嚴(yán)忠雍，曾軍杰，龍 舉，方 益，陳 思*

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021;2.浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316021)

短裸甲藻毒素(Brevetoxin，BTX)是由反式聚合醚環(huán)構(gòu)成的親脂性藻類毒素，也稱神經(jīng)性貝類毒素，主要由短裸甲藻及裸甲藻屬部分藻類產(chǎn)生的赤潮藻毒素[1-3]。短裸甲藻毒素不僅污染海洋水體環(huán)境，還會(huì)造成海洋魚類死亡，從而帶來嚴(yán)重的海洋經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。此外，短裸甲藻毒素亦能霧化在波浪形成的氣溶膠中，人接觸或吸入后會(huì)刺激皮膚，甚至引起膜炎、鼻漏、支氣管收縮等呼吸系統(tǒng)癥狀[6-11]。目前，國(guó)內(nèi)外尚未有海水中短裸甲藻毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)規(guī)定。美國(guó)通過監(jiān)控短裸甲藻的細(xì)胞密度以預(yù)防短裸甲藻毒素的大規(guī)模爆發(fā)入侵：即每升海水中短裸甲藻的細(xì)胞數(shù)量≥5 000個(gè)時(shí)，禁止在受污染的相關(guān)海域捕撈貝類[12]。海水中短裸甲藻毒素限量標(biāo)準(zhǔn)的缺乏以及以藻細(xì)胞密度衡量污染狀況的規(guī)定，導(dǎo)致現(xiàn)有文獻(xiàn)多以短裸甲藻細(xì)胞密度為分析點(diǎn)，間接評(píng)價(jià)海水中短裸甲藻毒素的安全風(fēng)險(xiǎn)水平[13]。

海水分析通常采用固相萃取和液液萃取提取凈化目標(biāo)物，但考慮到固相萃取成本較高，故本研究基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，結(jié)合海水的基質(zhì)特征，選擇液液萃取作為前處理方法。通過篩選合適的提取試劑，對(duì)提取體積、旋渦時(shí)間、提取次數(shù)、鹽析劑等參數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析；并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，確定海水中短裸甲藻毒素的最佳提取條件；最后通過回收率、精密度、定量下限等指標(biāo)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，建立了適用于海水中短裸甲藻毒素的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTMI-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；Avanti JXN-30高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司);MS3 Control旋渦混勻器(德國(guó)IKA公司);VSD150氮吹儀(無錫沃信儀器制造有限公司)；FG2-B便攜式 pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司)；AZ8371便攜式鹽度計(jì)(臺(tái)灣衡欣儀器儀表有限公司)。

BTX-1、BTX-2、BTX-3短裸甲藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品均為100 μg(臺(tái)灣Algalchem公司)；乙酸銨、甲酸(色譜純，美國(guó)Sigma公司)；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、三氯甲烷(色譜純，德國(guó)Merck公司)；氯化鈉、氨水、乙酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為經(jīng)Millipore系統(tǒng)處理的超純水。

1.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)樣品前處理

移取經(jīng)0.45 μm玻璃微纖維濾紙過濾的20 mL海水至50 mL離心管，加入100 μL 100 ng/mL的BTX混合標(biāo)準(zhǔn)工作液、鹽析劑和提取試劑后，旋渦混合，6 000 r/min離心5 min，將有機(jī)層轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，再?gòu)?fù)提取，合并上清液后于40 ℃水浴條件下氮?dú)獯蹈?；加? mL乙腈，旋渦混合60 s，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾后，供LC-MS/MS分析。

