李皓洲，郝旭昇，郭嘉璐，郭 都，鄭曉營，王 碩，楊焯凱，石 超

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

阪崎克羅諾腸桿菌（Cronobacter sakazakii）是克羅諾桿菌屬中的一種具有鞭毛、兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，廣泛存在于嬰幼兒奶粉、嬰幼兒米粉、水果、蔬菜等食品中[1]，有極強(qiáng)的致病性。人體感染阪崎克羅諾腸桿菌后，會(huì)出現(xiàn)腦膜炎、菌血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎等多種疾病，致死率最高可達(dá)80%[2]。同時(shí)，阪崎克羅諾腸桿菌感染性疾病即使被治愈，近20%的感染病例都會(huì)伴有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括腦膿腫、神經(jīng)發(fā)育遲緩、腦積水和四肢癱瘓等[3]。國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)把阪崎腸桿菌描述為“對(duì)特定人群造成嚴(yán)重危害，危及生命或引起長期慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥的病原菌”[4]。

阪崎克羅諾腸桿菌的致病性與其運(yùn)動(dòng)能力、形成生物被膜、黏附及侵入腸上皮細(xì)胞等毒力因子密切相關(guān)[5]。阪崎克羅諾腸桿菌具有良好的運(yùn)動(dòng)能力，這有助于菌體感知外界環(huán)境刺激的變化而確定感染宿主細(xì)胞的位點(diǎn)，從而增強(qiáng)菌體對(duì)宿主的侵染，并且阪崎腸桿菌的運(yùn)動(dòng)能力有助于菌體自身生物被膜的形成[6]；阪崎克羅諾腸桿菌能在不銹鋼、塑料、玻璃、乳膠、硅膠等材料表面形成生物被膜[7-8]，從而提高細(xì)菌對(duì)洗滌劑、生物抑殺劑、抗生素和宿主防御系統(tǒng)的耐受能力，增強(qiáng)菌體的致病風(fēng)險(xiǎn)[9-10]；并且，阪崎克羅諾腸桿菌能夠黏附及侵入人體腸上皮細(xì)胞，這是菌體引發(fā)腦膜炎、菌血癥、敗血癥等感染性疾病的必要途徑[11]。

抗生素是治療細(xì)菌感染性疾病的傳統(tǒng)方法，其主要是通過干擾微生物生長過程中的關(guān)鍵步驟，如細(xì)胞壁合成、DNA復(fù)制和蛋白合成等[12]，從而抑制微生物生長；雖然這種方式非常有效，但也給細(xì)菌帶來選擇性壓力，從而使耐藥菌株被篩選出并成為優(yōu)勢(shì)群體。而毒力因子不是細(xì)菌存活必需的因素，對(duì)細(xì)菌并不會(huì)構(gòu)成進(jìn)化上的壓力，因而不易產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。與抗生素相比，某些植物源活性物質(zhì)在不干擾細(xì)菌正常生長的情況下通過抑制細(xì)菌毒力因子進(jìn)而降低致病菌的致病能力成為一種新型而有效的抗感染方式[12-13]。原兒茶醛（C7H6O3，CAS：139-85-5）是一種從烏蕨中提取的，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化[14]、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[15]、防止肝纖維素化[16]、抗病毒[17]等多種生物活性的植物源活性物質(zhì)。已有研究表明，原兒茶醛能夠?qū)嫫榭肆_諾腸桿菌產(chǎn)生抑制作用，影響其正常生長，使細(xì)菌形態(tài)干癟皺縮，出現(xiàn)畸形，破壞菌體細(xì)胞膜完整性，降低細(xì)菌胞內(nèi)ATP濃度[18]。但目前原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌毒力因子的影響鮮有研究，作用機(jī)制也尚不明確。

本研究旨在探究原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌毒力因子的抑制作用及其可能的作用機(jī)制。首先測(cè)定原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentrations，MIC）和最小殺菌濃度（minimal bactericidal concentrations，MBC），并確定亞抑制濃度（sub-inhibitory concentration，SIC）；其次，使用SIC的原兒茶醛處理阪崎克羅諾腸桿菌，檢測(cè)原兒茶醛對(duì)菌體泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成能力和黏附及侵入Caco-2細(xì)胞能力的影響；最后，通過反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription quantitative realtime polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌毒力基因轉(zhuǎn)錄過程的影響。研究旨在為原兒茶醛能夠成為降低阪崎腸桿菌致病風(fēng)險(xiǎn)的抗感染物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

