潘紅麗 李雪冰 陳琛 范亞光 周清華

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率增長最迅速、對(duì)人類健康和生命活動(dòng)造成最大威脅的惡性腫瘤。全球疾病負(fù)擔(dān)研究報(bào)告最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[1]表明僅2017年全球新增肺癌病例約220萬，肺癌死亡病例約190萬。中國國家癌癥中心公布的數(shù)據(jù)[2]顯示2015年我國約有78萬例新發(fā)肺癌病例，死于肺癌者高達(dá)63萬人。按照組織類型分類，肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中85%的患者為非小細(xì)胞肺癌[3]。非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素和多基因參與的極其復(fù)雜的過程，所以深入研究非小細(xì)胞肺癌的致病機(jī)理成為亟待解決的問題。

近年的研究表明，m6A修飾在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不可替代的作用。m6A修飾是指RNA的腺嘌呤（A）第六號(hào)（6）氮原子上的單甲基化（m）修飾，簡稱m6A，通常發(fā)生在mRNA、lncRNA、circRNA、snRNA、tRNA和rRNA等多種RNA中。研究[4]顯示，m6A修飾的位點(diǎn)具有高度保守性，傾向于出現(xiàn)在共有序列RRm6ACH（R=G/A,H=A/C/U）上，這些位點(diǎn)主要分布在RNA的3’UTR、終止密碼子或者長外顯子附近，對(duì)RNA前體的剪接、3’末端的處理、出核轉(zhuǎn)運(yùn)、降解和翻譯等過程起著重要調(diào)控作用。本文總結(jié)了有關(guān)m6A修飾的研究成果，闡述了其相關(guān)蛋白的組成、作用方式、在非小細(xì)胞肺癌惡性進(jìn)展中的生物學(xué)功能以及針對(duì)m6A修飾的靶向治療等方面的研究進(jìn)展，為闡明非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展提供新思路，對(duì)指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌的診斷和治療提供新靶點(diǎn)。

1 m6A相關(guān)蛋白的組成及功能

m6A甲基化修飾最早在酵母tRNA中發(fā)現(xiàn)，tRNA發(fā)生m6A甲基化修飾后有助于維持其三葉草結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，提高翻譯效率[5]。隨后發(fā)現(xiàn)m6A甲基化在mRNA中是最豐富的修飾[6]，因此，越來越多的研究關(guān)注于mRNA的m6A甲基化修飾。m6A修飾是一種動(dòng)態(tài)可逆的調(diào)節(jié)方式，受m6A甲基轉(zhuǎn)移酶（m6A writers）和去甲基化酶（m6A erasers）的共同調(diào)控，能夠被m6A識(shí)別蛋白（m6A readers）選擇性的識(shí)別結(jié)合，從而轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)。

1.1 m6A writers m6A writers，是指m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，能夠催化S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）的甲基轉(zhuǎn)移至腺嘌呤第6位氮原子上。m6A writers包括METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429（VIRMA）、RBM15、HAKAI、ZC3H13（KIAA0853）和METTL16等。Knuckles等[7]在小鼠胚胎干細(xì)胞中過表達(dá)了METTL3，期望通過TAP-LC-MS技術(shù)篩選鑒定與METTL3相互作用的蛋白。結(jié)果表明：在高鹽條件（500 mmol/L）下洗脫獲得METTL3/METTL14復(fù)合物，命名為m6A-METTL復(fù)合物；在低鹽條件（350 mmol/L）下洗脫得到WTAP/KIAA1429/RBM15/ZC3H13/HAKAI復(fù)合物，命名為m6A-METTL相關(guān)蛋白復(fù)合物。

1.1.1 m6A-METTL復(fù)合物 m6A-METTL復(fù)合物主要包括METTL3和METTL14蛋白。METTL3是最早被發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物成分之一[8]，具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性。早期通過結(jié)構(gòu)預(yù)測和DNA進(jìn)化分析推測METTL3的功能與甲基轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)[9]；后期研究[10]發(fā)現(xiàn)METTL3能夠和同源蛋白METTL14形成異源二聚體復(fù)合物，而METTL14雖能與RNA結(jié)合，但不具備催化活性；最終確定METTL3/METTL14復(fù)合物共同催化靶RNA的m6A修飾。

