張瑾瑤 楊琳 李峻嶺

目前，肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（neuroendocrine tumor,NET）分為4種亞型：典型類癌（typical carcinoid,TC）、非典型類癌（atypical carcinoid,AC）、小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌（large cell neuroendocrine carcinoma,LCNEC）[1]。其中，肺LCNEC的發(fā)病率占肺癌手術(shù)標(biāo)本的2.4%-3.1%[1-3]，屬于高級(jí)別神經(jīng)內(nèi)分泌癌（high grade neuroendocrine carcinoma,HGNEC），具有侵襲性高、預(yù)后差的特點(diǎn)；患者發(fā)病的平均年齡在65歲左右，且與吸煙高度相關(guān)[4,5]。大部分患者確診時(shí)疾病已處于中晚期，手術(shù)治療效果有限，術(shù)后復(fù)發(fā)幾率大，需要結(jié)合全身治療來提高療效[5]；因此，需對(duì)肺LCNEC進(jìn)行探索，尋找有效的治療靶點(diǎn)及篩選治療敏感的患者。但因發(fā)病率低、樣本量少的原因，有關(guān)肺LCNEC的分子分型、分子診斷及預(yù)后分子標(biāo)志物的相關(guān)研究較少，僅近年來有所進(jìn)展。本文結(jié)合近幾年國(guó)內(nèi)外有關(guān)肺LCNEC的基因分子研究進(jìn)行闡述。

1 肺大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌的基因圖譜改變

1.1 基因突變 研究[6-8]表明在肺LCNEC中，大部分突變的基因是抑癌基因，且與吸煙相關(guān)，其基因圖譜的改變與SCLC相似。George等[8]對(duì)60例LCNEC組織進(jìn)行全基因組測(cè)序和69例進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；與正常組織相比，發(fā)現(xiàn)具有意義的基因突變分別是TP53、RB1、STK11、KEAP1及RAS（KRAS/NRAS/HRAS）通路上的基因；在肺LCNEC中出現(xiàn)的比例分別是92%、42%、30%、22%和10%。在40%LCNEC病例中發(fā)現(xiàn)了TP53和RB1這兩個(gè)基因的雙等位基因改變；值得注意的是，與其他組織學(xué)成分混合的LCNEC病例大多具有RB1的突變[8]。這些基因的突變類型主要是點(diǎn)突變和缺失突變[8]。另有學(xué)者[9]對(duì)32例肺LCNEC組織進(jìn)行測(cè)序，同樣也發(fā)現(xiàn)了TP53、STK11、PTEN等基因的改變。同時(shí)，也證實(shí)了在肺LCNEC中NOTCH1-4基因的突變率比較高，并引起NOTCH通路的改變，最終影響神經(jīng)內(nèi)分泌的分化[7,10-12]。共同參與神經(jīng)內(nèi)分泌分化的基因還有YAP1、hASH1、Hes1、Bcl-2、DLL1和NeuroD等，而這些基因則是通過調(diào)節(jié)表達(dá)量來參與神經(jīng)內(nèi)分泌分化[8,13-15]。和肺類癌一樣，染色質(zhì)重塑相關(guān)的基因也發(fā)生突變；例如：MEN1、ARID1A、ARID1B及MLL1-3[7,11,12]。在PI3K-AKT-mTOR通路上也發(fā)現(xiàn)了相關(guān)基因的突變；其中，PTEN突變率在肺LCNEC中占7%，PI3KCA占11%[7,8,12]。其他研究也證實(shí)了在肺LCNEC中PI3K-AKT-mTOR通路上的PIK3CA、PTEN、AKT、RICTOR和mTOR均發(fā)生突變，其突變概率分別為3%、4%、24%、5%及1%[11]。

1.2 基因擴(kuò)增 在肺LCNEC中不僅有基因突變，還存在大量基因的擴(kuò)增。George等[8]對(duì)肺LCNEC基因測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)了一些擴(kuò)增比例較高的基因，分別是MYC、MYCL1、NKX2-1、FGFR1和IRS2。MYCN、SOX2及CCEN1在肺LCNEC中擴(kuò)增比例也較高，比例分別為2%、11%和9%[7]。