阪崎克羅諾腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29544和ATCC29004購買于美國模式培養(yǎng)物寄存庫；阪崎克羅諾腸桿菌菌株6-16(1)、18-24(2)、11-18(2)和12-13(2)由Li Zhen等[19]從市面銷售的嬰幼兒配方奶粉及米粉中分離得到。Caco-2細(xì)胞（人克隆結(jié)腸腺癌上皮細(xì)胞）購于武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心。

原兒茶醛（高效液相色譜級(jí)，純度99.88%） 成都曼思特生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、二水合磷酸氫二鈉、結(jié)晶紫、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；RNA提取試劑盒 北京天根生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMII 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM 美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素 上海碧云天生物技術(shù)公司；慶大霉素 美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國HyClone公司。

表1 RT-qPCR所用的引物信息Table 1 Information on primers used for reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction

選取ESA_04030作為內(nèi)參基因[20]及與阪崎克羅諾腸桿菌運(yùn)動(dòng)性、生物被膜及黏附與侵入腸上皮細(xì)胞有關(guān)的9 種毒力基因[20-21]進(jìn)行RT-qPCR，基因引物及功能見表1。

1.2 儀器與設(shè)備

5840R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Model 680酶標(biāo)儀、iQ5 qPCR儀 美國Bio-Rad公司；GHX-9050B-2細(xì)菌培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HF90細(xì)胞培養(yǎng)箱 上海力申科學(xué)儀器有限公司；JS680B凝膠成像系統(tǒng) 上海培清科技有限公司；Nano-200超微量核酸分析儀 杭州奧盛儀器有限公司；KB-900脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；微生物全自動(dòng)生長曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司。

1.3 方法

1.3.1 阪崎克羅諾腸桿菌菌懸液制備

將凍存于-80 ℃冰箱中的阪崎克羅諾腸桿菌于胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）平板上活化（37 ℃、12 h），隨后挑取單菌落于胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soya broth，TSB）培養(yǎng)液中并置于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)8 h（130 r/min），使菌體處于對(duì)數(shù)生長期。使用pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）清洗并懸浮菌體，最后使用TSB調(diào)整菌懸液，使菌體濃度約為108CFU/mL，備用。

1.3.2 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌MIC和MBC的測(cè)定

MIC的測(cè)定參照Wiegand等[22]采用的液體稀釋法，并略有修改。具體如下：利用等倍稀釋法配制原兒茶醛質(zhì)量濃度分別為0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL的TSB溶液，并將其按照質(zhì)量濃度梯度從高到低的順序加入至96 孔板中（每孔100 μL）。將1.3.1節(jié)中菌懸液稀釋400 倍至菌體濃度為5×105CFU/mL，隨后加入100 μL至各小孔中混勻（最終菌體濃度為2.5×105CFU/mL），實(shí)驗(yàn)設(shè)置TSB含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，DMSO作為空白對(duì)照組用以校正溶劑光密度。隨即將96 孔板放入酶標(biāo)儀中測(cè)定630 nm波長處光密度，于37 ℃培養(yǎng)24 h后取出再次測(cè)定。經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，光密度變化小于0.05所對(duì)應(yīng)的原兒茶醛的最小質(zhì)量濃度即為MIC。將高于或等于MIC且能夠使菌體濃度降低3 個(gè)對(duì)數(shù)值的原兒茶醛的最小質(zhì)量濃度定為MBC[23]。

1.3.3 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌SIC的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)選用阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544進(jìn)行后續(xù)研究。參照Li Guanghui等[24]的方法，將1.3.1節(jié)中制備的菌懸液加入至百孔蜂窩板中（每孔125 μL）。隨后，每孔加入125 μL使用TSB（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% DMSO）溶解的原兒茶醛溶液，使原兒茶醛質(zhì)量濃度分別為MIC、1/2、1/4、1/5、1/10、1/20、1/40、1/50、1/100 MIC和1/200 MIC。實(shí)驗(yàn)設(shè)置不含原兒茶醛的菌懸液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% DMSO）作為陰性對(duì)照組，設(shè)置TSB肉湯（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% DMSO）作為空白對(duì)照組，每組設(shè)置4 個(gè)平行。同時(shí)，于百孔蜂窩板周圍加入無菌水以保證樣品濕度。最后，將樣品置于全自動(dòng)生長曲線分析儀，于37 ℃條件下每隔1 h測(cè)定24 h內(nèi)各孔光密度值并繪制生長曲線，最終選擇低于MIC且對(duì)細(xì)菌生長無明顯抑制作用的原兒茶醛質(zhì)量濃度為SIC。

