樊煒靜，柳國斌

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 200032； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200032)

糖尿病難愈性創(chuàng)面是目前糖尿病較為常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致截肢的發(fā)生[1]。研究調(diào)查顯示有30%的糖尿病患者會繼發(fā)皮膚潰瘍，且80%以上的患者在創(chuàng)面愈合后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)[2-4]。周圍神經(jīng)病變、周圍血管病變和感染是糖尿病難愈性創(chuàng)面常見的危險因素。近年來，糖尿病難愈性創(chuàng)面的發(fā)生率明顯升高，不僅給許多患者和家庭帶來了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也給國家?guī)砹司揞~的醫(yī)療花費(fèi)[5-6]。

隨著臨床研究者和患者對健康的重視和對生活質(zhì)量要求的提高，糖尿病難愈性創(chuàng)面的治療已經(jīng)成為一項迫在眉睫的工作，而建立正確合理的動物模型有利于研究者對糖尿病難愈性創(chuàng)面進(jìn)行更加深入的研究，為疾病的治療、藥物的研發(fā)提供便利。目前已經(jīng)有較多類型的糖尿病難愈性創(chuàng)面動物模型被建立[7-8]。相對于兔、豬、狗等動物模型[9-10]，大鼠在研究中最容易獲得，易于飼養(yǎng)和管理。本文就國內(nèi)外學(xué)者對糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠實驗?zāi)Ｐ偷难芯窟M(jìn)行總結(jié)，歸納各模型的優(yōu)勢和不足，從而為后續(xù)研究者對糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠實驗?zāi)Ｐ偷难芯刻峁┧悸贰?/p>

1 糖尿病常規(guī)創(chuàng)面模型

糖尿病常規(guī)創(chuàng)面模型的構(gòu)建主要以臨床特征，即糖尿病場面外在形態(tài)的構(gòu)建為主，通常方法較為簡單，可復(fù)制性較強(qiáng)[11]。一般分為糖尿病模型的構(gòu)建和創(chuàng)面模型的構(gòu)建兩部分，其創(chuàng)面模型的構(gòu)建多為外部破壞，其用時較短，易于觀察，但與真實的糖尿病創(chuàng)面差距較大，在臨床中僅適合單一因素的觀察，應(yīng)用范圍較窄。

1.1 全層皮膚切除法

李友山等[12]使用高脂飼料聯(lián)合STZ方法建立2型糖尿病大鼠模型，在大鼠背部標(biāo)記創(chuàng)面面積后直接剪除標(biāo)記區(qū)域皮膚，深達(dá)筋膜，這種方法操作簡單，易于復(fù)制，創(chuàng)面面積可控，應(yīng)用最為廣泛。李巧芬等[13]使用Wistar大鼠注射STZ建立糖尿病大鼠模型，在大鼠背部使用打孔器打孔，深入筋膜層，3 d后創(chuàng)面出現(xiàn)肉芽生長視為建模成功。打孔器的使用使創(chuàng)面面積和創(chuàng)面深度的量化更為準(zhǔn)確。

1.2 低溫誘導(dǎo)法

任萍萍等[14]使用STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型建立慢性創(chuàng)面模型，使用冰塊模擬冬季環(huán)境，將大鼠放置于泡沫保鮮箱中，大鼠足部隔塑料板接觸冰袋，前三天使箱內(nèi)溫度保持在6 ℃，后7天保持在10 ℃左右，觀察大鼠足部變化，出現(xiàn)潰瘍即為造模成功。陳群力等[15]則采用控制室溫，逐漸降溫的方式制造大鼠皮膚創(chuàng)面。這種方法使用低溫誘導(dǎo)的方法造成大鼠足部缺血缺氧，繼而出現(xiàn)紅腫、出血、潰瘍，貼合糖尿病創(chuàng)面的臨床發(fā)展過程，但操作難度較大，大鼠死亡率較高，創(chuàng)面情況不可控，難以進(jìn)行實驗研究，臨床推廣性較低。

1.3 高溫燙傷法

TIAN等[16]使用STZ方法建立糖尿病大鼠模型，6周后將大鼠置于燙傷板，大鼠皮膚出現(xiàn)紅腫、滲出的創(chuàng)面則為造模成功。TAKHTFOOLADIM等[17]則利用電子燙傷儀對糖尿病大鼠進(jìn)行燙傷創(chuàng)面的造模，HE染色可觀察到深Ⅲ度燙傷則代表造模成功。黃仁燕等[18]使用恒溫恒壓燙傷儀進(jìn)行創(chuàng)面的造模，不僅糾正了之前燙傷方法造成的創(chuàng)面形狀、面積不固定的問題，也使得定量測評分析變得更方便。

