張孝欽，陳玄一，鄔盛昌

本研究背景及創(chuàng)新點(diǎn)：

（1）晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）化療療效評(píng)判依靠肺部CT病灶前后對(duì)比，缺乏有效的短期療效考核手段。如果某項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)能動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)化療療效以指導(dǎo)肺癌的個(gè)體化治療，該檢測(cè)指標(biāo)有著重要的臨床意義。近年來由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）檢測(cè)技術(shù)有了很大的發(fā)展，CTCs的檢測(cè)在腫瘤的診斷、個(gè)體化治療、療效評(píng)估、預(yù)后監(jiān)測(cè)等方面發(fā)揮著越來越重要的作用。（2）本研究探討CTCs在晚期NSCLC化療療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后預(yù)測(cè)中的價(jià)值。研究結(jié)果表明應(yīng)用免疫磁珠富集技術(shù)結(jié)合熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)CTCs具有可行性。CTCs陽性表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)。CTCs作為無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、可重復(fù)、取材方便、可靠的檢測(cè)指標(biāo)，與晚期NSCLC的化療療效及預(yù)后具有相關(guān)性，可作為敏感的化療療效監(jiān)測(cè)及生存期預(yù)測(cè)的考核指標(biāo)，為晚期NSCLC個(gè)體化治療方案的制定及調(diào)整提供有力依據(jù)。

肺部惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率近年來在全球均有顯著增長(zhǎng)，發(fā)病率和死亡率已分別位居惡性腫瘤的第2位和第1位，肺部惡性腫瘤中大約80%為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），而近2/3的NSCLC患者就診時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響預(yù)后，NSCLC患者的5年生存率不足5%［1-3］。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）指從腫瘤原發(fā)病灶脫落后進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞，具有與原發(fā)灶癌細(xì)胞相似的基因遺傳學(xué)特征［4-6］。近年來，對(duì)CTCs的研究已成為腫瘤領(lǐng)域臨床科研的熱點(diǎn)，由于CTCs檢測(cè)技術(shù)有了很大的發(fā)展，CTCs的檢測(cè)在腫瘤的診斷、個(gè)體化治療、療效評(píng)估、預(yù)后監(jiān)測(cè)等方面發(fā)揮著越來越重要的作用［7-9］。本研究通過應(yīng)用免疫磁珠富集技術(shù)結(jié)合熒光細(xì)胞化學(xué)染色法定量檢測(cè)CTCs，分析討論CTCs與晚期NSCLC臨床特征、化療療效及預(yù)后的相關(guān)性，探討其指導(dǎo)晚期NSCLC個(gè)體化治療的可行性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2015年12月—2016年12月浙江省人民醫(yī)院收治的晚期NSCLC患者50例為肺癌組，其中男26例，女24例；年齡43～79歲，中位年齡67歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）18～80歲；（2）病理學(xué)診斷為NSCLC，臨床分期屬ⅢB期或Ⅳ期；（3）入組前未進(jìn)行全身和局部治療如手術(shù)、放療或化療；（4）預(yù)計(jì)生存期＞3個(gè)月。同時(shí)選擇同時(shí)期體檢健康志愿者50例為對(duì)照組，其中男28例，女22例；年齡34～68歲，中位年齡52歲。肺癌組與對(duì)照組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.161，P=0.688；t=1.450，P=0.153）。本研究通過浙江省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 收集肺癌組患者的臨床資料 包括吸煙率、病理類型、分化程度、淋巴結(jié)分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期，分析CTCs與上述臨床特征的相關(guān)性。

1.2.2 外周血CTCs動(dòng)態(tài)檢測(cè) 對(duì)照組于體檢時(shí)，肺癌組患者于化療前、化療第1周期結(jié)束后進(jìn)行CTCs檢測(cè)，并繼續(xù)追蹤監(jiān)測(cè)，如患者的影像學(xué)評(píng)估化療療效為疾病進(jìn)展（PD）時(shí)再次抽血行CTCs檢測(cè)。

1.2.3 CTCs檢測(cè)方法 外周血采集：空腹抽取外周靜脈血15 ml，血標(biāo)本采集后立即置于抗凝采血管中，使采血管多次倒轉(zhuǎn)，將抗凝劑與外周血充分混合預(yù)防血液凝固，抗凝外周血保存于低溫環(huán)境（4 ℃），12 h內(nèi)及時(shí)檢測(cè)。白細(xì)胞吸附、腫瘤細(xì)胞富集：加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解釋放的基質(zhì)通過離心清除（離心半徑 10 cm，800 r/min 離心 5 min），離心后留下的細(xì)胞包括白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，使用免疫磁珠吸附白細(xì)胞，富集腫瘤細(xì)胞。利用熒光細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)鑒定CTCs。鑒定標(biāo)準(zhǔn)：（1）細(xì)胞形態(tài)及體積：圓形或橢圓形，邊界清楚，體積較大，大于白細(xì)胞；（2）細(xì)胞核：邊界清楚，染色明亮，核大，核質(zhì)比例大，核分裂增多，可見病理性核分裂；（3）熒光細(xì)胞化學(xué)染色：胞質(zhì)抗CK-8（+）、CD45（-）。熒光顯微鏡下通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)外周血CTCs，熒光顯微鏡檢測(cè)到CTCs判定為CTCs陽性。