1.3.4 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)能力的影響

泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)參照Di Bonaventura等[25]采用的軟瓊脂平板法。首先，按照營養(yǎng)配方制備泳動(dòng)營養(yǎng)平板，具體如下：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%瓊脂、25 g/L的LB肉湯加水溶解后于121 ℃下高壓蒸汽滅菌。待培養(yǎng)基溫度降至50 ℃左右時(shí)加入原兒茶醛使其質(zhì)量濃度分別為1/50、1/100 MIC和1/200 MIC，同時(shí)設(shè)置不含原兒茶醛組進(jìn)行對(duì)照。泳動(dòng)營養(yǎng)平板冷卻30 min后，取5 μL 1.3.1節(jié)中制備的菌液于平板中央，37 ℃培養(yǎng)10 h后取出平板。使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并計(jì)算泳動(dòng)圈直徑。

1.3.5 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜形成能力的影響

原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌生物被膜形成能力影響的測(cè)定參照Du Wenfang等[26]的方法，具體方法如下：按照前述1.3.1節(jié)中方法制備菌懸液并調(diào)整OD600nm＝1（菌懸液濃度約為109CFU/mL）。隨后，配制質(zhì)量濃度分別為0、1/50、1/100、1/200 MIC的原兒茶醛-菌液混合液，設(shè)置不含菌液和原兒茶醛的TSB為空白對(duì)照組（每孔250 μL），并于12 ℃和25 ℃下分別培養(yǎng)24、48、72 h。在24、48、72 h后測(cè)定各孔在630 nm波長處的光密度，吸出菌液后使用無菌水漂洗一次，烘干后依次使用1 g/100 mL結(jié)晶紫溶液染色、無菌水漂洗及體積分?jǐn)?shù)33%冰乙酸溶解生物被膜-結(jié)晶紫復(fù)合體。最后，測(cè)定每孔在570 nm波長處光密度，使用生物被膜形成指數(shù)（specific biofilm formation，SBF）表征不同質(zhì)量濃度原兒茶醛作用下的生物被膜形成能力，SBF按下式計(jì)算。

1.3.6 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌黏附及侵入Caco-2細(xì)胞影響的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)參照Shi Chao等[27]方法，并略有修改。首先，將濃度為1×105cells/mL并處于對(duì)數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中恒溫培養(yǎng)18 h，使用無菌PBS輕柔清洗3 次。取1.3.1節(jié)中菌懸液，并添加原兒茶醛溶液，使原兒茶醛的質(zhì)量濃度分別為0、1/50、1/100、1/200 MIC，將樣品置于37 ℃恒溫?fù)u床（100 r/min）培養(yǎng)6 h。取出樣品進(jìn)行離心（5 000×g、5 min、4 ℃），使用10% FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋菌體濃度至106CFU/mL。向預(yù)先培養(yǎng)的細(xì)胞中每孔分別加入1 mL菌懸液后離心（600×g、5 min），隨后將樣品放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)1 h。

在黏附實(shí)驗(yàn)中，于1 h后取出樣品并吸取孔板內(nèi)液體，使用無菌PBS清洗細(xì)胞3 次。向每孔中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100，置于4 ℃下處理20 min后使細(xì)胞裂解，使用無菌PBS以10 倍梯度稀釋后進(jìn)行涂布，于37 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)算黏附Caco-2細(xì)胞的菌體數(shù)量，以各質(zhì)量濃度原兒茶醛作用菌體黏附細(xì)胞的細(xì)菌總數(shù)/對(duì)照組細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

