馬瑞琪 吳濤 趙秀華 張久聰 于曉輝 張茜

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是由一種新發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的肺炎，該病毒為具有外套膜的正鏈單股RNA病毒，其主要傳播途徑為呼吸道飛沫傳播和接觸傳播,也存在糞口傳播、母嬰傳播和氣溶膠傳播的方式，具有較高的感染性[1-3]。COVID-19的發(fā)病機(jī)制為SARS-CoV-2 通過表面S蛋白與宿主細(xì)胞上的受體結(jié)合進(jìn)入宿主細(xì)胞，并形成新的病毒擴(kuò)散[4]。近年來，已有多項(xiàng)研究證明間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、腎臟疾病、糖尿病和自身免疫性疾病等治療中有著廣闊的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值，對(duì)于COVID-19的治療也顯示出其不可替代的作用[5]。

一、SARS-CoV-2的致病機(jī)制

1.T淋巴細(xì)胞活化：目前缺乏T淋巴細(xì)胞在新型冠狀病毒肺炎中具體作用的研究報(bào)告。由于該病毒與嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）及中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）的相似性，可通過SARS的T淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用的過程推測(cè)T淋巴細(xì)胞對(duì)SARS-CoV-2的作用[6]。SARS-Cov 首先感染氣道上皮細(xì)胞，隨后感染肺內(nèi)存在的呼吸道樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC），從感染的呼吸道上皮細(xì)胞裂解碎片中捕獲SARS-CoV 抗原，在處理病毒的同時(shí)遷移到引流淋巴結(jié)，以MHC/肽復(fù)合物的形式將處理過的病毒成分提呈并激活部分初始T淋巴細(xì)胞?；罨蟮妮o助性T淋巴細(xì)胞和殺傷性T淋巴細(xì)胞大量增殖并遷移到肺部感染部位清除病毒[7]。臨床發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2感染患者外周血中淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞減少原因未明，SARS患者也存在類似現(xiàn)象，在急性期輔助性及殺傷性T細(xì)胞都急劇減少，T細(xì)胞活化程度也降低。SARS 重癥患者都存在T細(xì)胞應(yīng)答延遲和持續(xù)性病毒感染，這提示重癥患者可能出現(xiàn)了T細(xì)胞應(yīng)答缺陷，導(dǎo)致機(jī)體抗病毒能力降低。目前尚未發(fā)現(xiàn)冠狀病毒直接感染T細(xì)胞，但在SARS患者中，DC 功能和遷移能力受損可能是導(dǎo)致T細(xì)胞應(yīng)答降低和數(shù)量減少的原因，應(yīng)激反應(yīng)也有可能誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡[8]。