1.3 樣品前處理方法

移取20 mL經(jīng)0.45 μm玻璃微纖維濾紙過濾的海水樣品至50 mL離心管中，加入6 g氯化鈉旋渦混合90 s，再加入5 mL乙酸乙酯，旋渦振蕩60 s后，6 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中；加入5 mL乙酸乙酯再提取1次，合并上清液后于40 ℃水浴條件下氮?dú)獯蹈?；加? mL乙腈，旋渦混合60 s，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾后，供LC-MS/MS分析。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：ACQUITYTMUPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；進(jìn)樣體積5 μL；樣品室溫度10 ℃；柱溫35 ℃；流速0.2 mL/min；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫：0～1.0 min，50% A；1.0～2.0 min，50%～65%A；2.0～9.0 min，65% A；9.0～9.5 min，65%～50%A；9.5～11 min，50% A。

電噴霧離子源，正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；離子源溫度：130 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；錐孔氣流量：200 L/h；脫溶劑氣流量：800 L/h；短裸甲藻毒素的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 3種短裸甲藻毒素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of three BTXs

*quantitative ion

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理；采用Design expert 8.0響應(yīng)面軟件進(jìn)行模型方程擬合和多元回歸分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 海水體積的確定

Pierce等[14]對(duì)海水中短裸甲藻毒素的含量(BTX-1、BTX-2、BTX-3的總和)與短裸甲藻的細(xì)胞密度之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)單個(gè)藻細(xì)胞的毒力水平為14～323 pg，5 000個(gè)細(xì)胞的毒力水平為70～1 615 ng，即常規(guī)海水中的短裸甲藻毒素含量應(yīng)小于0.07 μg/L。結(jié)合儀器靈敏度，計(jì)算得到海水定量分析所需的體積約為15 mL；考慮到方法前處理的損失和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的偏差，將海水體積確定為20 mL。相較于傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)法[12]，這不僅減少了海水分析所需體積，降低了耗材試劑量；同時(shí)也能滿足海水定量分析的需要，從而有效評(píng)估短裸甲藻毒素的安全風(fēng)險(xiǎn)水平。

2.2 提取試劑對(duì)萃取的影響

短裸甲藻毒素屬脂溶性聚醚類藻毒素，且樣品基質(zhì)是海水，應(yīng)優(yōu)先考慮能與水分層的有機(jī)試劑，以便于分離移取提取試劑，縮短前處理時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。因此，實(shí)驗(yàn)分別選擇乙酸乙酯、三氯甲烷、正己烷3種常用色譜提取有機(jī)溶劑，比較其對(duì)海水中BTX萃取效率的影響。結(jié)果顯示，正己烷的萃取效率最低(48%～62%)，三氯甲烷的萃取效率為71%～75%，但其易氧化，屬2B類致癌物，且離心后在水層之下不易移取；而乙酸乙酯的萃取效率為74%～79%，低毒且易移取，便于操作。故本實(shí)驗(yàn)選擇乙酸乙酯為最佳提取試劑。

2.3 提取體積對(duì)萃取的影響

乙酸乙酯微溶于水，過低的提取體積會(huì)導(dǎo)致無法收集有效有機(jī)層；而過高的提取體積則加大了試劑量，延長(zhǎng)了濃縮時(shí)間，降低了實(shí)驗(yàn)效率。結(jié)合液液萃取少量多次的原則，本實(shí)驗(yàn)選擇3、4、5、6 mL乙酸乙酯提取兩次。結(jié)果顯示(以3種BTX總量計(jì))，3 mL的乙酸乙酯由于第一次提取時(shí)體積較少，部分乙酸乙酯溶至水中，導(dǎo)致萃取率較低(為78%)；4、5、6 mL乙酸乙酯的萃取率分別為88%、90%、91%，3種提取體積的萃取率差異不大。出于降低試劑量，縮短前處理時(shí)間的考慮,最終選擇用乙酸乙酯提取兩次，每次5 mL。

圖1 氯化鈉質(zhì)量對(duì)3種短裸甲藻毒素萃取率的影響Fig.1 Effect of NaCl amount on extraction efficiencies of three BTXs

