間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)后被證實(shí)廣泛存在于脂肪、臍帶、牙髓和毛囊等組織的多潛能干細(xì)胞[1]。它可以定向誘導(dǎo)分化為外、中、內(nèi)3個(gè)胚層的細(xì)胞。因?yàn)槿狈χ饕M織相容性復(fù)合物和共刺激性細(xì)胞表面抗原分子即其低免疫原性、強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力和能分泌多種抗炎因子，MSCs 被廣泛應(yīng)用于組織損傷的修復(fù)、免疫功能紊亂性疾病的穩(wěn)態(tài)再平衡以及異體移植后的免疫排斥反應(yīng)抑制[2-3]。但其應(yīng)用也存在著安全性擔(dān)憂，包括移植后的血管栓塞、異常分化和致瘤性等[4]。在最近的研究中，對MSCs 移植后的示蹤顯示，MSCs 移植后在體內(nèi)存活的時(shí)間很短，發(fā)揮作用并非依靠其在局部組織中歸巢后的自我更新、增殖并定向分化為效應(yīng)細(xì)胞，而是通過分泌各種信號(hào)分子發(fā)揮作用，其中最受關(guān)注的是能攜帶多種信號(hào)分子的外泌體[5-6]。近年來，越來越多的學(xué)者提出利用MSCs分泌的外泌體替代MSCs 本身來發(fā)揮免疫調(diào)控作用，用于治療自身免疫炎性疾病，這樣可以很好的規(guī)避細(xì)胞移植帶來的風(fēng)險(xiǎn)，并且MSCs來源的外泌體免疫源性更低、穿透能力更強(qiáng)[7]。

MSCs來源的外泌體是指MSCs在靜息或者活化狀態(tài)下分泌的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡，直徑30～150 nm，其內(nèi)攜帶著豐富的細(xì)胞特異性生物活性分子，包括脂類、蛋白質(zhì)、miRNA和mRNA 等（圖1），這些活性分子經(jīng)過親代細(xì)胞的特殊選擇與包裝而進(jìn)入脂質(zhì)雙分子層，是激發(fā)機(jī)體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的關(guān)鍵，在免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用[8-9]。MSCs 外泌體形成過程復(fù)雜，涉及4種內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）和其他多種輔助分子；首先細(xì)胞膜內(nèi)陷形成早期核內(nèi)體，ESCRT-0 通過泛素化結(jié)合位點(diǎn)與早期核內(nèi)體表面的特異性受體結(jié)合以“逆出芽”的方式向內(nèi)出芽形成管腔內(nèi)小體，管腔內(nèi)小體在ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅱ的作用下形成出芽小泡，再經(jīng)ESCRT-Ⅲ剪切與核內(nèi)體質(zhì)膜分離形成成熟的晚期核內(nèi)體，最后召集并與銜接蛋白Alix 鏈接，促進(jìn)囊泡出芽，形成多囊泡體；一部分多囊泡體經(jīng)過溶酶體途徑被降解，另一部分多囊泡體通過分泌途徑與細(xì)胞膜融合并將脂類、蛋白質(zhì)和miRNA 等內(nèi)吞形成外泌體，之后釋放到細(xì)胞外的環(huán)境中發(fā)揮作用[10]。MSCs 外泌體發(fā)揮作用主要依賴4種途徑：（1）外泌體表面的膜蛋白被細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶切割，切割后的片段作用于靶細(xì)胞；（2）直接與靶細(xì)胞表面的配體或受體結(jié)合；（3）與靶細(xì)胞膜直接融合后傳遞外泌體內(nèi)效應(yīng)分子；（4）被靶細(xì)胞內(nèi)吞后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[11-12]。與MSCs相比，其來源的外泌體靶向性更強(qiáng)，體積更小，能很好的穿過血腦等屏障，更好地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抗炎功能[13]。