1.1.2 m6A-METTL相關(guān)蛋白復(fù)合物 m6A-METTL相關(guān)蛋白復(fù)合物主要是由接頭蛋白WTAP、KIAA1429、RBM15、ZC3H13和HAKAI相互結(jié)合而形成的復(fù)合物。RNA剪接因子WTAP同樣不具備甲基轉(zhuǎn)移酶活性，而是作為接頭蛋白招募m6A-METTL復(fù)合物定位到核散斑上，從而影響m6A修飾的定位[11]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)KIAA1429能夠直接與WTAP結(jié)合，引導(dǎo)METTL3/METTL14/WTAP復(fù)合物結(jié)合于靶RNA的3’UTR和終止密碼子附近，發(fā)生位點(diǎn)選擇性甲基化[12]。因此，在細(xì)胞內(nèi)敲低KIAA1429的表達(dá)后，m6A甲基化水平會(huì)明顯下降[13]。后續(xù)研究[12,14]證實(shí)，接頭蛋白R(shí)BM15、HAKAI、ZC3H13等能夠與WTAP結(jié)合，決定METTL3/METTL14/WTAP復(fù)合物的正確定位。

1.1.3 METTL16 METTL16是另一具有催化活性的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，與METTL3同源，可以結(jié)合于U6 snRNA，導(dǎo)致U6第43位的腺嘌呤發(fā)生m6A甲基化修飾，從而影響U6 snRNP對(duì)mRNA前體的剪接[15]。METTL16也可以直接與mRNA前體結(jié)合，例如，與SAM合成酶MAT2A 3’UTR的一個(gè)保守發(fā)卡結(jié)構(gòu)結(jié)合，在SAM充足或缺乏的情況下，由于停滯時(shí)間的差異，導(dǎo)致MAT2A的可變剪接，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)SAM含量的穩(wěn)態(tài)[16]。

早期從Hela細(xì)胞中分離出的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物主要包括3個(gè)組分，分子量大小分別為30 kDa、200 kDa和875 kDa[8]。m6A-METTL復(fù)合物屬于200 kDa組分，但是METTL3/METTL14異源二聚體復(fù)合物分子量大小約為120 kDa，遠(yuǎn)低于200 kDa。m6A-METTL相關(guān)蛋白復(fù)合物屬于875 kDa組分，但是WTAP/KIAA1429/RBM15/ZC3H13/HAKAI復(fù)合物分子量大小約為600 kDa，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于875 kDa。表明仍然有未知的蛋白作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的成員，參與m6A甲基化修飾過程，需要進(jìn)一步深入探討。

1.2 m6A erasers m6A erasers，即m6A去甲基化酶，能夠“擦除”靶RNA的m6A甲基化修飾。目前僅發(fā)現(xiàn)了兩種m6A去甲基化酶，包括脂肪質(zhì)量與肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesityassociated protein,FTO）和alkB同源蛋白5（alkB homolog 5,ALKBH5）。

1.2.1 FTO FTO是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，在細(xì)胞內(nèi)敲低FTO的表達(dá)能夠增加mRNA的m6A水平，相反，當(dāng)過表達(dá)FTO時(shí)，胞內(nèi)mRNA的m6A水平受到抑制。FTO定位于核散斑，這與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物定位相同[17]。m6A去甲基化酶FTO的發(fā)現(xiàn)，明確了m6A修飾是一種動(dòng)態(tài)可逆的調(diào)節(jié)方式。

然而，F(xiàn)TO作為m6A去甲基化酶還存在一些爭議：2011年，Jia等[17]研究發(fā)現(xiàn)FTO的作用底物是m6A修飾；2017年，Mauer等[18]的研究否認(rèn)FTO的底物是m6A修飾，指出FTO的底物是m6Am修飾，從而影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。在隨后的研究中，Su等[19]分析了FTO催化m6A和m6Am修飾的偏好性，發(fā)現(xiàn)FTO的偏好性受FTO蛋白定位的影響，在細(xì)胞核中FTO催化m6A的去甲基化，而在細(xì)胞質(zhì)中的FTO可以同時(shí)介導(dǎo)m6A和m6Am的去甲基化。相比m6A修飾，m6Am修飾的RNA更加穩(wěn)定，在細(xì)胞內(nèi)敲低FTO后不影響m6Am修飾的RNA的表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)說明FTO主要通過介導(dǎo)m6A修飾的RNA的表達(dá)發(fā)揮作用。

