汪五清，曾義斌，張彤，張超，賀燕妮，杜凌波，強(qiáng)燕

(1上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院，上海201199；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬松江醫(yī)院)

銀屑病是一種自身免疫性慢性炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，其致死率較低，但是會(huì)嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量[1,2]。銀屑病是以角細(xì)胞過度增殖為主要病理變化，因此既往多以人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT為細(xì)胞模型進(jìn)行基礎(chǔ)研究[3]。姜黃素是一種從姜黃等藥用植物中提取的植物多酚，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種作用[4]，臨床上廣泛應(yīng)用于腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎、脊髓損傷、心血管疾病、糖尿病等疾病的治療，且取得了較好療效[5]。目前關(guān)于姜黃素治療銀屑病的研究較少，其作用機(jī)制也未闡明。2016年6月～2018年12月，本研究觀察了姜黃素對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：HaCaT細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫。主要試劑：姜黃素購自美國Sigma公司，DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibico公司;MTS增殖檢測(cè)試劑盒購自美國Biovision公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自凱基生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和RIPA裂解液購自碧云天生物科技有限公司，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購自美國Thermo公司，PVDF膜購自索萊寶科技有限公司;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)抗體orb163157購自英國Biorbyt 公司，細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)抗體ab16663、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗體ab32124、GAPDH抗體ab181602均購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 將HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2全濕培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合至90%時(shí)，按1∶3進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，隨機(jī)分為高、中、低濃度姜黃素組和對(duì)照組，高、中、低濃度姜黃素組分別加入終濃度為40、20、10 μmol/L的姜黃素，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTS法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，以2×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，參照1.2的方法進(jìn)行分組處理，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照。各組作用48 h，每孔加入30 μL MTS試劑，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。全波長(zhǎng)掃描儀獲得490 nm波長(zhǎng)處的OD值，細(xì)胞增殖抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白孔OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 細(xì)胞克隆形成能力觀察 采用平板克隆實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，以3×102/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，參照1.2的方法進(jìn)行分組處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組作用2周待克隆團(tuán)長(zhǎng)出后，終止培養(yǎng)。甲醇固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，記錄克隆形成數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞凋亡能力觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，以6×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，參照1.2的方法進(jìn)行分組處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組作用48 h，加入無EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，PBS沖洗3次，重懸于500 μL Binding Buffer中。分別加入5 μL FITC和PI染液，37 ℃條件下避光孵育30 min。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細(xì)胞周期比例檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，以6×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，參照1.2的方法進(jìn)行分組處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組作用48 h，加入胰酶消化收集細(xì)胞，PBS沖洗3次后，重懸于500 μL染色緩沖液中。分別加入250 μL PI和10 μL RNaseA染液，37 ℃條件下避光孵育30 min。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，以5×106/孔接種于10 cm3培養(yǎng)皿中，參照1.2的方法進(jìn)行分組處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組作用48 h，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS沖洗3次，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA。超聲裂解30 min，4 ℃條件下14 000 r/min離心20 min。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸變性后冷卻，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白。350 mA濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜120 min，TBST沖洗后5% BSA室溫封閉2 h。分別加入VEGF、Cyclin D1、Bcl-2及內(nèi)參蛋白GAPDH一抗(稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST沖洗3次;加入二抗(稀釋比例均為1∶10 000)，室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法曝光條帶，采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值計(jì)算VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率、克隆形成數(shù)、細(xì)胞凋亡率比較 高、中、低濃度姜黃素組和對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率均依次降低，克隆形成數(shù)依次升高，兩組間比較P均<0.05。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率、克隆形成數(shù)、細(xì)胞凋亡率比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與低濃度姜黃素組比較，#P<0.05；與中濃度姜黃素組比較，△P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞周期比例比較 高濃度姜黃素組G0/G1期細(xì)胞比例均高于中、低濃度姜黃素組和對(duì)照組，G2/M期細(xì)胞比例均低于中、低濃度姜黃素組和對(duì)照組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞周期比例比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與低濃度姜黃素組比較，#P<0.05；與中濃度姜黃素組比較，△P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)比較 高、中、低濃度姜黃素組和對(duì)照組細(xì)胞VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均依次升高，兩組間比較P均<0.05。見表3。