二、MSCs來源的外泌體通過免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗炎作用

（一）MSCs來源的外泌體與非特異性免疫

1.巨噬細(xì)胞：巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)非特異性免疫的重要組成部分，在損傷修復(fù)、抗擊病原微生物和維持機(jī)體免疫平衡中不可或缺。在不同的微環(huán)境下，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出不同的功能特性。按照細(xì)胞表型和分泌的炎癥因子不同，可以將巨噬細(xì)胞分為M1型即經(jīng)典活化型和M2型即選擇活化型。M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物有：CD86、CD197、HLA-DR 等，主要參與促炎反應(yīng)，能分泌大量的炎癥介質(zhì)包括：腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor ，TNF-α）、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-12 等，它們均具有很強(qiáng)的抗原提呈作用。M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物有：CD163、CD206、CD209 等，它主要是抑制炎癥反應(yīng)促進(jìn)損傷組織的修復(fù)，通過減少炎癥因子的釋放和分泌精氨酸酶-1（arginase，Arg-1）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、IL-10 等發(fā)揮抗炎效應(yīng)[14-15]。Domenis等[16]證實(shí)脂肪來源的MSCs在細(xì)胞因子刺激后產(chǎn)生的外泌體與單核細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，將促進(jìn)單核細(xì)胞向抗炎型M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Li 等[17]研究表明在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化的脂多糖培養(yǎng)環(huán)境下，人臍帶來源的MSCs 外泌體能抑制巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，并能下調(diào)細(xì)胞分泌的促炎因子IL-1β和TNF-α水平，同時(shí)提高抗炎因子IL-10的水平，從而減輕燒傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。在敗血癥的研究中，Song 等[18]發(fā)現(xiàn)人臍帶來源的MSCs 經(jīng)過IL-1β 處理后分泌的外泌體能遞送miR-146a 至巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)其向抗炎型的M2型巨噬細(xì)胞極化，從而有效緩解小鼠敗血癥引起的癥狀，降低敗血癥導(dǎo)致的小鼠死亡率。在肥胖患者體內(nèi)，長期處于低水平慢性炎癥狀態(tài)的白色脂肪組織中有大量的M1型巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞能通過分泌iNOS和TNF-α 引起胰島素抵抗、代謝紊亂并增加心血管事件的發(fā)生率，Zhao 等[19]的研究證實(shí)脂肪來源的MSCs 外泌體能通過攜帶的活性STAT3 蛋白激活A(yù)rg-1 促使巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化從而改善胰島素抵抗。

2.自然殺傷細(xì)胞：自然殺傷細(xì)胞是體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，它不僅能在不依賴T、B淋巴細(xì)胞的狀況下直接殺滅病毒或者機(jī)體變異的細(xì)胞發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用，而且參與了機(jī)體的免疫監(jiān)視與自身免疫性疾病的發(fā)生[20]。自然殺傷細(xì)胞表面有抑制性受體和活化性受體，能形成多種組合，發(fā)揮包括分泌IFN-γ、細(xì)胞殺傷及調(diào)節(jié)其它免疫細(xì)胞的功能。研究表明，在敗血癥小鼠模型體內(nèi)，MSCs的分泌物可通過激活JAK/STAT 信號(hào)通路，上調(diào)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子 3的目的基因，從而抑制自然殺傷細(xì)胞的增殖和功能[21]。此外，人骨髓來源的MSCs可通過旁分泌和自分泌的途徑，經(jīng)吲哚胺-2,3-雙加氧酶、前列腺素E2、可溶性的HLA-G5和TGF-β對抗IL-2和IL-15誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞的增殖效應(yīng)[22]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，用人胎肝MSCs和其來源的外泌體分別處理自然殺傷細(xì)胞時(shí)，外泌體可發(fā)揮與干細(xì)胞相似的功能，包括抑制自然殺傷細(xì)胞的增殖、活化和細(xì)胞毒性[23]。