2.4 鹽析劑對(duì)萃取的影響

在萃取過程中，常加入溶于水相但不被萃取的無機(jī)鹽作為鹽析劑，以吸引一部分自由水分子，減少水溶液中自由水分子的量，降低被萃取物和提取溶液在水中的溶解度，從而提高萃取效率[15]。實(shí)驗(yàn)選擇氯化鈉為鹽析劑，分別加入0、1、2、3、4、5、6、7 g(因7 g氯化鈉在20 mL海水中已飽和，故未再往上增加量)，考察了不同質(zhì)量鹽析劑對(duì)短裸甲藻毒素萃取效率的影響。結(jié)果如圖1所示，當(dāng)氯化鈉的質(zhì)量為6 g時(shí)，萃取率達(dá)到最高；而其它質(zhì)量對(duì)應(yīng)的萃取率由于水合作用不充分或溶液體系失衡等原因未能達(dá)到最佳值，故選擇6 g氯化鈉為最佳鹽析劑的用量。

2.5 旋渦時(shí)間對(duì)萃取的影響

液液萃取通常需要萃取劑與被萃取溶劑長(zhǎng)時(shí)間混勻振蕩，從而充分提取被萃取溶劑中的目標(biāo)化合物。由于海水體積較少，無需采用分液漏斗，故使用50 mL離心管即可，并選擇色譜前處理常用的旋渦混勻器充分提取海水中的短裸甲藻毒素。實(shí)驗(yàn)分別旋渦混合30、60、90、120 s，考察了不同旋渦時(shí)間對(duì)3種短裸甲藻毒素萃取效率的影響。結(jié)果顯示，3種短裸甲藻毒素在30 s旋渦時(shí)間時(shí)的萃取效率較低，而在60、90、120 s時(shí)的萃取效率相近；考慮到90 s和120 s的旋渦時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，延長(zhǎng)了前處理時(shí)間、降低了實(shí)驗(yàn)效率，最終選擇最佳旋渦時(shí)間為60 s。

表2 海水中BTX萃取條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的因素水平表Table 2 Factors and level for optimizing the extraction conditions of BTX in seawater

表3 響應(yīng)面分析方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface analysis scheme and experimental results

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過上述單因素?cái)?shù)據(jù)分析，可知海水中短裸甲藻毒素的最佳萃取條件為：以乙酸乙酯提取2次，每次5 mL，加6 g氯化鈉作為鹽析劑，每次萃取旋渦時(shí)間為60 s。為達(dá)到更好的萃取效率，精準(zhǔn)量化多因素的影響水平，根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取提取體積(A)、氯化鈉質(zhì)量(B)、旋渦時(shí)間(C)為考察變量，以3種 短裸甲藻毒素(以3種BTX總量計(jì))的萃取效率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析方法。每個(gè)變量因素的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。采用Design expert.8.0響應(yīng)面軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。序號(hào)3、6、10、11和13為中心試驗(yàn)，其它序號(hào)為析因試驗(yàn)，16個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為零點(diǎn)和析因點(diǎn)，零點(diǎn)為中心點(diǎn)，試驗(yàn)重復(fù)4次，用以評(píng)估誤差。得到二次多項(xiàng)回歸模型方程為：萃取率=99.82+1.34A+0.76B+2.25C+0.32A×B+0.90A×C+0.20B×C-1.92A2-2.72B2-1.90C2。

中心組合設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果如表4所示，該模型F值為7.87，P值為0.006 3(小于0.05)，具有顯著性；失擬項(xiàng)F值為0.31，P值為0.820 7(大于0.05)，不具顯著性，表明該模型能與實(shí)驗(yàn)良好擬合，實(shí)驗(yàn)誤差較小。決定系數(shù)(R2)為0.910 0，反應(yīng)預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)測(cè)定值具有良好的相關(guān)性，表明該模型能代表實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可對(duì)海水中BTX含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由模型計(jì)算可知，在單因素條件下A、C對(duì)萃取率有顯著性影響(P小于0.05)，B對(duì)其影響不顯著，A2、B2、C2對(duì)萃取率的影響顯著。通過比較A、B、C的F值可知，旋渦時(shí)間對(duì)萃取率的影響最大，其次是提取體積，而氯化鈉質(zhì)量的影響最小。