2.炎癥因子風(fēng)暴：人體感染SARS-CoV-2后迅速激活CD4+T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生粒細(xì)胞-巨核細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、白細(xì)胞介素6（interleukin，IL-6）、IL-4、干擾素-γ（interferon，IFN-γ）等細(xì)胞因子形成炎癥因子風(fēng)暴，再激活炎癥性T細(xì)胞（GM-CSF+IFN-γ+）和炎癥性單核巨細(xì)胞（CD14+CD16+）等，這些活化的免疫細(xì)胞大量進(jìn)入肺循環(huán)，發(fā)揮免疫損傷作用[9]；另一方面肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞正常情況下產(chǎn)生表面活性物質(zhì)，抑制單核巨噬細(xì)胞的過度激活，SARS-CoV-2 通過刺突蛋白（spike protein，S蛋白）和Ⅱ型上皮細(xì)胞上的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin converting enzyme2，ACE2）受體結(jié)合直接入侵該細(xì)胞，使Ⅱ型上皮細(xì)胞產(chǎn)生表面活性物質(zhì)的能力喪失，單核巨噬細(xì)胞的激活完全失控[10]，與此同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的病毒RNA 通過水解酶產(chǎn)生的蛋白質(zhì)結(jié)合，產(chǎn)生新的病毒，釋放出原宿主細(xì)胞，繼續(xù)侵入新的細(xì)胞，病毒快速復(fù)制和大量的促炎細(xì)胞因子、趨化因子反應(yīng)破壞了肺微血管和肺泡上皮細(xì)胞屏障形成炎癥風(fēng)暴，導(dǎo)致血管滲漏和肺泡水腫，肺部炎癥的加劇和彌漫性損傷，進(jìn)一步引起大面積肺損傷，最終導(dǎo)致嚴(yán)重缺氧、進(jìn)行性呼吸困難乃至呼吸衰竭。除肺外，因ACE2 廣泛表達(dá)于人體組織，包括心臟、肝臟、腎臟、消化器官和腦組織等[11]，一旦病毒進(jìn)入血液循環(huán)，就會(huì)廣泛傳播。然而，COVID-19的治愈主要取決于患者自身的免疫系統(tǒng)，當(dāng)過度激活的免疫系統(tǒng)殺死病毒后，它會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥因子，導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞因子風(fēng)暴[12]，出現(xiàn)全身性炎癥、血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定和多器官功能衰竭，甚至死亡。Huang 等[13]闡明，重癥監(jiān)護(hù)室COVID-19患者細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)水平高于非重癥監(jiān)護(hù)室COVID-19患者，細(xì)胞因子風(fēng)暴與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。因此，避免細(xì)胞因子風(fēng)暴可能是治療COVID-19的關(guān)鍵。

二、COVID-19治療現(xiàn)狀

截至目前，還未發(fā)現(xiàn)能夠應(yīng)對(duì)SARS-CoV-2感染的特效藥物，且針對(duì)此疫情的疫苗也在緊張的研制中[14]。目前的一般治療主要為支持治療和抗病毒治療，抗病毒治療藥物根據(jù)新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第7 版），推薦使用α-干擾素、洛匹那韋/利托那韋、利巴韋林、磷酸氯奎[15]。部分研究報(bào)道顯示，瑞德西韋也具有抗冠狀病毒的作用并可減輕病毒對(duì)肺部損傷[16]。對(duì)于危重癥病例的治療，除上述治療外，加用更高級(jí)的生命支持治療如體外膜肺氧合，還可使用腎臟替代治療、血液凈化和康復(fù)者血漿等治療，此外對(duì)于某些IL-6 升高患者可試用托珠單抗免疫治療等[15]。在此次疫情治療中，我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥中的連花清瘟膠囊、疏風(fēng)解毒膠囊等藥物以及一些中藥方劑對(duì)疾病的治療也凸顯出較好的療效[17]。

三、MSCs 潛在治療作用

MSCs廣泛存在于全身多種組織中，可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，具有多向分化潛能和再生功能，因此最初的研究局限在分化方面，而后研究發(fā)現(xiàn)MSCs 具有強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)功能，可以通過炎癥因子的誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，因此，人們又將研究重點(diǎn)集中在炎癥因子刺激MSCs的免疫抑制作用，減輕免疫病理損傷。當(dāng)發(fā)生急、慢性炎癥性肺部疾病，在炎癥環(huán)境調(diào)控下MSCs 能夠調(diào)節(jié)所有免疫細(xì)胞的增殖、活化和效應(yīng)功能，抑制肺浸潤性免疫細(xì)胞，減輕炎癥反應(yīng)。同時(shí)因MSCs的組織修復(fù)再生能力，故可向肺泡上皮細(xì)胞分化，為治療臨床上各種難治性疾病提供了一個(gè)新的治療途徑[18-19]。