1.2.2 ALKBH5 ALKBH5是第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，屬于Fe2+和α-酮戊二酸依賴的非血紅素加氧酶，能夠把m6A甲基化位點(diǎn)的N-甲基氧化成羥甲基，從而“擦除”mRNA的m6A甲基化。ALKBH5主要定位在核散斑，依賴其去甲基化酶活性影響mRNA的出核轉(zhuǎn)運(yùn)[20]。

目前發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5均屬于AlkB家族，但是二者對(duì)m6A修飾的擦除作用是相互獨(dú)立的，互不影響的。FTO和ALKBH5主要定位在細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)較低，所以細(xì)胞質(zhì)中mRNA的m6A修飾是如何被調(diào)控的，是否存在定位于細(xì)胞質(zhì)中的m6A去甲基化酶，仍需更多研究探索分析。

1.3 m6A readers m6A readers，即m6A識(shí)別蛋白，能夠選擇性識(shí)別靶RNA的m6A甲基化修飾，進(jìn)而參與RNA代謝的各個(gè)階段。

1.3.1 YTH家族蛋白 目前m6A甲基識(shí)別蛋白功能研究比較明確的是YTH結(jié)構(gòu)域家族成員，包括定位于細(xì)胞質(zhì)的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC2和定位于細(xì)胞核的YTHDC1，均能通過YTH結(jié)構(gòu)域選擇性識(shí)別并結(jié)合m6A修飾位點(diǎn)。YTHDF1與m6A修飾位點(diǎn)結(jié)合后，招募轉(zhuǎn)錄起始因子EIF3A及其復(fù)合物，促進(jìn)翻譯的起始和多聚核糖體的形成，提高翻譯效率[21]；YTHDF2是最早被鑒定的m6A識(shí)別蛋白之一，識(shí)別m6A甲基化位點(diǎn)后，進(jìn)而招募CCR4-NOT脫腺苷酸酶復(fù)合體或HRSP12/RNase P/MRP復(fù)合物，加速RNA的脫腺苷酸化和切割[4,22-24]。YTHDF3可與YTHDF1協(xié)同作用促進(jìn)m6A修飾的mRNA翻譯，而YTHDF3與YTHDF2的協(xié)同作用會(huì)導(dǎo)致m6A修飾的靶RNA發(fā)生降解[25]。YTHDC1與m6A修飾位點(diǎn)結(jié)合后，能夠通過與剪接因子SRSF3和SRSF10的競爭性結(jié)合，介導(dǎo)RNA前體的可變剪接及RNA的出核過程[26,27]；而YTHDC2能夠提高靶基因的翻譯效率和介導(dǎo)RNA的降解[28,29]。

1.3.2 hnRNPs超家族蛋白 與m6A修飾相關(guān)的hnRNPs超家族蛋白包括HNRNPA2B1、HNRNPC和HNRNPG。RNA結(jié)合蛋白HNRNPA2B1可以與核內(nèi)m6A修飾的RNA結(jié)合，介導(dǎo)基因的可變剪接。同時(shí)，HNRNPA2B1也能夠與miRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的m6A位點(diǎn)結(jié)合，從而招募miRNA微處理復(fù)合物蛋白DGCR8，促進(jìn)miRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)一步的剪接加工[30]。隨后的研究[31]發(fā)現(xiàn)，RNA發(fā)生m6A甲基化修飾后可以引起二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，部分m6A識(shí)別蛋白并非直接識(shí)別并結(jié)合m6A甲基化位點(diǎn)，而是識(shí)別構(gòu)象發(fā)生改變的RNA結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)，這一現(xiàn)象被稱為m6A開關(guān)（m6A-switch）。通過晶體結(jié)構(gòu)分析和生物信息學(xué)預(yù)測證實(shí)HNRNPA2B1并不含有與m6A甲基化位點(diǎn)結(jié)合的疏水口袋，可能是采用m6A開關(guān)機(jī)制識(shí)別m6A修飾位點(diǎn)[32]。核糖核蛋白HNRNPC/G對(duì)m6A修飾的識(shí)別結(jié)合也是間接性的，通過m6A開關(guān)機(jī)制參與靶mRNA的加工及成熟[31,33]。

