張 帆，邢益平

(南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210029)

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是β皰疹病毒家族成員之一，該家族中還包含人皰疹病毒6、7，以及許多動(dòng)物巨細(xì)胞病毒。HCMV DNA基因組大小約為230 kb,是目前人類病毒中最大的[1]。HCMV DNA基因組由其獨(dú)特的長序列(UL)和短序列(US)兩部分組成，每一部分都是反向重復(fù)序列[2]。HCMV是感染人類的八大皰疹病毒之一，常感染免疫力低下者，尤其是移植術(shù)后患者、晚期艾滋病患者以及新生兒[1]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin ，mTOR)是酸肌醇-3-激酶(PI3K)家族下游的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)，該激酶可影響HCMV感染的所有階段[3]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白抑制劑(mTORi)作為免疫抑制劑用于腎移植術(shù)后患者，可降低HCMV感染事件[4-8]。本文就mTORi降低腎移植受者HCMV感染的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 HCMV感染

HCMV一個(gè)重要的生物學(xué)特性是導(dǎo)致宿主終身潛伏感染，一旦HCMV被激活，可以再次發(fā)病[1]。HCMV潛伏感染的機(jī)制可能與主要早期即刻蛋白(major immediate-early protein，MIEP)的表達(dá)相關(guān)。MIEP可反作用于宿主細(xì)胞基因，通過調(diào)控宿主細(xì)胞基因表達(dá)水平，進(jìn)而改變宿主細(xì)胞的生理狀態(tài)，從而促進(jìn)病毒的增殖。HCMV感染的三個(gè)階段皆調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶(acid-inositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(serine/threonine protein kinase，AKT/PKB)/mTOR通路[2]，如在感染成纖維細(xì)胞早期，PI3K/AKT/mTOR通路在血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)和或整合素參與介導(dǎo)下早期瞬時(shí)激活，而持續(xù)性激活則依賴于病毒的MIEP IE72和IE86[9]。PI3K的早期激活是病毒進(jìn)入宿主所必需的，而后期的持續(xù)性激活則是病毒基因表達(dá)和復(fù)制的重要保障。

2 腎移植術(shù)后HCMV感染現(xiàn)狀

盡管已有許多預(yù)防和治療策略，免疫抑制狀態(tài)下器官移植者HCMV感染仍然是一個(gè)嚴(yán)重的問題。除了費(fèi)用增加，發(fā)病率和病死率增高外，HCMV感染也可能與急性排斥反應(yīng)，減弱移植物功能和降低長期生存率有關(guān)。在未預(yù)防性使用抗病毒藥物的情況下，10%～20%的腎移植術(shù)后患者會(huì)出現(xiàn)癥狀性HCMV感染，高達(dá)50%的患者表現(xiàn)為無明顯癥狀的病毒激活狀態(tài)。盡管使用纈更昔洛韋或更昔洛韋可有效預(yù)防HCMV感染，但遲發(fā)性HCMV感染還是會(huì)發(fā)生在預(yù)防性抗病毒之后[10-11]。Helanter?等[10]報(bào)道，預(yù)防性使用抗病毒藥物3個(gè)月，停藥后18%～31%的腎移植患者出現(xiàn)遲發(fā)性HCMV感染。有證據(jù)表明移植術(shù)后抗病毒達(dá)6個(gè)月可降低遲發(fā)性HCMV感染發(fā)生率，但Helanter?等[10]研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)防性使用纈更昔洛韋長達(dá)6個(gè)月，仍有48%的患者出現(xiàn)遲發(fā)性HCMV感染；Arthurs等[11]研究也提及，預(yù)防性使用抗病毒藥物92 d后仍有遲發(fā)性HCMV感染的可能。因此，目前的抗病毒藥物不足以滿足人們的需求，鑒于HCMV獨(dú)特的生命周期，必須考慮新的抗病毒方案。

3mTOR

mTOR是PI3K家族下游AKT，是參與細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路的重要物質(zhì)，影響細(xì)胞的生長、增殖、代謝、自噬、血管生成等諸多重要過程[9]。mTORi進(jìn)入細(xì)胞后，在胞漿內(nèi)與FK結(jié)合蛋白12(FK binding protein-12，F(xiàn)KBP-12)結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而與 mTOR 結(jié)合，抑制mTOR活性，使p70S6 激酶脫磷酸化而失活，從而抑制蛋白質(zhì)的合成及細(xì)胞周期循環(huán)[12]。因此，mTORi可抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的增殖、分化及抗體的形成，同時(shí)也可抑制非免疫細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞)的增殖[13]。mTOR的組成和功能如下。