2 糖尿病缺血性創(chuàng)面模型

糖尿病性周圍血管病變導(dǎo)致的組織缺氧、營養(yǎng)障礙是糖尿病創(chuàng)面出現(xiàn)的直接原因，對于缺血模型的建立主要有直接血管阻斷和間接壓迫兩種方式[19]，同時通過激光多普勒進(jìn)行下肢血流測定，對創(chuàng)面周圍缺血的狀態(tài)進(jìn)行評估和監(jiān)測，也使得缺血性創(chuàng)面模型的建立更加精準(zhǔn)。

2.1 皮膚磁片壓迫法

葛良鵬等[20]利用STZ誘導(dǎo)后的糖尿病大鼠模型，將磁片植入大鼠前肢皮下，將外源磁片放置于對應(yīng)位置皮外，利用磁片之間吸引力形成的壓力制造皮膚缺血，每次2 h后恢復(fù)血流30 min，循環(huán)4 d，以皮膚變黑變硬、針刺不出血為造模成功的標(biāo)志。這種方法建立的創(chuàng)面模型創(chuàng)面面積基本可控，與磁片面積保持一致，利于進(jìn)行定量分析，但皮下植入的操作易造成感染，一方面增加造模操作難度，另一方面有誘發(fā)感染性創(chuàng)面的風(fēng)險。DUSCHER等[21]對其方式進(jìn)行了改良，對糖尿病大鼠的背部皮膚進(jìn)行牽拉，將磁片放置于皮膚兩側(cè)，每天12 h連續(xù)壓迫，21 d內(nèi)通過觀察皮膚狀況確定造模是否成功。

2.2 動脈結(jié)扎離斷法

KIM等[22]將糖尿病大鼠的股動脈進(jìn)行結(jié)扎，并離斷遠(yuǎn)端所有分支動脈，成功建立糖尿病缺血性潰瘍模型，但這種方式造成的急性缺血與真實糖尿病創(chuàng)面的形成過程差異太大。李文惠等[23]對前人的方式進(jìn)行改良，使用STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，結(jié)扎離斷股動脈及其主要分支，保留部分側(cè)枝動脈供血，并使用SQL-5Q燙傷儀燙傷缺血下肢皮膚，一方面造成不完全缺血狀態(tài)模擬糖尿病創(chuàng)面缺血狀態(tài)，另一方面通過人為創(chuàng)面縮短造模時間。

3 糖尿病感染性創(chuàng)面模型

感染是糖尿病創(chuàng)面延期愈合的重要原因，目前糖尿病足潰瘍感染病原菌主要分為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌三大類，金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌分別是革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陰性球菌感染最多的菌種[24-27]，目前方法主要以創(chuàng)面菌株涂抹和皮下菌株注射為主。

3.1 大腸埃希菌感染的糖尿病創(chuàng)面模型

黃仁燕等[28]使用STZ誘導(dǎo)雄性SD大鼠糖尿病后，先使用恒溫恒壓燙傷儀在大鼠背部下端皮膚進(jìn)行接觸燙傷，以燙傷處出現(xiàn)紅腫、水泡為標(biāo)準(zhǔn)，HE染色可觀察到深度Ⅱ度燙傷代表糖尿病創(chuàng)面模型建模成功，48 h后在創(chuàng)面皮下注射大腸埃希菌懸液，48 h后取局部分泌物做菌培養(yǎng)，檢測出不耐藥細(xì)菌或機(jī)會感染菌即為造模成功。

3.2 金黃色葡萄球菌感染的糖尿病創(chuàng)面模型

韓強(qiáng)等[29]使用高脂飼料喂養(yǎng)雄性SD大鼠8周后，使用STZ誘導(dǎo)糖尿病，在大鼠背部下端皮膚使用恒溫恒壓燙傷儀建立體表燙傷模型，創(chuàng)面皮膚接種金黃色葡萄球菌懸液，48 h后創(chuàng)面分泌物菌培養(yǎng)中檢測出不耐藥細(xì)菌代表建模成功。這種高脂飼料聯(lián)合STZ方法建立的創(chuàng)面模型更大程度地模擬了2型糖尿病的發(fā)病過程，在一定程度上能夠避免單純由于STZ殺死胰島β細(xì)胞形成的1型糖尿病。