1.2.4 化療療效評(píng)價(jià) 肺癌組接受常規(guī)化療（順鉑+吉西他濱或順鉑+培美曲塞），化療第2周期結(jié)束后依照影像學(xué)結(jié)果按RECIST 1.1評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［10］分為完全緩解（CR）：所有病灶消失；部分緩解（PR）：病灶最長(zhǎng)徑縮?。?0%；PD：病灶最長(zhǎng)徑增加＞20%；疾病穩(wěn)定（SD）：病灶最長(zhǎng)徑有所縮小但沒有達(dá)到PR的標(biāo)準(zhǔn)或有所增加但沒有達(dá)到PD的標(biāo)準(zhǔn)，CR+PR+SD為疾病控制。本研究CTCs評(píng)價(jià)化療療效定義為化療前后CTCs數(shù)目減少或無變化為疾病控制，數(shù)目增加為PD。

1.2.5 生存期隨訪 對(duì)肺癌組患者進(jìn)行生存期隨訪，統(tǒng)計(jì)其總生存期（OS）和無進(jìn)展生存期（PFS），分析CTCs與患者預(yù)后的相關(guān)性。PFS指自治療第1天起至病變進(jìn)展日；OS為自治療第1天起至死亡日或失訪日，均以月計(jì)算。隨訪截至2018年12月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)分析；OS和PFS的比較采用Kaplan-Meier法生存分析，并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組與對(duì)照組CTCs的表達(dá)差異 對(duì)照組外周血中均未檢測(cè)到CTCs，肺癌組50例患者外周血中39例檢測(cè)到CTCs，陽性率為78.0%，CTCs數(shù)值為1～8個(gè)，中位數(shù)為4個(gè)。肺癌組與對(duì)照組CTCs陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=63.934，P＜0.001，見圖1）。

2.2 CTCs與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系 CTCs陽性與CTCs陰性患者性別、年齡、吸煙率、病理類型、分化程度、淋巴結(jié)分期比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CTCs陽性與CTCs陰性患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 CTCs與影像學(xué)表現(xiàn)的關(guān)系 化療前檢測(cè)肺癌組患者，其中CTCs陽性39例，陽性率為78.0%；化療第1周期結(jié)束后再次檢測(cè)肺癌組患者，其中CTCs陽性18例，陽性率為36.0%，化療前與化療第1周期結(jié)束后CTCs陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.432，P=0.035，見表2）。肺癌組患者在化療前及化療第2周期結(jié)束后均行肺部CT檢查，依據(jù)RECIST 1.1評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，32例患者評(píng)價(jià)為疾病控制（15例患者獲得PR，17例患者為SD，0例患者為CR），18例患者評(píng)價(jià)為PD。同時(shí)50例患者在化療前及化療第1周期結(jié)束后行CTCs療效評(píng)價(jià)，31例患者評(píng)價(jià)為疾病控制（較化療前CTCs下降13例，無變化18例），19例患者較化療前CTCs上升，評(píng)價(jià)為PD?；煹?周期結(jié)束后CTCs動(dòng)態(tài)變化情況與化療第2周期結(jié)束后RECIST 1.1評(píng)價(jià)對(duì)晚期NSCLC患者化療效果的評(píng)價(jià)具有一致性（Kappa=0.528，P＜0.001）。

2.4 PD時(shí)CTCs水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系 影像學(xué)評(píng)估為PD的18例患者，再次抽血檢測(cè)CTCs，其中CTCs陽性14例，14例中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移12例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率為85.7%，CTCs陰性4例，均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，兩者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.286，P=0.001，見表3）。

表1 CTCs與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 The relationship between CTCs and clinic opathological features in patients with advanced NSCLC

2.5 CTCs與患者預(yù)后的關(guān)系 生存分析結(jié)果顯示，化療前CTCs陽性的NSCLC患者中位PFS為4個(gè)月，化療前CTCs陰性的NSCLC患者中位PFS為11個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.847，P＜0.001，見圖2）；化療前CTCs陽性患者的中位OS為7個(gè)月，化療前CTCs陰性患者的中位OS為18個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.912，P＜0.001，見圖3）。

表2 化療前后CTCs陽性率比較（例）Table 2 Comparison of prevalence of positive CTCs in advanced NSCLC patients before and after chemotherapy