1.3 特異基因改變 與其他肺NET相比，肺LCNEC具有特異的基因改變，包括ADAMTS12（20%）、ADAMTS2（15%）、GAS7（12%）以及NTM（10%）；其中，GAS7和NTM參與神經(jīng)內(nèi)分泌分化[8]。近年研究[7,12,16]還發(fā)現(xiàn)在肺LCNEC中存在SMARCA2、NTRK2、NTRK3基因突變。與SCLC相比，在肺LCNEC中LAMA1、PCLO及MEGF8的突變率明顯增高，突變率分別是10%：2%、6%：1%和5%：0%（P值分別為0.019、0.023和0.015）[11]。

2 肺大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌的分子分型

2.1 分子分型 目前，尚未對(duì)肺LCNEC進(jìn)行精準(zhǔn)的分子分型，原因在于相關(guān)研究不夠充實(shí)。Rekhtman等[7]對(duì)45例肺LCNEC腫瘤組織及配對(duì)正常組織進(jìn)行測(cè)序（next-generation sequence,NGS），通過聚類分析（cluster analysis）把肺LCNEC分為3種分子亞型，一類是與SCLC相似（SCLC-like）的LCNEC，該類亞型的分子特點(diǎn)是共同出現(xiàn)TP53及RB1基因突變或缺失，該種基因突變較常出現(xiàn)于SCLC中；同時(shí)還出現(xiàn)其他與SCLC一樣的典型基因的改變，包括MYCL、SOX2、FGFR1擴(kuò)增和PTEN突變或缺失；第二類亞型是與非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）相似（NSCLC-like）的LCNEC，在該分型中沒有TP53及RB1共同突變，但可觀察到STK11、KRAS、KEAP1基因改變，而這些基因在NSCLC中較常出現(xiàn)；第三類亞型基因特征是腫瘤突變負(fù)荷較前兩種亞型低，并具有MEN1基因突變，該種基因特征的改變與肺TC相似。其后，George等[8]進(jìn)一步分析了各亞型的特征：其中，I型LCNEC主要基因改變?yōu)門P53與STK11/KEAP1的共同突變或缺失，且表現(xiàn)為ASCL1及DLL3高表達(dá)和NOTCH通路失活；而II型LCNEC主要基因改變是TP53及RB1突變或缺失，該型患者表現(xiàn)為ASCL1、DLL3的低表達(dá)及NOTCH通路的激活。

2.2 分子分型與臨床治療 近年有研究發(fā)現(xiàn)某些基因改變與化療療效相關(guān)。一項(xiàng)回顧性研究[17]對(duì)63例肺LCNEC患者的血液及組織進(jìn)行基因測(cè)序，把存在TP53及RB1共同突變的患者定義為SCLC-like型，缺乏共同突變的定義為NSCLC-like型，并對(duì)54例患者的治療及預(yù)后進(jìn)行分析；結(jié)果顯示SCLC-like型LCNEC的患者較NSCLC-like型的患者預(yù)后差，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（9.8個(gè)月vs14.4 個(gè)月，P=0.18）；且在SCLC-like LCNEC患者中，依托泊苷聯(lián)合鉑類的化療方案與培美曲塞/吉西他濱/紫杉醇聯(lián)合鉑類方案相比，其客觀緩解率（objective response rate,ORR）（75%vs0%,P=0.02）及疾病控制率（disease control rate,DCR）（100%vs20%,P=0.007）明顯增高，明顯延長(zhǎng)患者無進(jìn)展生存期（progression-free survival,PFS）（8.3個(gè)月vs2.4個(gè)月，P=0.002）；但患者總生存期（overall survival,OS）無明顯改善（9.7個(gè)月vs4.1個(gè)月，P=0.600）；然而，在NSCLC-like LCNEC中，吉西他濱/紫杉醇聯(lián)合鉑類治療的患者與依托泊苷或培美曲塞聯(lián)合鉑類方案治療的患者相比，PFS（2.5個(gè)月vs5.5個(gè)月，P=0.045）及OS（9.4個(gè)月vs19.6個(gè)月，P=0.07）明顯更差。另有一研究[18]表明，在RB1基因野生型的LCNEC患者中，與依托泊苷聯(lián)合鉑類的化療方案相比，吉西他濱/紫杉醇聯(lián)合鉑類的化療方案可明顯延長(zhǎng)患者的OS（9.6個(gè)月vs5.8個(gè)月，P=0.026）；但是，在RB1突變的LCNEC患者中，未觀察到化療方案之間療效的差異。