1.3.3 其他 真核起始因子EIF3A能夠直接和mRNA 5’UTR的m6A修飾位點(diǎn)結(jié)合，招募43S核糖體復(fù)合物，起始帽子結(jié)構(gòu)非依賴型的蛋白翻譯[34]。IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3識(shí)別結(jié)合m6A修飾位點(diǎn)后，增加靶mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)其翻譯[35]。

總體來說，m6A識(shí)別蛋白在RNA代謝的各個(gè)階段均發(fā)揮了重要作用。

2 m6A修飾與肺癌

目前，m6A修飾在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究是腫瘤生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。在肺癌的發(fā)生發(fā)展中，m6A修飾發(fā)揮著舉足輕重的作用。m6A相關(guān)蛋白表達(dá)的異常，能夠?qū)е路切〖?xì)胞肺癌的惡性增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等。因此，研究m6A修飾在非小細(xì)胞肺癌中的生物學(xué)功能，鑒定m6A修飾的關(guān)鍵因子改變，對(duì)闡明非小細(xì)胞肺癌發(fā)病機(jī)制具有重要意義，可以為指導(dǎo)肺癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

2.1 m6A修飾與肺癌惡性增殖 肺癌是一種由肺上皮細(xì)胞惡性增殖而形成的腫瘤。腫瘤細(xì)胞的惡性增殖與細(xì)胞的過度分裂、周期紊亂和凋亡調(diào)控失常等相關(guān)。

研究[36]表明m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3處于甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的核心位置，METTL3純合敲除小鼠是早期胚胎致死的，METTL3條件性敲除鼠表現(xiàn)為體重輕、體積小和發(fā)育遲緩等特點(diǎn)，說明METTL3在早期胚胎發(fā)育和生存中發(fā)揮重要作用。METTL3在肝癌、宮頸癌、乳腺癌和胰腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)均上調(diào)，導(dǎo)致SOCS2[37]、HBXIP[38]和SNAI1[39]等mRNA發(fā)生甲基化，從而調(diào)控腫瘤的惡性進(jìn)展。在非小細(xì)胞肺癌臨床樣本中，METTL3的表達(dá)是明顯上調(diào)的，并且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。METTL3能夠催化Hippo信號(hào)通路的核效應(yīng)因子YAP發(fā)生m6A甲基化修飾，促使其翻譯，介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[40]。此外，METTL3的第177、211、212和215位賴氨酸殘基可以發(fā)生SUMO化修飾，顯著抑制m6A甲基轉(zhuǎn)移酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞整體基因表達(dá)譜的改變，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和惡性轉(zhuǎn)化[41]。也有報(bào)道[42,43]指出，METTL3可以不依賴甲基化酶活性而發(fā)揮作用，即直接與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）和Hippo信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TAZ的m6A甲基化位點(diǎn)結(jié)合后，招募真核翻譯起始因子EIF3H，介導(dǎo)癌蛋白EGFR和TAZ翻譯的起始與多聚核糖體的形成，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的惡性增殖、遷移和侵襲。此外，還有研究[44,45]表明，miR-33a和miR-600可以靶向METTL3而抑制非小細(xì)胞肺癌的惡性增殖。

m6A識(shí)別蛋白YTHDF1在非小細(xì)胞肺癌臨床樣本和細(xì)胞株中均高表達(dá)。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中敲低YTHDF1的表達(dá)，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞G0期/G1期阻滯，細(xì)胞周期蛋白CDK2、CDK4和cyclin D1的翻譯效率大大降低，顯著抑制肺癌細(xì)胞的惡性增殖[46]。Sheng等[47]研究表明YTHDF2在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，通過識(shí)別結(jié)合磷酸戊糖途徑中的關(guān)鍵酶6-PGD 3’UTR的甲基化位點(diǎn)，促進(jìn)其翻譯，加速葡萄糖通過磷酸戊糖途徑代謝，為非小細(xì)胞肺癌的惡性增殖提供原料。

m6A去甲基化酶FTO的表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中均上調(diào)，它能夠“擦除”去泛素化酶USP7 mRNA的m6A修飾，增加其穩(wěn)定性，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的惡性增殖[48]。而m6A去甲基化酶ALKBH5則可以靶向組織金屬蛋白酶抑制因子（metallopeptidase inhibitor 3,TIMP3），降低TIMP3 mRNA的穩(wěn)定性，通過抑制凋亡而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖[49]。USP7 mRNA的m6A甲基化修飾被FTO“擦除”后穩(wěn)定性增加，然而TIMP3 mRNA的m6A修飾被“擦除”后穩(wěn)定性降低，我們推測不同基因m6A修飾發(fā)生變化后，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式差異的原因是被不同的m6A識(shí)別蛋白所選擇性識(shí)別，從而導(dǎo)致作用方式不同。m6A識(shí)別蛋白如何選擇性識(shí)別，具體的分子機(jī)制仍需研究者們進(jìn)一步探索。

