陸瑋，肖乾，胡燁婷，孔祥興，丁克峰

0 引言

結(jié)直腸癌是威脅人類健康的重大疾病之一，全世界范圍內(nèi)每年約有130萬(wàn)新發(fā)結(jié)直腸癌患者，約86萬(wàn)結(jié)直腸癌患者死亡[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，飲食習(xí)慣變化、生活環(huán)境改變、微生物暴露、免疫炎性反應(yīng)、基因改變及表觀遺傳等多種因素在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起推動(dòng)作用。消化道是人體內(nèi)微生物多樣性和豐度最高的部位之一，目前有很多研究報(bào)道了微生物與消化系統(tǒng)疾病之間的密切關(guān)系[2-3]。在結(jié)直腸癌領(lǐng)域，隨著近年來(lái)微生物組學(xué)技術(shù)以及生物信息分析方法的發(fā)展，結(jié)直腸癌與正常人群之間腸道菌群多樣性和豐度的差異也被廣泛報(bào)道[4-5]；在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，研究者們發(fā)現(xiàn)微生物通過(guò)產(chǎn)生基因毒性物質(zhì)、誘導(dǎo)慢性炎性反應(yīng)、抑制宿主免疫功能等機(jī)制，發(fā)揮促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生的作用[6-7]；某些特定細(xì)菌如具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum），除了在結(jié)直腸癌患者的原發(fā)灶中富集，還存在于結(jié)直腸癌患者的肝轉(zhuǎn)移灶中[8]；利用結(jié)直腸腫瘤患者與健康人群腸道菌群的差異，研究者們建立了結(jié)直腸腫瘤的早期篩查、診斷模型[9]；微生物不僅能夠參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，還能夠影響結(jié)直腸癌的治療效果[10-11]。本文以微生物與結(jié)直腸癌的關(guān)系為切入點(diǎn)，結(jié)合近年的相關(guān)文獻(xiàn)及自身研究，綜述微生物與結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷和治療的研究進(jìn)展。

1 微生物與結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制

腸道菌群在結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們可以產(chǎn)生基因毒性物質(zhì)，直接造成DNA損傷、誘發(fā)基因突變，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生[2,12]。Boleij等[12]研究報(bào)道，超過(guò)80%的結(jié)直腸癌患者腸黏膜中存在產(chǎn)腸毒素的脆弱擬桿菌（enterotoxigenicBacteroides fragilis,ETBF），而脆弱擬桿菌毒素（Bacteroides fragilistoxin,BFT）可以通過(guò)升高反應(yīng)活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平造成宿主細(xì)胞DNA損傷[13]。一些細(xì)菌毒素還含有能夠直接與DNA形成加合物的活性基團(tuán)，而這種龐大的DNA雙鏈加合物如果不能及時(shí)修復(fù)，可能會(huì)造成DNA雙鏈斷裂以及基因突變。Wilson等[2]報(bào)道，pks島陽(yáng)性的大腸桿菌（pks+Escherichia coli）可以表達(dá)大腸桿菌素活化肽酶（ClbP），其可以促進(jìn)毒性代謝產(chǎn)物大腸桿菌素（colibactin）的活化，而大腸桿菌素中含有的環(huán)丙烷基團(tuán)是DNA烷基化基團(tuán)，其可以與宿主細(xì)胞雙鏈DNA交聯(lián)形成烷基化的加合物。大腸桿菌素對(duì)宿主DNA的破壞并非隨機(jī)而是具有選擇性的，大腸桿菌素選擇性地誘導(dǎo)宿主DNA損傷的序列被稱為大腸桿菌素破壞基序（AAWWTT序列），并且大腸桿菌素破壞基序與結(jié)直腸癌基因組中的突變熱點(diǎn)，尤其是結(jié)直腸癌的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因APC的突變位點(diǎn)高度一致[14]。隨著這些細(xì)菌來(lái)源的基因毒性物質(zhì)促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制不斷被闡明，它們將來(lái)有希望成為結(jié)直腸癌預(yù)防和治療的重要靶點(diǎn)。