3 大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌的分子標(biāo)志物研究

3.1 診斷相關(guān)的分子標(biāo)志物 肺LCNEC組織學(xué)特征復(fù)雜，活檢標(biāo)本不足以支持診斷，通常需要手術(shù)大標(biāo)本，通過形態(tài)學(xué)及內(nèi)分泌標(biāo)志物來證實(shí)[19,20]。典型的形態(tài)學(xué)特征如器官樣結(jié)構(gòu)、柵欄及花環(huán)樣排列、NSCLC細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)、低核質(zhì)比、大量豐富的核仁和大量的壞死[21]；臨床上常用的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物有嗜鉻粒蛋白A（chromogranin A,CGA）、突觸小泡蛋白（synaptophysin,SYN）和神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（neural cell adhesion molecule,NCAM-1/CD56）[21]，而以上特點(diǎn)導(dǎo)致LCNEC診斷困難。因此，近年來研究者聚焦于LCNEC診斷標(biāo)志物的研究，以尋找特異性及敏感性高的分子標(biāo)志物。Bari等[22]對(duì)8例SCLC和8例LCNEC的冰凍組織進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)CDX2（Caudal type homeobox 2）、VIL1（Villin 1）及BAI3（brain-specific angiogenesis inhibitor 3）在兩種腫瘤中表達(dá)差異大；并通過RT-PCR及免疫組化驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CDX2與VIL1結(jié)合用于診斷肺LCNEC時(shí)，其敏感性及特異性高達(dá)81%，而BAI3在診斷SCLC時(shí)的敏感性和特異性分別為89%和75%；因此，CDX2、VIL1及BAI3具有潛在的區(qū)分LCNEC與SCLC的能力。微管不穩(wěn)定蛋白（Stathmin-1,STMN1）具有調(diào)控微管的作用，并在NSCLC中證實(shí)了與腫瘤惡性程度有關(guān)[23-25]；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了在HGNET中STMN1表達(dá)明顯高于NSCLC，該基因有助于鑒別NSCLC與HGNET[26]。人牛膝鱗片同源物1（human achaete-scute homolog 1,hASH1）可以調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)[27]；Ye等[28]對(duì)肺NET（肺TC、SCLC及LCNEC）、肺腺癌（lung adenocarcinoma）及肺鱗癌（squamous cell lung carcinoma）進(jìn)行hASH1免疫組化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在HGENT中表達(dá)比例最高（LCNEC為72.7%，SCLC為79.2%），所以hASH1可對(duì)HGENT進(jìn)行臨床診斷。Morise等[29]對(duì)60例SCLC及45例LCNEC組織進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)情況的分析，發(fā)現(xiàn)SOX2及CD166在SCLC及LCNEC中表達(dá)具有明顯的差異，P值分別為0.003和0.046，可通過這兩種分子的表達(dá)情況區(qū)分SCLC和LCNEC?，F(xiàn)已知DLL3是ASCL1的下游靶基因，并參與肺NET的神經(jīng)內(nèi)分泌分化[30,31]，而在一項(xiàng)研究[32]中發(fā)現(xiàn)DLL3在LCNEC中的表達(dá)率為74%（70/94），同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在TP53野生型和TP53突變型的LCNEC中DLL3表達(dá)有差異，且DLL3的表達(dá)與ASLC1的表達(dá)相關(guān)，以上說明DLL3與LCNEC的分子亞型和神經(jīng)內(nèi)分泌譜相關(guān)，可能具有成為鑒別LCNEC分子亞型的潛力。