在侵入實(shí)驗(yàn)中，于1 h后取出樣品并吸取孔內(nèi)液體，使用無菌PBS清洗細(xì)胞一次。向每孔中加入1 mL含有100 μL/mL慶大霉素的1% FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)30 min。隨后吸取孔中液體使用無菌PBS清洗3 次，向每孔中加入0.1% Triton X-100并置于4 ℃下作用20 min以裂解細(xì)胞。最后，使用無菌PBS以10 倍梯度稀釋進(jìn)行涂布，37 ℃下培養(yǎng)24 h后計(jì)算侵入Caco-2細(xì)胞的菌體數(shù)量，以各質(zhì)量濃度原兒茶醛作用菌體侵入細(xì)胞的細(xì)菌總數(shù)/對(duì)照組細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.7 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌毒力基因轉(zhuǎn)錄的影響

本實(shí)驗(yàn)參照韓淇安等[28]方法，并略有修改。按照前述1.3.1節(jié)中方法制備菌懸液。相同體積菌懸液中分別加入不同質(zhì)量濃度的原兒茶醛溶液使原兒茶醛終質(zhì)量濃度為1/50 MIC和1/100 MIC，將樣品于37 ℃下?lián)u床（130 r/min）培養(yǎng)8 h后進(jìn)行細(xì)菌RNA的提取。分別取1 mL原兒茶醛作用后的菌懸液于1.5 mL無酶離心管中離心（12 000 r/min、2 min），重復(fù)兩次，棄上清液，依據(jù)細(xì)菌RNA提取試劑盒Bacteria Kit RNAprep Pure說明書操作進(jìn)行細(xì)菌RNA的提取。使用PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒將菌體RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。按照熒光定量試劑盒配制PCR體系，反應(yīng)總體積為25 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMII 12.5 μL、cDNA 2.0 μL、滅菌水8.5 μL，上、下游引物（10 μmol）各1.0 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃ 30 s，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，71 個(gè)循環(huán)。采用2－ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[29]，評(píng)估相關(guān)毒力基因的轉(zhuǎn)錄量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理使用SPSS軟件。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n＝3），采用Duncan's ANOVA對(duì)結(jié)果間的顯著性進(jìn)行比較。平均值間差異若達(dá)到P≤0.05則認(rèn)為顯著，P≤0.01則認(rèn)為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌MIC及MBC的測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)選取兩株標(biāo)準(zhǔn)菌株及4 株嬰幼兒配方米粉和奶粉中的分離菌用于測(cè)定原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌MIC和MBC。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表2），原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌有著良好的抑菌和殺菌效果，對(duì)6 株實(shí)驗(yàn)菌株的MIC和MBC均為2 mg/mL。

阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544常用于菌體毒力因子的研究，且具有本研究所探究的毒力因子表型和基因?qū)W特征[27]，因此選擇ATCC29544作為后續(xù)研究對(duì)象。

表2 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的MIC和MBCTable 2 MIC and MBC of PA against C. sakazakii

2.2 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌SIC的測(cè)定結(jié)果

本研究通過測(cè)定原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌生長曲線的影響確定SIC，結(jié)果如圖1所示，原兒茶醛質(zhì)量濃度為MIC時(shí)，菌體生長完全受到抑制；原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/2 MIC和1/4 MIC時(shí)，細(xì)菌延滯期明顯增長，并呈現(xiàn)濃度依賴性；原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/50 、1/100、1/200 MIC時(shí)，菌體生長狀況與對(duì)照組幾乎無明顯差異，該質(zhì)量濃度下細(xì)菌可正常生長和繁殖。因此，選擇1/50、1/100 MIC和1/200 MIC為研究所用的SIC。

圖1 不同質(zhì)量濃度原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544生長曲線的影響Fig. 1 Effect of PA on the growth curve of C. sakazakii ATCC29544

2.3 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544泳動(dòng)能力的影響

由圖2可知，阪崎克羅諾腸桿菌具有較強(qiáng)的泳動(dòng)能力，但在泳動(dòng)瓊脂平板中添加1/100 MIC和1/50 MIC的原兒茶醛后，阪崎克羅諾腸桿菌的泳動(dòng)能力極顯著降低（P＜0.01），泳動(dòng)圈直徑分別為對(duì)照組的88.2%和83.8%。對(duì)照組的泳動(dòng)圈面積為36.32 cm2，經(jīng)質(zhì)量濃度為1/100 MIC和1/50 MIC原兒茶醛處理的阪崎克羅諾腸桿菌的泳動(dòng)圈面積分別為28.27 cm2和25.52 cm2；而1/200 MIC原兒茶醛能顯著降低阪崎克羅諾腸桿菌的泳動(dòng)圈直徑至對(duì)照組的92.6%（P＜0.05），其泳動(dòng)圈的面積為31.17 cm2。因此，綜合分析SIC的原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544的泳動(dòng)能力有明顯的抑制作用。

