾時間確定為10 min。

圖4 GA不同修飾濃度及時間對電極表面電容變化率的影響Fig.4 Effect of different modification concentration and time of GA on the change rate of surface capacitance

從GA的濃度上看，在GA修飾時間為10 min時，電容變化率的大小關(guān)系為5% GA>10% GA>1% GA，表明隨GA濃度增加，電容變化率呈現(xiàn)先增后減的趨勢，同樣，當(dāng)GA濃度較小時，界面雙電層電容器的面積變化占主導(dǎo)地位，面積增大使得電容增大，當(dāng)GA濃度增大時，雙電層厚度變化占主導(dǎo)地位，厚度增加使得電容減小。同時，GA的濃度對抗體的交聯(lián)有很大的影響，濃度過低會使交聯(lián)的抗體量降低，濃度過高又會使交聯(lián)的抗體失活[18]。在5%和10%濃度的GA修飾下，電容變化率差距不大，說明當(dāng)濃度大于5%時，GA的結(jié)合開始接近飽和的狀態(tài)，因此最終GA濃度確定為5%。

2.2.3 抗AFB1單抗包被濃度及時間

使用AFB1標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行免疫反應(yīng)后的信號值與背景液信號值的差異代表了電極上抗原-抗體結(jié)合物的數(shù)量，側(cè)面反映了抗體在芯片上的包被情況，如圖5所示，單抗?jié)舛葹?0 μg/mL，包被時間為18 h時免疫反應(yīng)后的信號值與背景液的信號值歸一化計算后差值最大，說明此時芯片上可結(jié)合的靶標(biāo)物質(zhì)最多，檢測效果最好。

a-AFB1單抗?jié)舛?；b-AFB1單抗包時間圖5 不同抗AFB1單抗包被濃度及時間對檢測電容變化率的影響Fig.5 Effect of different AFB1 McAb modification concentration and time on capacitance change rates

2.2.4 交流電動作用的頻率和電壓對AFB1加速富集作用的影響

由圖6可知，在頻率由500 Hz增大至50 kHz、電壓由0 mV增大至300 mV的過程中，歸一化電容變化率的AFB1檢測值和背景液信號之差均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在3 kHz和50 mV時表現(xiàn)最大。這說明當(dāng)交流電頻率和電壓分別為3 kHz和50 mV時，交流電動作用對待測液中的目標(biāo)物產(chǎn)生較好的加速富集作用，在該條件下，當(dāng)待測液中AFB1濃度一定時，能被電極表面的單抗捕獲的AFB1分子最多，響應(yīng)值最大，因此靈敏度和準(zhǔn)確度達(dá)到最優(yōu)。

圖6 不同頻率及電壓對檢測電容變化率的影響Fig.6 Effect of different frequency and voltage of functional electrode on capacitance change rates

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 線性范圍與檢測限

在本研究確定的條件下，測定不同濃度AFB1的電容變化率(每個濃度水平做3個平行樣)，在 10-6～10-2μg/mL，AFB1濃度的對數(shù)值與電極表面電容變化率成良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為C=10[ (dC/dt)+19.98]/-1.57，R2=0.993 6，最低檢出限為 2.01×10-7μg/mL(3 σ/S)，定量限為2.35×10-7μg/mL(10 σ/S)[19]。結(jié)合1.3.5中樣品前處理過程，實際樣品中AFB1含量檢測范圍為0.8～8 000 μg/kg，含量計算公式為C=10[ (dC/dt)+22.82]/-3.14，相關(guān)系數(shù)r=0.996 8，完全可以滿足食用油中痕量AFB1的檢測需求(食用油中AFB1限量標(biāo)準(zhǔn)為≤20 μg/kg[5])。

圖7 電容變化率與AFB1濃度的函數(shù)關(guān)系Fig.7 Capacitance change rate as a function of AFB1 concentrations

2.3.2 精密度

以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)衡量該方法的精密度，結(jié)果如表1，RSD(n=5)為6.63%～15.60%，表明該方法的精密度良好。

表1 不同濃度水平的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Relative standard deviation at differentconcentration levels

2.3.3 準(zhǔn)確度

對花生油樣品進(jìn)行不同濃度的加標(biāo)回收試驗(每個添加水平做3個平行樣，每個樣品做3次重復(fù)檢測)，結(jié)果如表2，平均加標(biāo)回收率為85.20%～97.70%。

表2 實際樣品加標(biāo)回收試驗Table 2 Standard-added recovery test of actual samples

2.3.4 特異性

采用構(gòu)建的AFB1免疫傳感器對AFB1和AFB2、AFM1、AFG1、OTA、DON、ZEN等共存干擾毒素(AFB1濃度的100倍)進(jìn)行特異性和抗干擾能力的檢測(每種毒素做3個平行樣)。結(jié)果如圖8所示，當(dāng)檢測物為AFB1時，電容變化率最大，說明電極表面發(fā)生大量的免疫結(jié)合反應(yīng)，使得檢測響應(yīng)值發(fā)生較大變化；檢測背景液或干擾毒素時，干擾毒素濃度為AFB1的100倍，電容變化率仍不足AFB1信號值的1/5，說明此時電極表面未發(fā)生或較少發(fā)生特異性結(jié)合，表明該傳感器特異性良好。

圖8 不同毒素的電容變化率Fig.8 Capacitance change rates for different toxins

3 結(jié)論與討論

本研究構(gòu)建了AFB1檢測的微芯片免疫傳感平臺，通過交流電動作用加速富集，打破傳統(tǒng)免疫反應(yīng)單純依靠目標(biāo)物自身隨機(jī)運(yùn)動與抗體結(jié)合發(fā)生特異性結(jié)合的方式，顯著提高檢測的靈敏度(檢出限為2.01×10-7μg/mL)并縮短痕量檢測時間(30 s)，展現(xiàn)出了良好的準(zhǔn)確度、精密度和特異性，與文獻(xiàn)中的同類方法對比(如表3)，優(yōu)勢明顯。

表3 AFB1測定方法的比較Table 3 Comparison of different methods for thedetermination of AFB1

本研究不僅為花生油中AFB1的快速、高靈敏檢測提供了一種新方法，而且替換相應(yīng)的抗體后，該方法理論上可以應(yīng)用于其他真菌毒素的檢測。