3.2 預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物 在肺LCNEC中，無標(biāo)準(zhǔn)指南推薦最優(yōu)的治療方案。現(xiàn)臨床常用方案有兩種，一種為NSCLC常規(guī)化療方案，如培美曲塞、吉西他濱聯(lián)合含鉑化療方案；另一種為SCLC常規(guī)化療方案，如依托泊苷聯(lián)合鉑類的化療方案；但肺LCNEC的療效較NSCLC及SCLC的療效差[5]。因此需預(yù)后相關(guān)分子篩選治療有效的患者。研究者對(duì)LCNEC患者的腫瘤干細(xì)胞分子標(biāo)志物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ALDH1表達(dá)陽性患者的無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival,RFS）和OS較ALDH1陰性患者的短（5年RFS率：39%vs67%，P=0.009；5年OS率：50%vs79%，P=0.021）；并且在多因素Cox回歸分析中，ALDH1陽性表達(dá)是獨(dú)立的預(yù)后危險(xiǎn)因素[29]。YAP1是Hippo通路上的主要效應(yīng)因子，通常在NSCLC中表達(dá)[33]；有學(xué)者[34]在30例肺LCNEC中分析了YAP1的表達(dá)情況，18/30（60%）的患者出現(xiàn)YAP1的缺失，同時(shí)發(fā)現(xiàn)YAP1的缺失與神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物表達(dá)情況相關(guān)，且通過生存分析證明YAP1陰性患者對(duì)化療更敏感。近年研究表明免疫微環(huán)境對(duì)抗腫瘤起到至關(guān)重要的作用，有研究[35]對(duì)肺LCNEC患者的術(shù)前外周血中中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比（neutrophil-lymphocyte ratio,NLR）進(jìn)行分析，證實(shí)NLR是LCNEC患者總生存期的預(yù)后獨(dú)立影響因素（P=0.011,HR=8.559,95%CI:1.783-80.230），因此，NLR具有成為預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物的潛力。另有學(xué)者[36]發(fā)現(xiàn)在肺LCNEC患者中普遍表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞輕度減少，而在治療前具有明顯T細(xì)胞（T-cell repertoire,TCR）亞群改變和更高淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的患者，其治療效果更好并且生存期更長(zhǎng)（441 dvs157 d,P=0.019），同時(shí)還證實(shí)了治療3個(gè)月后患者的TCR恢復(fù)程度越高，預(yù)后越好（OS:617 dvs316 d,P=0.036）。E-cadherin是鈣黏蛋白家族中的成員，在細(xì)胞黏連中起到重要作用[37]，但其黏連作用需與β-catenin結(jié)合形成E-cadherin-β-catenin復(fù)合物才能發(fā)揮作用[38]；而E-cadherin-β-catenin復(fù)合物的缺失可導(dǎo)致腫瘤的惡化[39]。Salon等[40]對(duì)102例肺NET（16例肺TC，8例肺AC，37例LCNEC，41例SCLC）進(jìn)行E-cadherin及β-catenin免疫組化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)E-cadherin及β-catenin的表達(dá)缺失在HGNEC中更普遍（P＜0.000,1），且E-cadherin及β-catenin與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)（P=0.000,1和P=0.000,5），所以該復(fù)合物的形成與神經(jīng)內(nèi)分泌癌的預(yù)后及惡化有關(guān)。Klotho是一種抑癌基因，參與離子通道和生長(zhǎng)因子水平的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗力[41,42]。在Brominska等[43]的研究中，Klotho陽性的肺LCNEC患者與Klotho陰性的患者相比，患者的OS明顯延長(zhǎng)（P=0.015,HR=0.37,95%CI:0.17-0.86）。有研究[44,45]證實(shí)PD-L1在腫瘤細(xì)胞（tumor cells,TC）和炎癥細(xì)胞（inflammatory cells,IC）中的表達(dá)可能是預(yù)測(cè)療效的標(biāo)志物，但在LCNEC中尚不清楚。Arpin等[46]在法國(guó)的17家中心中收集了105例LCNEC患者的組織標(biāo)本，經(jīng)過重新復(fù)閱后，最終篩選出了68例LCNEC患者。通過分析PD-L1在這些標(biāo)本中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與SCLC和NSCLC相比，TC-/IC+是LCNEC最常見的PD-L1的表達(dá)模式，且在炎癥細(xì)胞中PD-L1表達(dá)情況似乎是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。