圖2 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544泳動(dòng)能力的抑制作用Fig. 2 PA inhibited swimming motility of C. sakazakii ATCC29544

2.4 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544生物被膜形成能力的影響

原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544在12 ℃和25 ℃下不同時(shí)間段（24、48 h和72 h）形成生物被膜能力的影響如圖3所示。結(jié)果表明，在25 ℃下培養(yǎng)24 h后阪崎克羅諾腸桿菌的生物被膜形成能力最強(qiáng)。與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度的原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544的生物被膜形成能力均有顯著的抑制作用（P＜0.05），并且抑制效果呈現(xiàn)濃度依賴性：例如在72 h時(shí)，未經(jīng)原兒茶醛作用的阪崎腸桿菌生物被膜SBF為0.87±0.05，經(jīng)1/200、1/100 MIC和1/50 MIC的原兒茶醛處理的阪崎腸桿菌生物被膜SBF分別降低至0.54±0.05、0.52±0.09和0.46±0.03。

2）阿卡狄亞式，即通過追溯藝術(shù)的黃金年代——古代與盛期文藝復(fù)興時(shí)期，往現(xiàn)代城市中添加歷史化的能喚起人烏托邦式想象的尺度。

12 ℃下阪崎腸桿菌生物被膜形成能力的最佳時(shí)間仍為24 h。原兒茶醛對(duì)阪崎腸桿菌的生物被膜形成能力有著顯著的抑制作用（P＜0.05），并隨著質(zhì)量濃度的升高抑制效果增強(qiáng)。在72 h時(shí)，未經(jīng)原兒茶醛作用的阪崎腸桿菌生物被膜SBF為1.18±0.06。而經(jīng)1/200、1/100 MIC和1/50 MIC的原兒茶醛處理后SBF分別降低至0.92±0.12、0.78±0.12和0.67±0.06。

圖3 原兒茶醛在12 ℃（A）和25 ℃（B）對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544生物被膜形成能力的影響Fig. 3 Inhibitory effect of PA on biofilm formation of C. sakazakii ATCC29544 at 12 (A) and 25 (B) ℃

2.5 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544黏附及侵入Caco-2細(xì)胞的影響

圖4 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544黏附（A）及侵入（B）Caco-2細(xì)胞的影響Fig. 4 Effect of PA on adhesion (A) and invasion (B) to Caco-2 cells of C. sakazakii ATCC29544

由圖4A可知，原兒茶醛能夠顯著降低細(xì)菌黏附率（P＜0.05），并且呈現(xiàn)濃度依賴性。當(dāng)原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/200 MIC時(shí)，黏附阪崎腸桿菌總量相比對(duì)照組降低了1.9%；當(dāng)原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/100 MIC及1/50 MIC時(shí)，細(xì)菌黏附率分別下降了76.7%和88.9%，并與對(duì)照組呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）。

由圖4B可知，原兒茶醛對(duì)細(xì)菌侵入Caco-2細(xì)胞的能力具有明顯的抑制作用，并隨著質(zhì)量濃度的增加抑制效果加強(qiáng)。與對(duì)照組相比，當(dāng)原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/200 MIC和1/100 MIC時(shí)，阪崎克羅諾腸桿菌侵入率分別降低至60.6%和50.0%，并與對(duì)照組呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；當(dāng)原兒茶醛濃度為1/50 MIC時(shí)，細(xì)菌侵入率降低至27.3%，與對(duì)照組呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）。

2.6 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC29544毒力基因轉(zhuǎn)錄的影響

表3 原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌相關(guān)毒力基因表達(dá)的影響Table 3 Effect of PA on the expression of virulence genes in C. sakazakii