1.免疫調(diào)節(jié)作用：MSCs 能夠調(diào)節(jié)免疫性肺疾病中起重要作用的免疫細(xì)胞增殖，激活和效應(yīng)子功能，包括專業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞（DC，巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞），嗜中性粒細(xì)胞以及效應(yīng)子和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。MSCs 通過旁分泌機(jī)制改變免疫應(yīng)答[20]。MSCs 缺乏共刺激分子的表面表達(dá)，并且能夠使Th1、Th2和Th17細(xì)胞無反應(yīng)。另外，抑制性分子編程性死亡1（PD-1）與它的配體PD-L1和PD-L2的相互作用是MSCs 介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖抑制的原因。MSCs可減少受傷的肺中效應(yīng)T細(xì)胞的總數(shù)，并減輕Th1、Th2 或Th17 驅(qū)動(dòng)的炎癥反應(yīng)，同時(shí)降低B細(xì)胞趨化因子和其受體的表達(dá)，從而降低炎癥部位B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷[21-22]。此外有報(bào)道也關(guān)注到COVID-19患者的淋巴細(xì)胞減少和高水平的C反應(yīng)蛋白。C反應(yīng)蛋白是炎癥和宿主對(duì)細(xì)胞因子特別是T細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNFα）、IL-6、單核細(xì)胞趨化因子（monocyte chemokines，MCP1）和IL-8 產(chǎn)生反應(yīng)具有高度敏感性的生物標(biāo)志物[23]，但是C反應(yīng)蛋白本身不能成為干預(yù)的目標(biāo)。MSCs 療法可以通過改善微環(huán)境來抑制免疫系統(tǒng)的過度活化并促進(jìn)內(nèi)源性修復(fù)。通過靜脈輸注進(jìn)入人體后，部分MSCs 會(huì)在肺中積聚，改善肺微環(huán)境，保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞，防止肺纖維化并改善肺功能[7]。另外，MSCs 還可分泌可溶性免疫抑制因子前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transformed growth factor，TGF-β）、吲哚胺2,3-二加氧酶（IDO）和一氧化氮（NO）等[24]。通過產(chǎn)生PGE2，MSCs 減弱了IL-2受體的表達(dá)，并因此抑制了活化T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。TGF-β是IL-2信號(hào)通路的有效抑制劑，并參與了MSCs 介導(dǎo)的活化T細(xì)胞的G1細(xì)胞周期阻滯。以類似的方式，MSCs 衍生的NO抑制T細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子-5（STAT-5）的磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，而MSCs 衍生的IDO 促進(jìn)色氨酸降解為犬尿氨酸，從而抑制T細(xì)胞的凋亡。除了直接抑制效應(yīng)T細(xì)胞外，MSCs 還可以通過調(diào)節(jié)PGE2、IL-10和IL-6中DC的抗原呈遞功能來抑制Th1、Th2和Th17細(xì)胞的生成及依賴方式[25]。與MSCs 相互作用后，由于主要組織相容性復(fù)合體（MHC）和共刺激分子的表達(dá)減少，DC 變得不成熟，抗原呈遞能力降低。另外，MSCs可以誘導(dǎo)DC中的耐受性表型，并且可以促進(jìn)炎性M1 巨噬細(xì)胞向免疫抑制M2 巨噬細(xì)胞的極化。這樣，MSCs可以減少DC和巨噬細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-12）的產(chǎn)生，并促進(jìn)抗炎性因子IL-10和TGF-β的產(chǎn)生。以IL-10和TGF-β 依賴性的方式致耐受性DC和M2 巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)MSCs中免疫抑制性HLA-G5的產(chǎn)生增強(qiáng)，增強(qiáng)其刺激T 調(diào)節(jié)細(xì)胞（Tregs）的能力，有助于在受傷的肺部創(chuàng)建抗炎微環(huán)境，明顯改善了嚴(yán)重COVID-19患者的炎癥情況。由于MSCs 獨(dú)特的免疫抑制能力，使血清中促炎細(xì)胞因子和趨化因子水平顯著降低，從而減少了脆弱肺組織對(duì)單核/巨噬細(xì)胞的吸引，同時(shí)誘導(dǎo)更多的調(diào)節(jié)DC 進(jìn)入炎癥組織生態(tài)位。而IL-10和VEGF的升高可促進(jìn)肺的修復(fù)[26-27]。研究者對(duì)患者體內(nèi)輸入的MSCs作RNA 測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其不表達(dá)SARS-CoV-2受體ACE2，此外，抗炎和營養(yǎng)因子如TGF-β、干細(xì)胞生長因子、纖維母細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子和神經(jīng)生長因子等在MSCs中高表達(dá)，進(jìn)一步證明了其免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)功能[28]。