3.1 mTORC1 mTORC1的主要功能是通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯，以控制蛋白質(zhì)合成。在胞內(nèi)營養(yǎng)不足時(shí)，mTORC1被腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)以結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物 (tuberous sclerosis complex, TSC)相關(guān)抑癌基因抑制[14]。當(dāng)營養(yǎng)充足時(shí)，AMPK不被激活，AKT磷酸化并抑制TSC，導(dǎo)致mTORC1活化并提高蛋白翻譯[15]。mTORC1通過使eIF4F復(fù)合物和S6激酶磷酸化調(diào)節(jié)起始翻譯。eIF4E通常以低磷酸化狀態(tài)與eIF4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)結(jié)合，從而阻止翻譯起始復(fù)合物形成[16]。mTORC1磷酸化4E-BP1，降低其與eIF4E的親和力，允許eIF4F復(fù)合物的形成，并通過促進(jìn)核糖體向5’端移動(dòng)以增加翻譯量。eIF4F水平與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成水平直接相關(guān)。S6K磷酸化會(huì)激活其他翻譯因子，從而增加翻譯掃描，抑制蛋白翻譯抑制劑，并刺激氨基酸添加到新生肽鏈中[16]?？傊?，在生長因子或營養(yǎng)充足情況下，mTORC1是蛋白翻譯的主要調(diào)控因子。

3.2 mTORC2 關(guān)于mTORC2的研究資料較少，推測(cè)mTORC2主要在磷酸化和激活A(yù)KT中起重要作用。

4 mTOR通路在HCMV感染中作用

mTOR通路在HCMV感染中起重要作用。通常，在細(xì)胞應(yīng)激階段，如在HCMV感染時(shí)mTOR活性降低。AMPK作為mTOR抑制劑，在HCMV感染時(shí)上調(diào)，但在被感染細(xì)胞中，這種關(guān)系似乎并不相關(guān)[17]。HCMV多功能蛋白UL38(protein UL38)與TSC1/2結(jié)合，通過破壞AMPK的負(fù)調(diào)節(jié)作用激活mTORC1。因此，在HCMV感染后通過提高磷酸化水平和增加eIF4E蛋白量來促進(jìn)相關(guān)病毒復(fù)制蛋白質(zhì)的翻譯[18]。阻斷eIF4F復(fù)合物形成，可減少病毒復(fù)制，支持mTOR激活在HCMV感染復(fù)制階段具有重要作用。

mTOR在HCMV感染潛伏期的作用目前知之甚少。既往發(fā)現(xiàn)mTOR可以使一種轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子(KRAB-associated protein 1，KAP-1)磷酸化， KAP-1磷酸化的藥理作用可以激活處于潛伏期的HCMV，表明為維持HCMV感染潛伏期，可能需要抑制mTOR[19]。在單核細(xì)胞感染靜止期間，HCMV以一種PI3K/AKT依賴的方式激活mTOR。盡管mTOR活性增加，但HCMV的裂解復(fù)制并未啟動(dòng)，推測(cè)可能需要一個(gè)閾值水平驅(qū)動(dòng)復(fù)制，或者需要能與mTOR信號(hào)通路結(jié)合的其他因素驅(qū)動(dòng)復(fù)制。

在細(xì)胞應(yīng)激階段，熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcription factor-1,HSF1)[20]負(fù)責(zé)表達(dá)應(yīng)激相關(guān)蛋白，此通常與帽結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的翻譯無關(guān)。在HCMV感染的單核細(xì)胞中，存在從HSF1到mTOR的正反饋環(huán)，其中抑制HSF1活性可降低mTOR活性。

在HCMV感染單核細(xì)胞期間，mTOR和HSF1之間獨(dú)特的相互作用刺激產(chǎn)生抗凋亡mRNA的蛋白合成，如髓細(xì)胞白血病-1(myeloid leukemia cell-1，Mcl-1)蛋白、X染色體連鎖凋亡抑制基因(XIAP)、熱休克轉(zhuǎn)錄蛋白27(heat shock transcription protein 27，HSP27)，上述蛋白在生長因子處理后的細(xì)胞中不產(chǎn)生或微量產(chǎn)生,因此，可解釋在細(xì)胞應(yīng)激時(shí)HCMV感染能激活mTOR[19]的原因。與之前研究[20]一致，發(fā)現(xiàn)C10(一種選擇性的Mcl-1小分子抑制劑)抑制Mcl-1可顯著誘導(dǎo)感染單核細(xì)胞的凋亡和死亡。但是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，失去Mcl-1對(duì)加速未感染單核細(xì)胞的凋亡影響很小。表明未感染的單核細(xì)胞在維持正常免疫監(jiān)視功能的同時(shí)，可能選擇性地清除感染HCMV的單核細(xì)胞。小分子抑制劑對(duì)XIAP的抑制也會(huì)導(dǎo)致感染單核細(xì)胞的死亡，但對(duì)未感染細(xì)胞的影響很小。因此，這組上調(diào)的蛋白代表了一種新的細(xì)胞抗病毒靶點(diǎn)，旨在選擇性地清除HCMV感染的單核細(xì)胞，同時(shí)允許未感染的單核細(xì)胞維持其正常功能。潛伏感染的CD34+干細(xì)胞活性也高度依賴于Mcl-1，因此，Mcl-1抑制劑有可能消除靜止和潛伏狀態(tài)下的感染細(xì)胞。