由表3可知，當(dāng)原兒茶醛質(zhì)量濃度為1/50 MIC和1/100 MIC時(shí)能夠下調(diào)與阪崎腸桿菌泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)性（flhD、fliD、flgJ、motA、motB）、生物被膜（bcsA）、黏附及侵入宿主細(xì)胞能力（ompA、ompX）和內(nèi)毒素（lpxB）相關(guān)毒力基因的轉(zhuǎn)錄量。原兒茶醛質(zhì)量濃度在1/50 MIC時(shí)對(duì)相關(guān)毒力基因轉(zhuǎn)錄量的抑制作用比質(zhì)量濃度在1/100 MIC時(shí)更加明顯。編碼阪崎克羅諾腸桿菌內(nèi)毒素基因（lpxB）和生物被膜基因（bcsA），及部分鞭毛合成基因（flgJ、fliD）相比于實(shí)驗(yàn)中其他致病基因，轉(zhuǎn)錄過程受原兒茶醛影響更加明顯。

3 討 論

本研究首先通過測(cè)定MIC和MBC初步評(píng)價(jià)了原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的抑殺效果，并選擇1/50、1/100 MIC和1/200 MIC為實(shí)驗(yàn)所用SIC。隨后選取了原兒茶醛處理后亞抑制態(tài)的菌體進(jìn)行毒力因子抑制機(jī)理的研究。結(jié)果表明，原兒茶醛對(duì)本研究中使用的阪崎腸桿菌的MIC和MBC均為2 mg/mL，可見該天然產(chǎn)物抑菌作用良好。已有學(xué)者探究了其他植物源活性物質(zhì)對(duì)阪崎腸桿菌的抑菌效果：馬蘭提取物丁香酸及烏蕨葉提取物質(zhì)原兒茶酸對(duì)阪崎腸桿菌ATCC29544的MIC為5 mg/mL[2,30]，阿魏莖根提取物阿魏酸對(duì)阪崎腸桿菌ATCC29544的MIC為2.5 mg/mL[31]。因此，在諸多植物源化合物中原兒茶醛對(duì)阪崎腸桿菌的抑制效果良好。

細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力有助于菌體生物被膜的形成及菌體與宿主的相互作用，從而增強(qiáng)菌體的致病能力[32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原兒茶醛能夠顯著或極顯著減小阪崎腸桿菌的泳動(dòng)圈直徑，能夠有效抑制其運(yùn)動(dòng)性，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與阪崎腸桿菌鞭毛合成或運(yùn)動(dòng)功能相關(guān)的基因（motA、motB、fliD、flgJ、flhD等）轉(zhuǎn)錄量顯著下調(diào)。類似地，Inamuco等[33]證明香芹酚能夠使沙門氏菌蛋白合成受阻從而降低致病菌的運(yùn)動(dòng)能力；Amalaradjou等[20]也證明肉桂醛能夠影響多種與運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)而使其運(yùn)動(dòng)區(qū)域面積顯著降低。本實(shí)驗(yàn)中下調(diào)基因motA和motB是鞭毛基本結(jié)構(gòu)——基體組成蛋白的必需基因，另外flhD操縱子的表達(dá)水平在細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)速度控制中起著“樞紐”的作用[34-35]。因此，猜測(cè)原兒茶醛通過影響編碼鞭毛蛋白的基因表達(dá)或鞭毛功能從而降低阪崎腸桿菌的運(yùn)動(dòng)能力。