表3 PD時(shí)CTCs陽性與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系（例）Table 3 The relationship between CTCs positive prevalence and distant metastasis in advanced NSCLC patients with disease progression after chemotherapy

圖1 熒光顯微鏡下觀察到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（×200）Figure 1 CTCs observed under fluorescence microscope

3 討論

肺癌是目前發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，死亡率居惡性腫瘤前列。因肺癌初期癥狀不典型，早期明確診斷較為困難，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，無法手術(shù)進(jìn)行根治，通常采用化療延長(zhǎng)生存時(shí)間［11］。但即使腫瘤來源、分期及病理類型相同，因?yàn)槟[瘤存在異質(zhì)性，不同個(gè)體對(duì)相同的化療方案也會(huì)出現(xiàn)療效的差別，這使得以往肺癌化療所采用的經(jīng)驗(yàn)性治療無法使每例患者均得到最佳的化療療效［12］。為提高療效，改善預(yù)后，針對(duì)不同肺癌患者的個(gè)體化精準(zhǔn)治療已成為肺癌化療的方向［13］。目前臨床進(jìn)行化療療效評(píng)判主要依靠肺部CT病灶前后對(duì)比，缺乏有效的短期療效考核手段，尤其是實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，因而無法進(jìn)行有效的個(gè)體化治療［14］。所以臨床上如果有一項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)能動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)化療療效以指導(dǎo)肺癌的個(gè)體化治療，則該檢測(cè)指標(biāo)有著重要的臨床意義。

圖2 化療前CTCs陽性與 CTCs陰性患者PFS比較Figure 2 Comparison of PFS in CTCs positive and CTCs negative patients before chemotherapy

圖3 化療前CTCs陽性與 CTCs陰性患者OS比較Figure 3 Comparison of OS in CTCs positive and CTCs negative patients before chemotherapy

CTCs是指從腫瘤原發(fā)病灶脫落后進(jìn)入血液循環(huán)，能逃脫自身免疫清除而生存下來的腫瘤細(xì)胞，具有與原發(fā)灶癌細(xì)胞相似的基因遺傳學(xué)特征，與惡性腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［15-16］。因?yàn)镃TCs數(shù)量很少，不易準(zhǔn)確檢測(cè)，在早期臨床上很難開展。由于近年來生物學(xué)技術(shù)突飛猛進(jìn)，CTCs的檢測(cè)水平也有了顯著提高，目前CTCs檢測(cè)成為臨床研究的熱點(diǎn)［17-19］。CTCs的富集是利用CTCs與血細(xì)胞不同的物理特征或生物學(xué)特征，分離CTCs與血細(xì)胞，通過富集分離，使CTCs的水平明顯提高，有利于后續(xù)的相關(guān)研究［7］。根據(jù)物理特性的分離方法有：按照細(xì)胞體積大小使用濾膜實(shí)現(xiàn)分離；按照細(xì)胞變形能力大小使用微流控芯片實(shí)現(xiàn)分離；按照細(xì)胞密度大小使用密度梯度離心實(shí)現(xiàn)分離，這種方法的優(yōu)勢(shì)是分離CTCs時(shí)不需要進(jìn)行特殊標(biāo)志物標(biāo)識(shí)，操作方便快速，其缺點(diǎn)在于因?yàn)槭艿桨准?xì)胞的影響會(huì)使CTCs的分離純度受到較大影響［17，20］。生物學(xué)特性富集是利用CTCs或白細(xì)胞的特異性抗原實(shí)現(xiàn)分離，免疫磁珠法就是利用生物學(xué)特性的一種重要的分離方法，可分為陽性分離和陰性分離，陽性分離指利用CTCs特異性抗原的抗體，如抗EpCAM等對(duì)CTCs進(jìn)行特異性地捕獲，達(dá)到分離的目的，而陰性分離是采用CD45免疫磁珠吸附白細(xì)胞，從而消除白細(xì)胞，達(dá)到富集分離CTCs的目的，陰性分離可以分離所有的CTCs，包括 EpCAM抗原（-）的腫瘤細(xì)胞，而且分離過程中CTCs沒有發(fā)生任何生物學(xué)反應(yīng)，因此腫瘤細(xì)胞的特征未受到任何影響［21］。本研究采用免疫磁珠陰性富集法分離CTCs，對(duì)獲取的CTCs使用熒光細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行分析和判定。本研究中，50例NSCLC患者中有39例找到CTCs，陽性率達(dá)78.0%；對(duì)照組均未找到CTCs，說明該檢測(cè)具有較高的特異性，證實(shí)了免疫磁珠陰性富集法結(jié)合熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)CTCs的可行性。