炎性反應(yīng)與腫瘤的發(fā)生密不可分，基因毒性物質(zhì)造成的DNA損傷和炎性反應(yīng)互為因果，協(xié)同促進(jìn)腫瘤發(fā)生[15]。腸道菌群失衡引起的慢性炎性反應(yīng)、局部免疫微環(huán)境紊亂會(huì)使腸道黏膜屏障持續(xù)受到破壞，進(jìn)而使正常腸道上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞持續(xù)暴露于促腫瘤微生物及其產(chǎn)物中，促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生[16]。Kostic等研究發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞高表達(dá)COX-2、NF-κB、TNF-α等炎性反應(yīng)相關(guān)基因，促進(jìn)IL-1β、IL-6、IL-8等促炎細(xì)胞因子分泌[17]。除此之外，具核梭桿菌還可以通過(guò)招募骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC）、通過(guò)其外膜表面的Fap2和RadD蛋白直接誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞死亡，從而抑制宿主的抗腫瘤免疫功能，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[17-18]。具核梭桿菌除了在結(jié)直腸癌患者的原發(fā)灶中富集，Bullman等還在結(jié)直腸癌患者的肝轉(zhuǎn)移灶中分離培養(yǎng)得到了具核梭桿菌，并且發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶中具核梭桿菌的基因組序列高度相似，相對(duì)豐度也較為接近[8]。因此，在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞可能與具核梭桿菌等某些特定細(xì)菌共同轉(zhuǎn)移至肝臟，形成肝轉(zhuǎn)移灶周圍的微生物微環(huán)境。而目前對(duì)于肝轉(zhuǎn)移灶中微生物發(fā)揮的生物學(xué)功能尚無(wú)研究報(bào)道，探索其是否對(duì)晚期結(jié)直腸癌患者具有預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值、是否能夠影響化療及靶向治療療效等都將成為今后的研究熱點(diǎn)。

有益的腸道菌群可以產(chǎn)生抗腫瘤物質(zhì)，降低結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。腸道菌群可以利用膳食纖維發(fā)酵產(chǎn)生丁酸等短鏈脂肪酸，而丁酸可以作為正常腸道上皮細(xì)胞的供能物質(zhì)，對(duì)于維持上皮細(xì)胞的屏障功能以及損傷修復(fù)具有重要作用[19]。Furusawa等研究發(fā)現(xiàn)，丁酸可以提高腸道組織中的Treg細(xì)胞FOXP3基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白乙酰化水平，從而增加FOXP3基因的表達(dá)和FOXP3+Treg細(xì)胞的比例，抑制結(jié)腸炎癥的形成[20]。丁酸還能夠間接作用于腸道內(nèi)其他細(xì)菌，其在高濃度的抗炎作用下會(huì)限制其他腸道菌群引起的炎性免疫反應(yīng)，但是其在低濃度時(shí)反而會(huì)誘發(fā)炎性反應(yīng)，抑制潛在病原體的生長(zhǎng)從而恢復(fù)丁酸菌群的豐度[21]。丁酸在不同濃度下的抗炎、促炎雙重作用可能是腸道菌群維持穩(wěn)態(tài)的機(jī)制之一。

在結(jié)直腸癌的發(fā)展早期對(duì)腸道微環(huán)境進(jìn)行干預(yù)，可能會(huì)降低結(jié)直腸癌的發(fā)生率、延緩結(jié)直腸癌的發(fā)展過(guò)程。但是目前對(duì)于微生物在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制有待完善，仍然需要在大樣本的人群中進(jìn)行驗(yàn)證。未來(lái)對(duì)于腸道菌群與結(jié)直腸癌相互作用分子機(jī)制的進(jìn)一步闡明，將有助于發(fā)現(xiàn)新的預(yù)防與治療靶點(diǎn)，從而有希望降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率。

2 微生物與結(jié)直腸癌的早期診斷

目前結(jié)直腸癌的診斷流程主要是糞便隱血篩查、電子腸鏡檢查以及病理活檢確診[22]。但是目前的診斷流程仍然存在缺陷，例如糞便隱血篩查的敏感度和特異性較低[23]，電子腸鏡檢查雖然能夠確診結(jié)直腸癌，但是作為侵入性檢查，患者對(duì)腸鏡的接受程度以及成本效益關(guān)系決定了腸鏡不適合用于人群結(jié)直腸癌的篩查，而適用于高度懷疑為結(jié)直腸癌患者的確診檢查。因此，尋找更加準(zhǔn)確的結(jié)直腸癌篩查、診斷方法是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