2.2 m6A修飾與肺癌遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移 肺癌發(fā)展到晚期較易發(fā)生轉(zhuǎn)移，這也是導(dǎo)致肺癌死亡率居高不下的重要因素之一，所以m6A修飾與肺癌侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)系需要研究者們深入探討。

在肺腺癌細(xì)胞中METTL3依賴m6A甲基轉(zhuǎn)移酶活性，導(dǎo)致JUNB mRNA發(fā)生m6A修飾，增加其穩(wěn)定性，從而作為轉(zhuǎn)錄因子入核開啟下游基因的轉(zhuǎn)錄，參與轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的發(fā)生，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[50]。在肺癌腦轉(zhuǎn)移過程中，METTL3被報(bào)道可以誘導(dǎo)miR-143-3p初級(jí)轉(zhuǎn)錄本發(fā)生m6A修飾，加速miR-143-3p的加工成熟，通過靶向血管生成抑制因子VASH1，解除對(duì)血管內(nèi)皮生長因子VEGFA的抑制作用，誘發(fā)新生血管的形成，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[51]。

Liu等[52]研究發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌中，高表達(dá)的m6A去甲基化酶FTO通過“擦除”癌基因MZF1 mRNA的m6A修飾，增加其穩(wěn)定性，促進(jìn)肺鱗癌細(xì)胞的惡性增殖、遷移和侵襲。另一m6A去甲基化酶ALKBH5在間歇性缺氧處理后的肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5通過“擦除”癌基因FOXM1mRNA的m6A修飾，促進(jìn)FOXM1的表達(dá)，從而參與肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[53]。近期的一項(xiàng)研究結(jié)果[54]表明m6A去甲基化酶ALKBH5在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)明顯下調(diào)，且其低表達(dá)與整體生存期呈負(fù)相關(guān)；在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)ALKBH5能夠明顯抑制細(xì)胞增殖和遷移，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果截然相反，推測與細(xì)胞培養(yǎng)方式或處理方式的不同相關(guān)，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。因此，m6A修飾在腫瘤生物學(xué)中的調(diào)控功能需要更深入、更詳細(xì)、更全面的研究和探討。

2.3 m6A修飾與肺癌耐藥性 耐藥是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的關(guān)鍵因素。研究表明，多藥聯(lián)合可以緩解腫瘤耐藥。因此，深入研究耐藥的分子機(jī)制，可以為指導(dǎo)正確的聯(lián)合用藥和克服耐藥提供理論依據(jù)。m6A修飾相關(guān)蛋白在肺癌耐藥中也發(fā)揮重要的作用。

Shi等[46]研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)的YTHDF1能夠更好地識(shí)別m6A修飾的KEAP1 mRNA，促進(jìn)KEAP1蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致下游細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-E2-related factor 2,NRF2）迅速降解，介導(dǎo)耐藥基因AKR1C1表達(dá)的沉默，從而增加了化療敏感性。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的敲低，也能夠提高肺腺癌細(xì)胞A549對(duì)抗癌藥物JQ1的敏感性[42]，但是具體機(jī)制仍未見報(bào)道。

近期Meng等[55]深刻剖析了非小細(xì)胞肺癌中m6A修飾與阿法替尼耐藥性的關(guān)系：他們以阿法替尼敏感細(xì)胞株為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)在阿法替尼耐藥細(xì)胞株中有更多的基因發(fā)生m6A修飾，從而導(dǎo)致整體基因表達(dá)譜發(fā)生了改變；通過基因功能富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因主要富集在細(xì)胞周期，推測m6A修飾的基因擾亂了正常的細(xì)胞周期，從而導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌產(chǎn)生阿法替尼耐藥性。