表4 回歸分析結(jié)果Table 4 Regression analysis results

圖2 響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface plots of extractionⅠ.amount of NaCl and extraction solvent volume；Ⅱ.Vortex time and extraction solvent volume；Ⅲ.Vortex time and amount of NaCl

對(duì)A、B、C 3個(gè)因素進(jìn)行兩兩交互作用分析，以任意兩個(gè)因素為研究因子，萃取率為因變量，繪制響應(yīng)曲面圖，見圖2(Ⅰ～Ⅲ)。3張響應(yīng)面分析圖均呈山丘形曲面，存在極大值，經(jīng)響應(yīng)面模擬分析可得最佳萃取條件為：提取體積5.07 mL，氯化鈉質(zhì)量6.07 g，旋渦時(shí)間60.72 s；但考慮到實(shí)際操作和實(shí)驗(yàn)效率，將萃取條件調(diào)整如下：提取體積5 mL，氯化鈉質(zhì)量6 g，旋渦時(shí)間60 s。為進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面法的可靠性，采用上述條件對(duì)海水中3種短裸甲藻毒素進(jìn)行萃取，實(shí)際測(cè)定的萃取率與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為1.6%。表明響應(yīng)面法能有效反映各因素對(duì)萃取率的影響程度，并精確預(yù)測(cè)趨勢(shì)理論值，因此采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的海水中短裸甲藻毒素萃取率的參數(shù)穩(wěn)定可靠，具有實(shí)際使用價(jià)值。

2.7 方法學(xué)評(píng)價(jià)

分別移取100 μg/L BTX混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.01、0.05、0.1、0.2 mL，1 mg/L BTX混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.05、0.2 mL，配制質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、50、200 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以BTX的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，3種BTX在1～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.996。根據(jù)20 mL的海水體積，結(jié)合3倍和10倍信噪比，得到本方法中3種BTX的檢出限均為0.02 μg/L，定量下限均為0.05 μg/L。

采用陰性海水加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)考察本方法的準(zhǔn)確度和精密度，即在20 mL陰性海水樣品中添加3種BTX混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其加標(biāo)濃度分別為0.1、0.3、1.0 μg/L，每個(gè)濃度水平重復(fù)6次，連續(xù)測(cè)定3天，依次計(jì)算回收率、日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)及日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表5。在0.1、0.3、1.0 μg/L 3個(gè)加標(biāo)濃度水平下，3種BTX的回收率為95.4%～104%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～5.3%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～4.5%，表明方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表5 海水中BTX的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 Average recoveries and RSDs for BTX in seawater

2.8 實(shí)際樣品的分析

應(yīng)用基于液液萃取的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，對(duì)浙江省沿岸共計(jì)20 份海水樣品進(jìn)行前處理與檢測(cè)。以本方法檢出限(0.02 μg/L)為依據(jù)，判定檢測(cè)樣品是否含有短裸甲藻毒素。結(jié)果顯示，樣品均未檢出BTX，表明常規(guī)海水是相對(duì)安全的，未受短裸甲藻毒素污染。本研究通過實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)短裸甲藻(Kareniabrevis)的方式，測(cè)定其培養(yǎng)海水中3種短裸甲藻毒素的含量，進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的時(shí)效性。結(jié)果顯示，海水中未檢出BTX-1，檢出BTX-2質(zhì)量濃度為38 μg/L，BTX-3為56 μg/L；表明方法能有效測(cè)定海水中短裸甲藻毒素。

3 結(jié) 論

本方法基于液液萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量分析海水中3種短裸甲藻毒素。利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度，將海水分析體積減至20 mL,通過響應(yīng)面優(yōu)化確定了海水中短裸甲藻毒素的最佳提取條件。方法降低了樣品分析體積，提高了前處理效率，且時(shí)效性和適用性強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)污染海水中短裸甲藻毒素的高效率痕量分析。