4 糖尿病神經(jīng)病變性創(chuàng)面模型

糖尿病性周圍神經(jīng)病變是糖尿病創(chuàng)面重要的誘發(fā)因素之一，自主神經(jīng)和感覺神經(jīng)的異常均可導(dǎo)致潰瘍的發(fā)生。目前糖尿病神經(jīng)病變性創(chuàng)面的模型較少，建立主要以神經(jīng)離斷的方式為主，JIN[30]和KALE等[31]通過手術(shù)分離并結(jié)扎坐骨神經(jīng)的方式構(gòu)建神經(jīng)病變的模型，7 d后大鼠出現(xiàn)自發(fā)性潰瘍。在理論狀態(tài)下這種方式首先通過大鼠較長時間高血糖狀態(tài)的保持以造成機(jī)體病理改變的發(fā)生，繼而通過神經(jīng)破壞加速病變，最終形成潰瘍，能夠較好模擬糖尿病潰瘍的發(fā)生發(fā)展過程。但該方式自發(fā)誘導(dǎo)創(chuàng)面出現(xiàn)的可能性較小，往往需要結(jié)合組織破壞的方式。

5 糖尿病慢性創(chuàng)面模型

創(chuàng)面延期愈合是糖尿病創(chuàng)面的重要臨床特點(diǎn)，如何能夠較好地模擬糖尿病創(chuàng)面的病理過程、構(gòu)建延期愈合的創(chuàng)面模型也是研究的難點(diǎn)之一，目前延期愈合模型構(gòu)建的方法以免疫抑制為主。彭艷等[32]使用STZ誘導(dǎo)Wistar大鼠構(gòu)建糖尿病模型后，通過射線照射的方法抑制大鼠的免疫功能，后結(jié)扎股動脈，觀察雙下肢皮膚，出現(xiàn)潰瘍則為造模成功。張東萍等[33]則通過對Wistar糖尿病大鼠腹腔注射3%的豬胃黏蛋白以降低大鼠機(jī)體的免疫力，延緩創(chuàng)面的愈合過程，相比其他方法更好地模擬了糖尿病免疫功能抑制狀態(tài)下多種病原微生物混合感染對糖尿病足發(fā)展的影響，更利于實驗的觀察。

6 糖尿病難愈性創(chuàng)面中醫(yī)藥實驗?zāi)Ｐ?/h2>

辨證論治是中醫(yī)治療的根本原則之一，癥候模型的建立對中醫(yī)基礎(chǔ)研究的發(fā)展有極大的推動作用。通過中醫(yī)理論在普通糖尿病慢性創(chuàng)面的基礎(chǔ)上從創(chuàng)面觀察和大鼠癥狀上構(gòu)建陽虛陰證模型，不論是從病理因素還是臨床特征，都更符合糖尿病難愈性創(chuàng)面的特點(diǎn)。但目前各類中醫(yī)證型糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠模型的構(gòu)建方式還存在一定問題，主要還是以自行激發(fā)為主，誘導(dǎo)的方式不足，部分證型大鼠模型造模成功率太低。

6.1 糖尿病難愈性創(chuàng)面陰證模型

李媛[34]、蒙玉嬌等[35]探索性使用STZ、皮膚缺損、激素干預(yù)、塑料環(huán)創(chuàng)面邊緣埋置等多因素復(fù)合的方法構(gòu)建糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面陰證模型，通過使用激素等方式使創(chuàng)面的狀態(tài)更接近臨床中難愈性創(chuàng)面的狀態(tài)、延緩創(chuàng)面愈合，大鼠出現(xiàn)蜷縮、尾冷、大便糖稀、創(chuàng)面分泌物多，滲液清稀，肉芽組織紅而不澤等整體或局部陽虛的表現(xiàn)，與臨床中糖尿病足潰瘍的表現(xiàn)相近。糖尿病難愈性創(chuàng)面在中醫(yī)屬于陰證的范疇，患有糖尿病難愈性創(chuàng)面的病人在全身癥狀和創(chuàng)面局部癥狀中均能見到陽虛的表現(xiàn)[36-38]。

6.2 腎陰虛型糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠模型

張紅英等[39]對SD大鼠禁食不禁水后12 h后注射STZ溶液和甲狀腺素構(gòu)建糖尿病大鼠模型，甲狀腺素用以加速陰虛癥候的發(fā)展，如大鼠cAMP/cGMP比值升高，空腹血糖值≥11.1 mmol/L，出現(xiàn)形體消瘦、體毛無光澤、活動增加、反應(yīng)遲鈍、肛門紅腫、大便干結(jié)色黑等癥狀則視為腎陰虛模型造模成功。

6.3 脾氣虛型糖尿病大鼠模型

顏剛等[40]在對SD大鼠注射STZ溶液后進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)，7 d后測空腹血糖，如大鼠同時出現(xiàn)倦怠、懶動、大便時軟時溏、游泳耐力下降、體毛光亮度減退，則視為脾氣虛型糖尿病大鼠模型成功。