2.4 m6A修飾與肺癌診斷及預(yù)后 越來越多的研究[56,57]表明，m6A修飾可以作為診斷、藥物治療和預(yù)后判斷的潛在分子標(biāo)志物。研究人員利用LC-ESI-MS/MS方法檢測肺癌單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell,CTC）細(xì)胞或CTC細(xì)胞簇的m6A修飾情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，CTC細(xì)胞中的整體m6A修飾水平是增加的，這表明從CTC細(xì)胞檢測m6A修飾也許可以成為肺癌的無創(chuàng)診斷方法。未來研究方向會(huì)更加關(guān)注肺癌早期階段m6A甲基化修飾或m6A修飾相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，從而明確m6A修飾檢測能否作為早期診斷指標(biāo)。Zhang[58]的團(tuán)隊(duì)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫509例肺腺癌患者標(biāo)本的m6A相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)YTHDF1、YTHDF2和METTL3的表達(dá)均明顯上調(diào)，并且其高表達(dá)與總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率呈正相關(guān)，他們推測這是通過提高化療敏感性進(jìn)而延長了患者的生存期。Liu等[59]對(duì)13個(gè)m6A相關(guān)蛋白的基因表達(dá)進(jìn)行一致性聚類分析，把肺腺癌患者分為了兩組，這兩組患者在年齡、種族、腫瘤大小、分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移方面均有明顯差異。通過表達(dá)譜分析表明，m6A相關(guān)基因的表達(dá)可以作為肺腺癌晚期患者預(yù)后的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

3 針對(duì)m6A修飾的靶向治療進(jìn)展

表觀遺傳學(xué)在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及診斷治療中具有重要的作用，多個(gè)靶向DNA甲基化酶或組蛋白修飾酶的新藥已獲批用于惡性腫瘤的治療。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑Azacitidine和Decitabine已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批準(zhǔn)，應(yīng)用于骨髓增生異常綜合征的臨床治療[60,61]。組蛋白去乙?；敢种苿〤hidamide已獲中國食品藥品監(jiān)督管理局（China Food and Drug Administration,CFDA）批準(zhǔn)用于外周T淋巴細(xì)胞瘤的治療[62]，目前Chidamide針對(duì)非小細(xì)胞肺癌的臨床實(shí)驗(yàn)已進(jìn)入III期階段。近幾年，以m6A修飾為核心內(nèi)容的靶向治療已經(jīng)成為藥物新靶標(biāo)的研究熱點(diǎn)。主要包括：FTO抑制劑、METTL3-14/WTAP激活劑和聯(lián)合用藥。

3.1 FTO抑制劑 m6A去甲基化酶FTO是白血病、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要的癌基因之一，在多種腫瘤中普遍高表達(dá)，且與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。因此，研究者們致力于篩選或合成FTO抑制劑，為后續(xù)抗腫瘤藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

最早發(fā)現(xiàn)的FTO抑制劑是大黃酸，大黃酸是一種天然產(chǎn)物，可以與RNA競爭結(jié)合FTO活性位點(diǎn)，從而擾亂了FTO對(duì)已發(fā)生m6A修飾的RNA的去甲基化作用，同時(shí)大黃酸也可以抑制去甲基化酶ALKBH2的活性，說明大黃酸并非是特異性靶向FTO的抑制劑[63]。研究[64]表明用大黃酸處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系PC-9、H460和A549后，能夠明顯抑制細(xì)胞的活性及克隆形成能力，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生和細(xì)胞周期的停滯。小鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)大黃酸能夠以時(shí)間和劑量依賴的方式抑制肺癌的惡性增殖。之前的研究[65]表明大黃酸對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系GLC4的增殖也有一定的抑制作用，可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。但是由于大黃酸水溶性較差，因此其抗腫瘤效率受到了明顯的限制。