2.1 腸道菌群與結(jié)直腸癌的早期診斷

近年來(lái)隨著微生物組學(xué)技術(shù)以及生物信息分析方法的發(fā)展，很多大規(guī)模的研究報(bào)道了結(jié)直腸癌與健康人之間腸道菌群多樣性和豐度的差異[4-5]。Shah等[24]采用16S rDNA測(cè)序分析了結(jié)直腸癌患者與健康人群糞便菌群豐度的差異，鑒定獲得數(shù)十個(gè)豐度顯著差異的操作分類單元（operational taxonomic units,OTU），對(duì)這些OTU進(jìn)行注釋發(fā)現(xiàn)它們來(lái)源于卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）、胃鏈球菌屬（Peptostreptococcus）、微單胞菌屬（Parvimonas）、阿克曼菌屬（Akkermansia）和梭桿菌屬（Fusobacterium）；利用這些OTU的豐度建立分類預(yù)測(cè)模型，能夠較好的區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康人群（AUC=0.76）；除此之外，將OTU的豐度與患者的臨床信息一起納入分類預(yù)測(cè)模型，模型的預(yù)測(cè)效果可以進(jìn)一步提升（AUC=0.833）。Yu等[9]采用宏基因組測(cè)序分析了中國(guó)人群中結(jié)直腸癌患者與健康人群糞便細(xì)菌基因的差異，鑒定得到包括來(lái)自具核梭桿菌的丁酰CoA脫氫酶在內(nèi)的20個(gè)相對(duì)表達(dá)量具有顯著差異的細(xì)菌基因，采用這些細(xì)菌基因的相對(duì)表達(dá)量建立分類預(yù)測(cè)模型，也能夠達(dá)到區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康人群的效果（AUC=0.71）。除了腸道中的細(xì)菌，采用宏基因組測(cè)序還可以獲得腸道中的其他微生物的豐度。Nakatsu等[25]還報(bào)道了結(jié)直腸癌患者糞便中的噬菌體病毒多樣性顯著高于健康人群，結(jié)直腸癌患者糞便中細(xì)菌的多樣性低于健康人群，并且基于結(jié)直腸癌患者與健康人群糞便中豐度顯著差異的病毒例如巨細(xì)胞病毒屬（Cytomegalovirus）、正布尼亞病毒屬（Orthobunyavirus）等建立分類預(yù)測(cè)模型，也能夠較好地區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康人群（AUC=0.802）。

2.2 口腔菌群與結(jié)直腸癌的早期診斷

除了尋找結(jié)直腸癌患者與健康人群在腸道中顯著差異的微生物，一些研究還報(bào)道了結(jié)直腸癌患者身體其他部位、器官的菌群失衡?？谇皇巧舷赖钠鹗?，每一個(gè)個(gè)體都具有獨(dú)特的口腔菌群。Russo等[26]報(bào)道了結(jié)直腸癌患者口腔中具核梭桿菌的含量較健康人群顯著增加。研究者們還采用了16S rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)于結(jié)直腸癌患者與健康人群口腔差異菌群進(jìn)行了探索。Flemer等[27]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者與健康人群口腔菌群顯著差異的OTU主要來(lái)源于嗜血桿菌屬（Haemophilus）、胞菌屬（Parvimonas）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、擬普雷沃氏菌屬（Alloprevotella）等菌屬，利用16個(gè)顯著差異的OTU的豐度建立分類預(yù)測(cè)模型，能夠較好的區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康人群（AUC=0.905）以及結(jié)直腸息肉患者與健康人群（AUC=0.891）。相比于糞便菌群檢測(cè)，口腔菌群檢測(cè)的便捷性更好，患者的依從性更高，但是飲食習(xí)慣、地域、人種等因素可能會(huì)對(duì)口腔菌群造成較大影響，此項(xiàng)研究結(jié)果也需要進(jìn)行多中心的獨(dú)立驗(yàn)證。