本研究通過分析CTCs與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系，觀察到CTCs陽性與NSCLC患者性別、年齡、吸煙、病理類型、分化程度、淋巴結(jié)分期無關(guān)，與患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)。CTCs陽性患者臨床分期較晚，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，證實(shí)了CTCs是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶形成的關(guān)鍵因素之一。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者在化療前后CTCs存在明顯差異，化療第1周期結(jié)束后CTCs陽性率明顯下降，盡管部分患者在治療后外周血中仍存在CTCs，但治療后明顯低于治療前，提示CTCs與化療療效有相關(guān)性。目前NSCLC化療療效的評(píng)價(jià)仍采用實(shí)體瘤的RECIST評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，按照肺部CT顯示的腫瘤大小分為CR、PR、SD以及PD來評(píng)估療效，指導(dǎo)下一步的化療方案。本研究對(duì)50例NSCLC患者化療第1周期結(jié)束后行CTCs評(píng)價(jià)及化療第2周期結(jié)束后行RECIST 1.1評(píng)價(jià)，通過對(duì)兩種評(píng)價(jià)結(jié)果的比較，提示兩種方法對(duì)療效的評(píng)判無明顯差別，具有很高的一致性?；熀蠓尾緾T評(píng)價(jià)為疾病控制的NSCLC患者，CTCs數(shù)量減少或消失，提示肺癌原發(fā)病灶得到控制，入血的CTCs減少或消失，當(dāng)前的化療方案針對(duì)該患者有效；而肺部CT評(píng)價(jià)為PD的肺癌患者，入血的CTCs數(shù)量常增多，提示該患者對(duì)當(dāng)前的化療方案敏感性低，肺癌腫塊在持續(xù)增大，需及時(shí)調(diào)整治療方案。因此，通過監(jiān)測(cè)化療期間CTCs變化可以預(yù)測(cè)NSCLC的進(jìn)展情況和治療的有效性。

同時(shí)，因?yàn)榛煹?周期結(jié)束后CTCs的變化即與化療第2周期結(jié)束后肺部CT的變化一致，提示CTCs評(píng)價(jià)比肺部CT評(píng)估更為敏感，CTCs的動(dòng)態(tài)變化可作為化療是否有效的更為早期的敏感指標(biāo)。肺部CT評(píng)價(jià)僅對(duì)化療前后肺部腫瘤大小變化進(jìn)行評(píng)估而對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移特性無法進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷，導(dǎo)致有些患者影像學(xué)評(píng)價(jià)疾病無進(jìn)展，卻已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了早期調(diào)整化療方案的機(jī)會(huì)。而CTCs動(dòng)態(tài)變化的檢測(cè)更能體現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移特性。同時(shí)影像學(xué)檢查具有放射損害、影像變化滯后、無法短期復(fù)查等缺點(diǎn)，而CTCs檢測(cè)具有創(chuàng)傷小、操作簡(jiǎn)便和可短期多次復(fù)查等優(yōu)點(diǎn)，為指導(dǎo)NSCLC患者的個(gè)體化治療提供了有力的技術(shù)保障。

本研究還對(duì)化療后表現(xiàn)為PD的NSCLC患者繼續(xù)進(jìn)行CTCs的監(jiān)測(cè)，同時(shí)對(duì)該組患者CTCs水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。分析提示，PD的NSCLC患者中CTCs陽性者，大多表現(xiàn)為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而CTCs陰性者，均表現(xiàn)為局部復(fù)發(fā)，無一例提示有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。而出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是提示NSCLC患者預(yù)后差的重要因素。因此對(duì)PD的NSCLC患者繼續(xù)檢測(cè)CTCs水平可預(yù)測(cè)其未來生存期。

本研究的生存分析結(jié)果表明，CTCs陰性患者的OS和PFS均要長(zhǎng)于CTCs陽性患者，這說明NSCLC外周血CTCs陽性提示預(yù)后不良，與相關(guān)研究結(jié)果相一致［22-23］。可能與CTCs陽性患者臨床分期晚，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率及風(fēng)險(xiǎn)高有關(guān)，因此在臨床上可以通過檢測(cè)化療前CTCs水平對(duì)NSCLC患者的生存期進(jìn)行一個(gè)較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。

綜上所述，應(yīng)用免疫磁珠富集技術(shù)結(jié)合熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)CTCs具有可行性，CTCs作為無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、可重復(fù)、取材方便、可靠的檢測(cè)指標(biāo)，與晚期NSCLC的化療療效及預(yù)后具有相關(guān)性，可作為敏感的化療療效監(jiān)測(cè)及生存期預(yù)測(cè)的考核指標(biāo)，為晚期NSCLC個(gè)體化治療方案的制定及調(diào)整提供有力依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：張孝欽負(fù)責(zé)文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析，結(jié)果的分析與解釋，撰寫與修訂論文，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)；陳玄一、鄔盛昌進(jìn)行數(shù)據(jù)收集與整理，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。