隨后，研究學(xué)者通過高通量熒光偏振檢測法篩選抑制FTO或ALKBH5活性的藥物，發(fā)現(xiàn)非甾體抗炎藥MA能夠高效的特異性抑制FTO的去甲基化酶活性，并且以濃度依賴方式上調(diào)細(xì)胞內(nèi)整體m6A修飾水平，而對(duì)ALKBH5的表達(dá)及活性并未產(chǎn)生影響[66]。Demertzi等[67]研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌細(xì)胞株A549對(duì)MA的敏感性較低，半數(shù)抑制率（50% inhibitory concentration,IC50）為139 μmol/L，一些MA金屬配合物對(duì)A549細(xì)胞的IC50值范圍可降至25 μmol/L-40 μmol/L，但是在生物系統(tǒng)的使用濃度仍然過高，所以進(jìn)一步對(duì)MA進(jìn)行改造，研究發(fā)現(xiàn)MA有機(jī)錫配合物大大提升了對(duì)A549細(xì)胞的抗增殖活性，IC50值僅為0.43 μmol/L，顯著增加了肺腺癌細(xì)胞株A549對(duì)MA有機(jī)錫配合物的敏感性[68]。MA配合物是否通過抑制FTO活性來發(fā)揮作用，MA配合物對(duì)肺鱗癌和大細(xì)胞癌的抗癌活性如何呢，有待進(jìn)一步探討。

研究者們?yōu)榱双@得特異性和靶向性更強(qiáng)的FTO抑制劑，針對(duì)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行化合物設(shè)計(jì)和合成優(yōu)化，最終篩選到小分子化合物FB23及其羧酸衍生物FB23-2能夠特異性靶向FTO。研究[69]發(fā)現(xiàn)在急性髓系白血病中，羧酸衍生物FB23-2抗增殖活性要優(yōu)于FB23，能夠特異性抑制FTO去甲基化酶活性，顯著抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化成熟，在一定程度上阻遏了急性髓系白血病的發(fā)展。FTO抑制劑FB23及其羧酸衍生物FB23-2在非小細(xì)胞肺癌中能否特異性靶向FTO，能否有效抑制肺癌的惡性進(jìn)展，尚需更多的研究進(jìn)行驗(yàn)證。

3.2 METTL3-14/WTAP激活劑 普遍認(rèn)為m6A修飾的升高可以抑制癌癥的惡性進(jìn)展。前期大量研究聚焦于FTO抑制劑的開發(fā)，然而，亦可以通過激活METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶的活性來提高m6A水平。Selberg等[70]基于METTL3/METTL14復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)4個(gè)小分子化合物能夠與METTL3/METTL14復(fù)合物結(jié)合并激活甲基轉(zhuǎn)移酶活性，這些小分子化合物能夠在細(xì)胞水平發(fā)揮作用，導(dǎo)致mRNA和rRNA的整體m6A水平升高。但是，當(dāng)使用高濃度（10 μmol/L）小分子化合物處理細(xì)胞時(shí)，胞內(nèi)整體m6A修飾水平反而降低，我們推測這是細(xì)胞為了維持穩(wěn)態(tài)而進(jìn)行的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中METTL3普遍高表達(dá)，能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[42,43]。隨后Liu等[59]分析了大量的肺腺癌和肺鱗癌臨床樣本中m6A相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明在肺腺癌和肺鱗癌中METTL3的表達(dá)顯著上調(diào)，并且高表達(dá)METTL3的非小細(xì)胞肺癌患者表現(xiàn)出較好的預(yù)后[58,59,71]。綜合臨床數(shù)據(jù)來看，METTL3在非小細(xì)胞肺癌中的高表達(dá)能夠延長患者的生存期。因此，METTL3-14/WTAP激活劑對(duì)非小細(xì)胞肺癌的治療有著充分的理論可行性，相信后續(xù)的生物活性實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)會(huì)進(jìn)一步開展起來。

3.3 聯(lián)合用藥 研究[72]表明表觀遺傳修飾的異常能夠?qū)е履[瘤對(duì)化療藥物的耐受性，所以靶向表觀遺傳的療法對(duì)逆轉(zhuǎn)耐藥提供了可能。Pemetrexed作為晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床藥物被廣泛使用，但是單藥的使用對(duì)改善患者的總體生存率具有一定的局限性[73]，所以開展了多項(xiàng)針對(duì)Pemetrexed的聯(lián)合用藥研究，Bu等[74]研究發(fā)現(xiàn)FTO抑制劑大黃酸和Pemetrexed聯(lián)合處理肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549時(shí)，IC50由2.05 μmol/L降低為0.62 μmol/L，抗腫瘤活性得到明顯的提升。Duffy等[75]研究發(fā)現(xiàn)用阿霉素單藥處理肺腺癌細(xì)胞株A549時(shí)，細(xì)胞存活率為65%，而FTO特異性抑制劑MA與阿霉素聯(lián)用時(shí)的細(xì)胞存活率僅為16%，這一現(xiàn)象說明MA顯著增加了肺腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。