2.3 血液游離細(xì)菌DNA與結(jié)直腸癌的早期診斷

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，在沒(méi)有系統(tǒng)性感染存在的情況下血液是無(wú)菌的。Kowarsky等[28]發(fā)現(xiàn)，健康人群血液中的游離DNA（cell-free DNA,cfDNA）中有約0.5%～10%的讀段無(wú)法比對(duì)到人的基因組，其中一部分讀段可以比對(duì)到細(xì)菌、病毒和真菌的基因組。Huang等[29]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血液中的游離DNA中也含有無(wú)法比對(duì)到人的基因組的讀段，而這些非人源的DNA片段大部分都來(lái)源于細(xì)菌基因組。我們前期對(duì)12例結(jié)直腸癌患者和11例健康人群的cfDNA進(jìn)行了宏基因組測(cè)序，也發(fā)現(xiàn)了其中微量的非宿主來(lái)源的DNA片段，它們主要來(lái)源于丙酸桿菌屬（Cutibacterium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、多核桿菌屬（Polynucleobacter）、巴氏桿菌屬（Pasteurella）和腸球菌屬（Enterococcus）等。進(jìn)一步將這些非宿主來(lái)源的DNA片段比對(duì)到細(xì)菌基因組并進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者與健康人群的cfDNA存在127個(gè)顯著差異的細(xì)菌（FDR＜0.1）?；诓町惣?xì)菌的豐度數(shù)據(jù)，采用隨機(jī)森林模型對(duì)這些顯著差異的細(xì)菌進(jìn)行篩選并建立分類預(yù)測(cè)模型，最終納入分類預(yù)測(cè)模型的細(xì)菌共有28個(gè)。我們將該模型在另一批樣本中進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證，共包含13例結(jié)直腸癌患者、10例結(jié)直腸腺瘤患者和11例健康人群，并計(jì)算每個(gè)個(gè)體患結(jié)直腸癌的概率。我們發(fā)現(xiàn)該模型不僅能夠很好的區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康人群（AUC=1），也能夠很好的區(qū)分結(jié)直腸腺瘤患者與健康人群（AUC=1）。該研究尚未正式發(fā)表，可在預(yù)印本網(wǎng)站BioRxiv查詢相關(guān)結(jié)果（https://www.biorxiv.org/content/10.1104/647644v1）。

采用cfDNA中細(xì)菌DNA的豐度對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行早期診斷是一個(gè)新興領(lǐng)域，其具有非侵入性、患者依從性高、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)，并且結(jié)直腸腺瘤也能在該分類預(yù)測(cè)模型中得到很好的識(shí)別。但是目前我們對(duì)于這些細(xì)菌DNA的來(lái)源仍然未知，雖然我們發(fā)現(xiàn)它們與胃腸道的菌群存在一部分重合，提示它們可能來(lái)源于受損的消化道黏膜屏障，但是全身其他部位與器官常駐細(xì)菌的DNA也能夠在血液中檢測(cè)到，提示cfDNA中細(xì)菌DNA可能是全身各個(gè)部位細(xì)菌DNA的綜合。在血液循環(huán)中，僅僅存在細(xì)菌的DNA還是有存活細(xì)菌尚未知，鑒于Bullman等[8]報(bào)道結(jié)直腸癌肝臟轉(zhuǎn)移灶中也有可培養(yǎng)的活細(xì)菌存在，因此在血液循環(huán)中很可能有微量的存活細(xì)菌，而它們是否發(fā)揮了生物學(xué)功能仍然未知。此外，年齡、地域、人種等混雜因素可能會(huì)對(duì)cfDNA中細(xì)菌的組成造成影響，cfDNA中細(xì)菌成分用于結(jié)直腸癌早期診斷的結(jié)果未來(lái)也需要多中心研究進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證。

3 微生物與結(jié)直腸癌的治療

隨著微生物促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)某些微生物可能成為抑制結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的藥物靶點(diǎn)。Cougnoux等以大腸桿菌素活化肽酶為靶點(diǎn)，篩選了2種小分子抑制劑，在體外實(shí)驗(yàn)中它們能夠減弱pks+E.coli的基因毒性、逆轉(zhuǎn)宿主細(xì)胞的DNA損傷，并且它們?cè)谛∈竽Ｐ椭羞€可以抑制pks+ E.coli誘導(dǎo)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生率[30]。具核梭桿菌是革蘭氏陰性專性厭氧菌，對(duì)于甲硝唑敏感。Bullman等采用具核梭桿菌陽(yáng)性的結(jié)直腸癌組織樣本建立了人源腫瘤異體移植小鼠模型（patient-derived tumor xenograft,PDX），發(fā)現(xiàn)甲硝唑能夠顯著抑制具核梭桿菌的載量和腫瘤組織的生長(zhǎng)[8]。但由于甲硝唑除了能夠殺死具核梭桿菌還會(huì)殺死其他厭氧菌，因此研發(fā)具核梭桿菌特異的抗菌藥物將更具有臨床實(shí)用價(jià)值。除了直接以細(xì)菌作為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物研發(fā)，細(xì)菌調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生改變的信號(hào)通路也可以作為靶點(diǎn)。具核梭桿菌能夠激活結(jié)直腸癌細(xì)胞的TLR4/MyD88信號(hào)通路，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的自噬水平并抑制奧沙利鉑（oxaliplatin）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）誘導(dǎo)的促腫瘤細(xì)胞凋亡作用，從而引起腫瘤耐藥[11]。抑制具核梭桿菌引起結(jié)直腸癌細(xì)胞升高的自噬水平，也是增加結(jié)直腸癌化療敏感度的新策略之一。