表3 各組細(xì)胞VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與低濃度姜黃素組比較，#P<0.05；與中濃度姜黃素組比較，△P<0.05。

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，以紅色斑塊上覆蓋銀白色鱗片為主要特征，最常發(fā)病于皮膚、指甲和關(guān)節(jié)等部位[2]。銀屑病病情頑固，復(fù)發(fā)率高，臨床上缺乏有效的治療手段[6]。銀屑病男女發(fā)病率無明顯區(qū)別，但是具有遺傳性，35%～90%的銀屑病患者有家族史[1]。目前銀屑病的發(fā)病原因不明，炎癥細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)、角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖以及新生血管形成是銀屑病的特征性病理表現(xiàn)，在臨床上主要通過恢復(fù)角化細(xì)胞、止癢、調(diào)節(jié)免疫和靶向藥物等方法治療銀屑病，但是效果并不理想[2]。

姜黃素屬于植物多酚，是一種稀有的二酮色素，主要從姜科植物的根莖中提取，為橙黃色粉末，多用于醬鹵制品、罐頭等食品的著色。近年來發(fā)現(xiàn)姜黃素除了傳統(tǒng)用途，還具有藥用價(jià)值，主要的藥理作用包括減輕炎癥反應(yīng)、抗氧化反應(yīng)、抗腫瘤、抗纖維化、調(diào)節(jié)免疫、降糖和降脂等[4]。姜黃素屬于天然產(chǎn)物，安全性較高，不良反應(yīng)小，在臨床上可用于治療多種疾病[5,6]。研究表明，姜黃素可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖分化，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7,8]。銀屑病是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性炎癥性疾病[9]，目前，關(guān)于姜黃素是否可以抑制銀屑病的進(jìn)展鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，姜黃素可抑制HaCaT細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，并呈濃度相關(guān)性。細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，Cyclin D1是細(xì)胞周期的正調(diào)控因子，可促使細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期，從而進(jìn)行有絲分裂、促進(jìn)細(xì)胞增殖[10]。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，在正常狀態(tài)下Bcl-2不表達(dá)或者表達(dá)較低，在增殖細(xì)胞內(nèi)Bcl-2過度表達(dá)而拮抗細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞維持在長(zhǎng)期存活的狀態(tài)[11,12]。本研究結(jié)果顯示，姜黃素可將HaCaT細(xì)胞阻滯于G0/G1期，并抑制HaCaT細(xì)胞中Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)，且呈濃度相關(guān)性；這說明姜黃素抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與抑制Cyclin D1、Bcl-2表達(dá)，從而使細(xì)胞阻滯于G0/G1期有關(guān)。

銀屑病是一種復(fù)雜的多因素疾病，表現(xiàn)為表皮細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及多種免疫因子異常和血管新生，其中異常新生的微血管與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在銀屑病紅斑真皮乳頭層中可見迂曲、擴(kuò)張的新生微血管[13]。血管異常新生受血管生長(zhǎng)因子和抑制因子調(diào)控，在正常狀態(tài)下兩者維持平衡，當(dāng)外部刺激時(shí)血管生長(zhǎng)因子生成增多，可導(dǎo)致血管病理性生成[14]。VEGF是一種重要的促血管生長(zhǎng)因子，在銀屑病早期VEGF可促進(jìn)血管基底膜分解及內(nèi)皮細(xì)胞遷移，銀屑病后期可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)與重構(gòu)血管新生網(wǎng)絡(luò)，在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[15]。研究表明，VEGF可參與腫瘤血管新生，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中具有重要作用[16,17]。本研究結(jié)果顯示，姜黃素處理HaCaT細(xì)胞后VEGF蛋白表達(dá)降低，并呈濃度相關(guān)性；表明姜黃素可能通過抑制VEGF而調(diào)控HaCaT細(xì)胞的增殖與凋亡，最終參與血管新生。

綜上所述，姜黃素可抑制HaCaT細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并呈濃度相關(guān)性，其機(jī)制可能與抑制VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。