2.多向分化潛能：除了與肺浸潤的免疫細(xì)胞相互作用外，MSCs 還具有在體外分化為Ⅱ型肺泡上皮（alveolar epithelial type Ⅱ cell，AT Ⅱ）細(xì)胞的潛力，這得益于MSCs在受損肺組織中的歸巢，移入和存活能力。SARSCoV-2對(duì)正常肺結(jié)構(gòu)的破壞促進(jìn)進(jìn)展性纖維化的發(fā)展，導(dǎo)致肺功能下降，表現(xiàn)為干咳、呼吸困難和疲勞。治療肺中的MSCs 具有自我更新和分化能力,主動(dòng)性歸巢至受損傷肺組織中并發(fā)揮作用，減輕局部免疫損傷，促進(jìn)局部細(xì)胞修復(fù)及調(diào)節(jié)免疫異常[29]。運(yùn)用改良的小氣道生長培養(yǎng)基中，Sutton 等[30]發(fā)現(xiàn)生長培養(yǎng)基中與MRC-5細(xì)胞（源自正常胎兒肺間充質(zhì)組織）共同培養(yǎng)后，可以將骨髓來源的MSCs在體外成功分化為AT Ⅱ細(xì)胞。骨髓來源的MSCs與MRC-5 相互作用2～3 周后，AT Ⅱ樣細(xì)胞在培養(yǎng)中占主導(dǎo)地位，并且在同一時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)到了人類AT Ⅱ細(xì)胞的一種特定功能標(biāo)記表面活性劑蛋白C。由于MSCs在體外可以分化成AT Ⅱ細(xì)胞，抑制降解酶的產(chǎn)生，抑制肺浸潤免疫細(xì)胞中促纖維化因子的分泌。Liu 等[31]使用改良的共培養(yǎng)系統(tǒng)與鼠肺上皮12（MLE-12）細(xì)胞和SAGM 來證明Wnt3a誘導(dǎo)的經(jīng)典Wnt/β-catenin 途徑活化導(dǎo)致鼠MSCs在功能性AT Ⅱ樣細(xì)胞中分化，該研究小組的成員證明，Wnt5a誘導(dǎo)的非經(jīng)典Wnt/c-Jun N 末端激酶或Wnt/蛋白激酶C 途徑的激活也可能導(dǎo)致MSCs 成功分化為AT Ⅱ樣細(xì)胞體外。有研究觀察到，通過靜脈輸入MSCs，可在呼吸機(jī)肺損傷后增強(qiáng)肺修復(fù)作用。Chimenti 等[32]證明了進(jìn)行MSCs 預(yù)處理以防止大流量通氣后發(fā)生呼吸機(jī)肺損傷的潛力，MSCs 預(yù)處理降低了肺水含量并提高了肺組織學(xué)評(píng)分，支氣管肺泡灌洗液的蛋白質(zhì)、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞炎性蛋白2和IL-1β的水平也降低。Curley 等[33]觀察到在高壓呼吸機(jī)肺損傷模型中，氣管內(nèi)和靜脈內(nèi)遞送的大鼠MSCs及其分泌物可相對(duì)增強(qiáng)肺氧合和順應(yīng)性的恢復(fù)，并恢復(fù)肺結(jié)構(gòu)。同時(shí)測(cè)量IL-6和TNF-α 濃度也表明，MSCs 遞送也顯著減輕了炎癥反應(yīng)。最近，Hayes 等[34]發(fā)現(xiàn)MSCs在高壓肺損傷后劑量低至每千克200萬個(gè)細(xì)胞后仍保留其治療功效。他們還觀察到MSCs治療的功效在損傷后6 h的情況下仍可維持。另外還發(fā)現(xiàn)MSCs可增強(qiáng)肺泡液清除率，這是ARDS恢復(fù)的重要過程。這可能由于巨噬細(xì)胞的吞噬能力增強(qiáng)以及在離體灌注的人肺炎模型中分泌的角化細(xì)胞生長因子的抗菌作用所致[35]。