6.4 陰虛內(nèi)熱型糖尿病大鼠模型

吳晏[41]和扶麗君等[42]則系統(tǒng)建立了糖尿病大鼠陰虛內(nèi)熱證型的行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，通過對高脂喂養(yǎng)和STZ誘導(dǎo)后SD大鼠的動物神態(tài)、行為、背部溫度、二便情況、舌、爪、活動狀態(tài)等方面綜合對糖尿病大鼠陰虛內(nèi)熱的表現(xiàn)進(jìn)行評估。通過癥狀學(xué)的判斷更加符合中醫(yī)診斷的過程，是目前最為常用且較為合理的方法，但缺乏可量化數(shù)據(jù)的支持。

6.5 陰虛血瘀型糖尿病大鼠模型

楊明華等[43]先使用高糖高脂的飼料使大鼠有血瘀型糖尿病的前期準(zhǔn)備，同時通過喂甲狀腺素片加速陰虛進(jìn)程，最后注射ALX，使大鼠同時具備胰島素抵抗和陰虛血瘀的特點(diǎn)，通過對大鼠飲水、被毛、體溫、環(huán)磷酸腺苷含量判斷大鼠的陰虛狀態(tài)，通過凝血時間、血液黏度、血漿NO含量等判斷大鼠的血瘀狀態(tài)，成功構(gòu)建陰虛血瘀型糖尿病大鼠模型。

7 討論與展望

目前糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠實驗?zāi)Ｐ偷慕⒕鶠槎嗖襟E進(jìn)行，糖尿病模型和皮膚創(chuàng)面模型的先后建立也符合疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程。糖尿病模型建立的方法眾多，基因敲除及轉(zhuǎn)基因動物模型發(fā)展迅速, 但因其價格高昂并不是研究者的首選。目前以STZ法誘導(dǎo)應(yīng)用最為廣泛，但通過高糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗后再注射 STZ 的方法，可以損傷胰島功能，引起血糖升高，更貼合2型糖尿病的發(fā)病過程。皮膚磁片壓迫法通過較長時間的壓力造成局部皮膚缺血缺氧，進(jìn)行形成皮膚壞死性創(chuàng)面，燙傷法建立的糖尿病創(chuàng)面同樣屬于慢性創(chuàng)面，同樣具有延期愈合的特點(diǎn)。相比之下，動脈結(jié)扎離斷法建立的急性缺血模型與糖尿病創(chuàng)面的缺血病理過程并不一致。細(xì)菌原株種植的方式構(gòu)建糖尿病感染性創(chuàng)面模型，在操作上相對簡單，但有研究表明，傷口細(xì)菌感染對創(chuàng)面組織有雙重作用，大量重度感染能夠延緩創(chuàng)面愈合，少量輕度感染則可以加快創(chuàng)面愈合，因此可控性較低，在未來的研究中應(yīng)對創(chuàng)面面積和細(xì)菌種植濃度的比例進(jìn)行量化。

在糖尿病動物皮膚創(chuàng)面模型建立后, 還要保證其慢性難愈性等病理特征是較為困難的，也是目前糖尿病創(chuàng)面模型進(jìn)一步提高的核心問題。在糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠實驗?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建中使用激素是目前較為流行的方式，一方面可以維持組織的低免疫狀態(tài)，另一方面可以起到延緩創(chuàng)面愈合，構(gòu)建慢性創(chuàng)面的作用。但慢性難愈性創(chuàng)面的構(gòu)建仍存在許多難以模擬的因素，如老齡化等，慢性創(chuàng)面的愈合速度與年齡之間的關(guān)系已經(jīng)被證實，未來老齡化大鼠的培育相信會給相關(guān)模型的建立帶來新的可能。

當(dāng)前階段糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠模型的制備主要以模擬各類病理因素和臨床特征，但僅僅是簡單的疊加，而非病理過程的自然轉(zhuǎn)化，創(chuàng)面的形成也多由外部破壞，而非自發(fā)性形成潰瘍，這些都是需要在未來解決的問題。糖尿病難愈性創(chuàng)面的病理過程是復(fù)雜的，疾病發(fā)展過程中的表現(xiàn)多樣，構(gòu)建正確合理的大鼠模型需要考慮諸多因素。單因素的模型制備相對簡單，但與人類糖尿病難愈性創(chuàng)面的真實表現(xiàn)有較大差異，因此多因素模型的制備應(yīng)該是未來發(fā)展的趨勢。而目前多因素模型多為病理因素結(jié)合臨床特征兩方面進(jìn)行制備。對于臨床特征的觀察，中醫(yī)往往有更為細(xì)致的觀察和獨(dú)特的角度，中西醫(yī)結(jié)合的思路，不僅能準(zhǔn)確把握糖尿病難愈性創(chuàng)面“病”的特點(diǎn)，也能綜合糖尿病難愈性創(chuàng)面“證”的因素，可以最大程度模擬糖尿病難愈性創(chuàng)面的疾病特點(diǎn)，滿足各類實驗的要求。