總而言之，PI3K/AKT/mTOR通路在HCMV感染的三個(gè)階段都具有重要作用[2]：(1) 確保在裂解感染過程中滿足病毒生產(chǎn)代謝的需求；(2)促進(jìn)細(xì)胞向潛伏期感染的轉(zhuǎn)錄；(3)維持被感染單核細(xì)胞的生存。因此，PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制在抑制HCMV復(fù)制以及清除感染細(xì)胞的宿主方面具有雙重作用，這一作用對(duì)移植患者的長期預(yù)后十分重要。

5 mTORi對(duì)HCMV感染的影響

依維莫司(EVR)、西羅莫司(SRL)是哺乳動(dòng)物mTORi，具有免疫抑制和抗增殖作用。EVR已被證明可有效預(yù)防急性同種異體移植排斥反應(yīng)。聯(lián)合使用EVR，可以使鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑(CNI)的副作用最小化，同時(shí)保持CNI藥物效果和保護(hù)腎功能。臨床數(shù)據(jù)還表明，與霉酚酸酯(MMF)相比，EVR與降低CMV疾病發(fā)生有關(guān)[21]。HCMV復(fù)制依賴于宿主細(xì)胞中2種mTOR途徑中的1種，并且體外研究支持mTORi能夠降低HCMV感染[22-23]。在心臟移植術(shù)后，與使用MPA相比，使用EVR可降低HCMV事件(病毒血癥，臨床癥狀和感染)的發(fā)生率[24]。

多項(xiàng)研究[24-25]結(jié)果顯示，與MPA以及標(biāo)準(zhǔn)劑量TAC組患者相比，接受EVR和減少劑量TAC組患者中HCMV感染的發(fā)生率顯著降低，接受EVR的腎移植受者可能不需要進(jìn)行HCMV感染的預(yù)防，只有接受急性排斥治療的患者或早期停用EVR的患者應(yīng)進(jìn)行常規(guī)的HCMV感染預(yù)防，此為一種顯著節(jié)約成本的替代策略。

H?cker等[25]研究顯示，HCMV高危(D+/R-)患者中采用EVR和低劑量CSA方案與接受標(biāo)準(zhǔn)CNI方案的患者相比，HCMV感染率和病毒復(fù)制水平均明顯降低；基于EVR的免疫抑制方案使HCMV復(fù)制發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)比標(biāo)準(zhǔn)的CNI方案低83%；在HCMV復(fù)制高風(fēng)險(xiǎn)的兒童腎同種異體移植受者中，與標(biāo)準(zhǔn)劑量CNI方案相比，由EVR和低劑量糖皮質(zhì)激素(cyclosporin, CSA)組成的免疫抑制治療可使HCMV感染率和復(fù)制水平明顯降低。

6 mTORi未來應(yīng)用展望

盡管有大量臨床研究證實(shí)，mTORi能降低腎移植受者HCMV感染事件，但 Cristelli等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在HCMV高危(D+/R-)且接受了兔源抗胸腺球蛋白誘導(dǎo)和他克莫司治療的腎移植受者隊(duì)列中，接受mTORi的患者HCMV感染/HCMV病的發(fā)生率未顯著下降。mTORi對(duì)HCMV感染發(fā)生率的影響在HCMV高危(D+/R-)且未接受預(yù)防性抗病毒治療的腎移植患者中沒有在D-/R+腎移植受者中明顯。

mTORi相較于其他免疫抑制，對(duì)腎、神經(jīng)的毒性非常小，但也有其相關(guān)不良反應(yīng)，如高脂血癥、口腔潰瘍、貧血等[13]，故在使用mTORi時(shí)需警惕藥物不良反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)當(dāng)mTORi與其他免疫抑制相互組合時(shí)產(chǎn)生的不良反應(yīng)需進(jìn)一步研究探討。此外 Cristelli等[26]考慮mTORi效應(yīng)的大小可能與HCMV相關(guān)特異性記憶細(xì)胞的存在有關(guān)。但有關(guān)mTOR信號(hào)通路對(duì)漿細(xì)胞的分化和功能影響知之甚少。動(dòng)物試驗(yàn)研究顯示，mTOR信號(hào)通路在抗體反應(yīng)和漿細(xì)胞分化的早晚期皆發(fā)揮著重要的作用。

Bak等[27]通過CD3/CD28交聯(lián)反應(yīng)測(cè)定SRL對(duì)幼稚T細(xì)胞和HCMV特異性T細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)SRL對(duì)幼稚T細(xì)胞和HCMV特異性CD8+T細(xì)胞有超出免疫抑制劑應(yīng)用范圍的選擇性作用，可顯著改善HCMV特異性效應(yīng)記憶T細(xì)胞功能，對(duì)幼稚T細(xì)胞產(chǎn)生一定負(fù)性影響。

綜上所述，有關(guān)HCMV感染對(duì)CD4+T細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞的mTOR信號(hào)通路的影響值得更加深入地研究。