在生物被膜形成能力實(shí)驗(yàn)中，選取了對(duì)食品生產(chǎn)及生活具有指導(dǎo)意義的實(shí)驗(yàn)溫度：12 ℃是歐洲議會(huì)和理事會(huì)于2004年制定的食品衛(wèi)生規(guī)則條例中食品工業(yè)操作環(huán)境溫度，25 ℃即普通環(huán)境下的室溫。生物被膜在形成過程中會(huì)經(jīng)歷游離態(tài)、可逆黏附、不可逆黏附、被膜成熟及主動(dòng)分散5 個(gè)階段[36]。本研究結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)溫度下生物被膜形成能力24 h時(shí)達(dá)到最大，隨后SBF顯著降低，推測(cè)該結(jié)果可能是由于生物被膜培養(yǎng)一段時(shí)間后進(jìn)入主動(dòng)分散階段。結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)溫度（12 ℃及25 ℃）下，原兒茶醛能夠極顯著降低阪崎腸桿菌生物被膜形成能力。類似地，Xu Yunfeng等[37]發(fā)現(xiàn)SIC 1/64、1/32 MIC下的安石榴苷能夠使金黃色葡萄球菌生物被膜形成指數(shù)由3.7分別下降至1.9和0.4；Du Wenfang等[26]研究認(rèn)為1/10 MIC濃度的表沒食子兒茶素沒食子酸酯可顯著降低單增李斯特菌ATCC19114在15、30、37 ℃下的生物被膜形成量。在本研究中，原兒茶醛能夠使與生物被膜形成的相關(guān)毒力基因下調(diào)，包括鞭毛合成基因（如motA、motB、fliD、flgJ、flhD等）以及生物被膜結(jié)構(gòu)組成基因（如bcsA）。bcsA作為纖維素合酶催化亞基的編碼基因，在纖維素合成及促進(jìn)腸桿菌科胞外多糖生成中至關(guān)重要[38]。Amalaradjou等[20]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示750 μmol/L的反式肉桂醛使阪崎腸桿菌與鞭毛相關(guān)的基因fliD、flgJ、flhD轉(zhuǎn)錄量極顯著下降。因此，推斷原兒茶醛能夠通過影響生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)其毒力的調(diào)控。

黏附及侵入腸上皮細(xì)胞是阪崎克羅諾腸桿菌致病的關(guān)鍵步驟，由阪崎腸桿菌所引起的腦膜炎、菌血癥等癥狀均與該毒力密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，原兒茶醛能夠降低阪崎腸桿菌黏附及侵入Caco-2細(xì)胞的能力。多種天然物質(zhì)具有抑制致病菌黏附或/和侵入宿主細(xì)胞的功能：Li Guanghui等[24]的研究結(jié)果表明安石榴苷可有效降低沙門氏菌黏附Caco-2細(xì)胞的能力；Fan Qiuxia等[39]研究顯示1/32 MIC和1/16 MIC下的輔酶Q0使李斯特菌CMCC54004黏附及侵入Caco-2細(xì)胞能力下降，并且相關(guān)毒力基因actA、inlA、inlB、plcA、plcB轉(zhuǎn)錄水平也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。OmpA和OmpX是阪崎腸桿菌黏附及侵入宿主過程中的重要功能膜蛋白，OmpA作為細(xì)胞外膜極其重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，通過維持細(xì)胞菌體形態(tài)和親水化合物的跨膜傳遞，從而影響菌體黏附宿主的過程[40]，OmpX的生物學(xué)功能尚不清楚，但有研究者認(rèn)為它能與腸桿菌科細(xì)胞表面的外來蛋白結(jié)合，從而引起細(xì)胞的防御機(jī)制，這種結(jié)合親和力用于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞黏附和侵襲[41]。研究顯示，原兒茶醛可下調(diào)ompA和ompX等相關(guān)毒力基因轉(zhuǎn)錄水平，因此，猜測(cè)原兒茶醛能夠通過影響ompA和ompX的轉(zhuǎn)錄量從而干擾阪崎腸桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附和侵入。

4 結(jié) 論

本研究以原兒茶醛為對(duì)象，以阪崎克羅諾腸桿菌為作用主體，探究了原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌多種毒力因子的抑制作用。首先測(cè)定原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的MIC和MBC，并確定了SIC；隨后探究了原兒茶醛對(duì)菌體泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)能力、生物被膜形成、黏附及侵入Caco-2細(xì)胞的影響；最后利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了原兒茶醛對(duì)菌體毒力相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄量的影響。結(jié)果表明原兒茶醛對(duì)本研究中6 株阪崎克羅諾腸桿菌的MIC和MBC均為2 mg/mL，SIC的原兒茶醛能夠顯著抑制菌體泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)能力，減弱菌體在12 ℃和25 ℃下生物被膜的形成能力，并能夠降低菌體黏附及侵入Caco-2細(xì)胞的能力，同時(shí)能夠下調(diào)9 個(gè)相關(guān)毒力基因的轉(zhuǎn)錄量。本研究結(jié)果表明，原兒茶醛對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌的毒力因子有著良好的抑制作用，有潛力作為抗生素補(bǔ)充劑或抗毒性物質(zhì)，從而達(dá)到預(yù)防及控制阪崎克羅諾腸桿菌感染性疾病的目的。