目前，免疫檢驗(yàn)點(diǎn)阻斷療法在抗腫瘤方面取得了較好的成效，已有多個(gè)藥物獲得美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于肺癌的臨床治療，如Nivolumab、Pembrolizumab和Atezolizumab等。然而，免疫檢驗(yàn)點(diǎn)阻斷療法僅對(duì)部分肺癌患者有效，并且容易產(chǎn)生耐藥性。因此，需要多藥聯(lián)合治療來擴(kuò)大應(yīng)用人群或者克服耐藥。近期，Yang等[76]研究發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤細(xì)胞中敲低FTO的表達(dá)可以增加癌細(xì)胞對(duì)γ干擾素和抗程序性細(xì)胞死亡蛋白1（programmed cell death 1,PD-1）免疫療法的敏感性。Han等[77]研究發(fā)現(xiàn)在YTHDF1敲除鼠中皮下注射黑色素瘤細(xì)胞，同時(shí)聯(lián)合程序性細(xì)胞死亡配體1（programmed cell death-ligand 1,PD-L1）免疫檢驗(yàn)點(diǎn)阻斷療法，獲得了較好的治療效果。表明m6A相關(guān)蛋白在抗腫瘤免疫治療中發(fā)揮著重要的作用。Xu等[78]分析了肺鱗癌患者中的免疫細(xì)胞類型及m6A相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示濾泡輔助性T細(xì)胞的免疫特征可以作為判斷肺鱗癌總體生存期的獨(dú)立預(yù)后因素，并且ALKBH5、METTL3、HNRNPC和KIAA1429的低表達(dá)能夠增加免疫治療的敏感性。因此，我們有理由相信m6A相關(guān)蛋白的抑制劑或激活劑與免疫治療聯(lián)合用藥在非小細(xì)胞肺癌治療中能夠提高抗腫瘤效率。

m6A相關(guān)蛋白的抑制劑或激活劑的開發(fā)尚處于起步階段，現(xiàn)有在研的m6A相關(guān)蛋白抑制劑或激活劑普遍存在活性低、特異性差、在細(xì)胞內(nèi)影響的表型過于復(fù)雜以及其確切的作用機(jī)制難以闡明等問題。因此，m6A相關(guān)蛋白抑制劑或激活劑主要用于臨床前實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)癌癥患者的治療效果尚未見報(bào)道。隨著藥物合成與篩選技術(shù)的發(fā)展、藥物改良工藝的進(jìn)步和多藥聯(lián)合應(yīng)用的探索，相信未來針對(duì)m6A修飾的靶向藥物一定能夠廣泛應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療。

4 小結(jié)與展望

已有研究表明[79]，m6A修飾的改變?cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要功能。m6A修飾相關(guān)蛋白通過調(diào)控一系列重要基因的剪接、出核、降解和翻譯等，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。隨著m6A修飾相關(guān)蛋白相繼被發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究集中在m6A修飾的潛在機(jī)制，從而推動(dòng)了腫瘤生物學(xué)中m6A修飾相關(guān)信號(hào)通路的研究。

當(dāng)然，關(guān)于m6A修飾仍有許多未解的謎題：①在生命活動(dòng)中是否仍存在未知的m6A修飾相關(guān)蛋白，它們以何種方式參與m6A修飾的調(diào)控；②迄今為止，已鑒定的m6A相關(guān)蛋白中m6A識(shí)別蛋白種類是最多的，每種m6A識(shí)別蛋白發(fā)揮的功能也是不同的，它們是如何選擇性識(shí)別并結(jié)合靶RNA的，它們之間是相互競爭的，還是相互協(xié)同的；③m6A相關(guān)蛋白中有些蛋白具有雙重身份，同時(shí)具備促癌和抑癌的雙重作用，它是以何身份來調(diào)控腫瘤的進(jìn)程，又是以何種作用方式來發(fā)揮功能；④目前，已篩選到多種FTO抑制劑及METTL3/METTL14激活劑，研究發(fā)現(xiàn)能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖或逆轉(zhuǎn)耐藥，但是對(duì)癌癥患者的治療效果仍未見報(bào)道，所以我們期待更多的臨床研究來驗(yàn)證m6A相關(guān)蛋白是否可以作為惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)。