4 總結(jié)及展望

根據(jù)目前研究，肺LCNEC中基因圖譜的改變同時(shí)與SCLC、NSCLC及肺TC重合；說明肺LCNEC具有較高的異質(zhì)性。并且對(duì)比其他類型的肺癌，肺LCNEC具有特異性基因的改變；而這些基因可成為肺LCNEC診斷相關(guān)分子標(biāo)志物。根據(jù)基因圖譜的改變，已對(duì)肺LCNEC進(jìn)行大致的分子分型，但還需大量數(shù)據(jù)驗(yàn)證。但在肺LCNEC分子分型研究中證實(shí)了不同分子亞型的肺LCNEC對(duì)化療方案的療效不同，且預(yù)后也不相同。并且通過對(duì)比不同亞型肺LCNEC的基因改變，可以發(fā)現(xiàn)潛在的預(yù)后分子標(biāo)志物。

同時(shí)，基因圖譜及分子分型的研究使得研究者對(duì)肺LCNEC的分子特性及分子機(jī)制進(jìn)一步了解，并促進(jìn)肺LCNEC進(jìn)入精準(zhǔn)治療時(shí)代，從而提高肺LCENC的療效，延長(zhǎng)患者的生存期。而診斷及預(yù)后分子標(biāo)志物的研究則可以提高肺LCNEC臨床診斷的準(zhǔn)確性及有效的篩選出生存獲益的患者；但是否能運(yùn)用于臨床，還需深入研究。

目前，腫瘤治療已經(jīng)進(jìn)入免疫治療時(shí)代；而有關(guān)肺LCNEC免疫相關(guān)研究非常少。在免疫機(jī)制中，有研究[36]發(fā)現(xiàn)肺LCNEC可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的變化，表明抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖可能是其致病機(jī)制。而另一研究[47]對(duì)106例肺LCNEC患者的外周血進(jìn)行血小板和白細(xì)胞計(jì)數(shù)，并通過生存分析發(fā)現(xiàn)NLR和血小板/淋巴細(xì)胞比（plateletto-lymphocyte ratio,PLR）是肺LCNEC患者的獨(dú)立預(yù)后因素，這暗示著細(xì)胞免疫與肺LCNEC的進(jìn)展有關(guān)。而在免疫治療的療效研究中，Oda等[48]報(bào)道了1例混合型肺LCNEC在多程治療后接受納武利尤單抗（Nivolumab）治療后獲得長(zhǎng)期生存的病例。另有一項(xiàng)臨床試驗(yàn)[49]，研究者入組晚期肺LCNEC共37例；其中21例患者接受免疫抑制劑（immune check-point inhibitor,ICPi）治療，并與晚期NSCLC的免疫治療療效進(jìn)行比對(duì)；結(jié)果顯示肺LCNEC免疫治療療效與NSCLC的免疫治療療效相當(dāng)，而具體的臨床數(shù)據(jù)需要進(jìn)一步的研究，以上均說明肺LCNEC的發(fā)生發(fā)展與免疫及免疫微環(huán)境密不可分，且對(duì)免疫治療具有一定的療效，但篩選出可在免疫治療中受益的患者，還需進(jìn)一步研究。因此，對(duì)肺LCNEC的免疫微環(huán)境進(jìn)行分子分型及發(fā)現(xiàn)有效的免疫治療相關(guān)的預(yù)后分子標(biāo)志物是我們的下一步研究方向。