除了作用于腫瘤細(xì)胞影響化療敏感度，一些微生物可以使化療藥物或其代謝產(chǎn)物的活性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致化療藥物的不良反應(yīng)增強(qiáng)。如伊立替康（irinotecan）是晚期結(jié)直腸癌患者常用的化療藥物，伊立替康會(huì)經(jīng)肝臟的羧酸酯酶（carboxylesterase）代謝成為抗腫瘤活性產(chǎn)物SN-38，而SN-38會(huì)被藥物代謝Ⅱ相反應(yīng)中的關(guān)鍵酶UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferase,UGT）代謝成為失活產(chǎn)物SN-38G，并通過(guò)膽汁分泌進(jìn)入腸道；而大腸桿菌產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase），可以催化腸道內(nèi)的失活產(chǎn)物SN-38G重新轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚援a(chǎn)物SN-38，從而引起嚴(yán)重腹瀉等不良反應(yīng)[10,31]。以β-葡萄糖醛酸苷酶作為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的小分子抑制劑，目前已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證明，其在不影響伊立替康抗腫瘤活性的同時(shí)能降低伊立替康導(dǎo)致的嚴(yán)重腹瀉等不良反應(yīng)[32]。

目前許多研究報(bào)道了某些特定微生物的促結(jié)直腸癌作用，而益生菌等微生物制劑能夠促進(jìn)腸道微生物恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，那么這些微生物制劑能否輔助結(jié)直腸癌的治療呢？Gao等報(bào)道，益生菌補(bǔ)充療法能夠改善結(jié)直腸癌患者腸道菌群的多樣性，并且能夠顯著降低促進(jìn)結(jié)直腸癌的梭桿菌屬細(xì)菌的豐度達(dá)5倍以上[33]；除此之外，益生菌還可以通過(guò)下調(diào)宿主細(xì)胞COX-2的表達(dá)水平，抑制腸道內(nèi)的免疫炎性反應(yīng)從而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生[34]。雖然目前關(guān)于益生菌等微生物制劑抑制結(jié)直腸癌的作用和分子機(jī)制已經(jīng)在細(xì)胞、動(dòng)物模型中取得很多研究進(jìn)展，但是未來(lái)仍然需要在人群中進(jìn)行大量的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)。傳統(tǒng)的微生物制劑成分較為單一，很多益生菌在患者腸道中無(wú)法長(zhǎng)期存活，而糞菌移植可以將健康人群的腸道菌群移植到患者的腸道中，其作為一項(xiàng)新興技術(shù)，已經(jīng)在炎性腸病等疾病中取得較多進(jìn)展[35]。但是，糞菌移植能否應(yīng)用于結(jié)直腸癌治療，目前還缺少臨床實(shí)踐的證據(jù)，并且對(duì)于供體的選擇、糞菌移植的時(shí)機(jī)等目前尚無(wú)定論，在將來(lái)這些可能是微生物用于結(jié)直腸癌治療的重點(diǎn)研究方向。

4 結(jié)論

綜上所述，微生物與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的密不可分，對(duì)于該領(lǐng)域的探索，有助于更好地認(rèn)識(shí)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，使早期干預(yù)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展成為可能；利用結(jié)直腸癌患者與健康人群之間的差異微生物，建立基于微生物標(biāo)志物的結(jié)直腸腫瘤早期篩查、診斷模型，有助于結(jié)直腸腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)；以微生物作為靶點(diǎn)研發(fā)藥物、恢復(fù)腸道微生物穩(wěn)態(tài)，可能在今后成為結(jié)直腸癌預(yù)防和治療的新策略。