3.胞外囊泡（extracelluar vesicles，EVs）的作用：現(xiàn)有研究表明，MSCs 分泌的EVs可能釋放生物活性蛋白，脂質(zhì)和核酸，從而促進(jìn)機(jī)體受損細(xì)胞的功能變化[36]。在各種炎癥性肺病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，通過轉(zhuǎn)移MSCs 衍生的EVs可以抑制炎癥過程并減少肺纖維化。在低氧性肺動(dòng)脈高壓的小鼠模型中，MSCs 衍生的外泌體的靜脈內(nèi)給藥抑制了STAT3 信號(hào)傳導(dǎo)，并恢復(fù)了miR-17和miR-204 超家族的水平，從而抑制了血管重塑和低氧性肺動(dòng)脈高壓。用MSCs 衍生的EVs 預(yù)處理的肺泡巨噬細(xì)胞可減輕LPS 損傷小鼠的炎癥和肺損傷。如Li 等[37]報(bào)道，這種效應(yīng)是由EV 介導(dǎo)的線粒體轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)的。一些證據(jù)表明，MSCs 衍生的EVs可以攜帶miRNA，這些miRNA 通過靶向PTEN和PDCD4 等促凋亡基因來減少肺組織凋亡和肺損傷[38-39]。在膿毒癥的小鼠模型中，MSCs 不僅在體外而且在肺和肝組織中都將巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)為M2型。這些免疫調(diào)節(jié)特性是由外泌體miR-146a的釋放介導(dǎo)的[37]。上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡增加了血管壁的通透性，使中性粒細(xì)胞浸潤并加重了肺水腫和炎癥。因此，通過MSCs 遞送抗細(xì)胞凋亡的miRNA是減輕炎癥的方法。MSCs-EVs可以將特定化合物傳遞給靶器官，這些化合物由MSCs 自身過度表達(dá)或可以直接加載到EVs中。而且，它們很容易進(jìn)入體循環(huán)并維持持久的高濃度，而輸注的MSCs 濃度迅速下降[40]。EVs 不會(huì)自我復(fù)制，從而降低了腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)。Willis 等[41]發(fā)現(xiàn)，在MSCs 外泌體治療后，巨噬細(xì)胞表型向抗炎M2 樣狀態(tài)轉(zhuǎn)變，從而改善了肺功能、肺纖維化、血管重塑和肺動(dòng)脈高壓。

MSCs 有調(diào)節(jié)宿主對(duì)免疫損傷和感染的免疫反應(yīng)以及促進(jìn)組織免疫損傷后的修復(fù)能力在多個(gè)臨床前模型中顯示了其潛力，因此，在ARDS、肺炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病和肺間質(zhì)纖維化的等多種肺部疾病治療中已經(jīng)被廣泛研究。在近期面對(duì)SARS-CoV-2的免疫損傷，許多臨床試驗(yàn)也指出MSCs的治療是安全有效的，尤其是病情危重的患者，因?yàn)閷?duì)于重癥患者而言，最重要的是通過治療來有效控制紊亂的免疫系統(tǒng)和修復(fù)損傷的組織。MSCs治療可抑制免疫系統(tǒng)過度激活，通過改善微環(huán)境促進(jìn)內(nèi)源性修復(fù)。通過靜脈滴注進(jìn)入人體后，部分MSCs在肺內(nèi)積聚，改善肺微環(huán)境，保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞、防止肺纖維化進(jìn)而改善肺功能。MSCs由于強(qiáng)大的免疫調(diào)控和修復(fù)功能無疑成為重癥監(jiān)護(hù)室COVID-2019患者治療重要選擇之一。