圖1 外泌體的形成過程

3.樹突狀細(xì)胞：樹突狀細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，處于非特異性免疫和獲得性免疫的分界線。研究表明樹突狀細(xì)胞在非特異性免疫、獲得性免疫和維持自身組織免疫耐受過程中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用。它們依靠先天的非特異性受體識(shí)別抗原，并將加工好的抗原肽呈遞給行使獲得性免疫的T淋巴細(xì)胞或者將未經(jīng)修飾的抗原蛋白固定在自己的細(xì)胞膜上以供附近的B淋巴細(xì)胞識(shí)別并使其活化。對樹突狀細(xì)胞而言，其對抗原的攝取加工和向T、B淋巴細(xì)胞呈遞抗原的過程時(shí)間上是分離的，根據(jù)這種差異，樹突狀細(xì)胞被分為了未成熟和成熟的樹突狀細(xì)胞，未成熟的樹突狀細(xì)胞具有極強(qiáng)的抗原攝取加工能力但只能夠表達(dá)低水平的FcR，因而不具備向淋巴細(xì)胞呈遞抗原的能力，而成熟的樹突狀細(xì)胞高表達(dá)MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子，因而具有強(qiáng)大的抗原提呈能力，但其以失去抗原的攝取和處理能力為代價(jià)。目前通常認(rèn)為未成熟的樹突狀細(xì)胞是致免疫耐受性的，而成熟的樹突狀細(xì)胞則是具備免疫應(yīng)答功能[24]。在MSCs與樹突狀細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，MSCs 不僅能通過分泌的IL-6和單核細(xì)胞集落刺激因子抑制樹突狀細(xì)胞的分化、內(nèi)吞作用，還可通過前列腺素E2抑制早期樹突狀細(xì)胞的成熟與功能[25]。類似的，誘導(dǎo)未成熟樹突狀細(xì)胞向成熟型轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基中加入骨髓來源的MSCs 外泌體，共刺激分子CD80、CD86表達(dá)減少，表示樹突狀細(xì)胞成熟的表面標(biāo)志物CD83 被抑制，炎癥因子TNF-α、IL-12 分泌降低而抗炎因子IL-10、TGF-β 升高，上調(diào)的IL-10和TGF-β 則可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Trg）的增殖和免疫抑制作用[26]。

（二）MSCs來源的外泌體與獲得性免疫

1.T淋巴細(xì)胞：T淋巴細(xì)胞起源于骨髓多能干細(xì)胞，在胸腺發(fā)育成熟，隨后經(jīng)血液分布到機(jī)體其他組織發(fā)揮細(xì)胞免疫的功能，T細(xì)胞種類繁多，按照功能和表面分子標(biāo)志為：細(xì)胞毒性、輔助性、記憶性和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。其中輔助性T細(xì)胞17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞已成為近年來在自身免疫炎性疾病中研究的熱點(diǎn)，它們在功能上相互拮抗。輔助性T細(xì)胞17 能夠分泌IL-17，它與受體結(jié)合后經(jīng)NF-kB 信號(hào)通路途徑可刺激內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子、IL-6、IL-8 等從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要維持自身免疫耐受，通過主動(dòng)調(diào)節(jié)的方式抑制正常機(jī)體內(nèi)潛在的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖和活化。一旦輔助性T細(xì)胞17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞這種抑制炎癥和促進(jìn)炎癥的平衡發(fā)生紊亂，將導(dǎo)致移植物排斥和多種自身免疫性疾病的產(chǎn)生。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)將人臍帶MSCs來源的外泌體加入到正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)基中，作用72 h后，CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例升高，同時(shí)細(xì)胞分泌的TGF-β1 升高，IL-6、IFN-γ、TNF-α水平降低。郭禮妍等[28]發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，人臍帶來源的MSCs 外泌體可以上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量和下調(diào)輔助性T細(xì)胞17的數(shù)量。此外，研究表明MSCs來源的外泌體中包含PD-L1、TGF-β和galectin-1 三種負(fù)反饋免疫調(diào)節(jié)分子，PD-L1 能抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)并促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖；TGF-β可誘導(dǎo)單核細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化；galectin-1 則可誘導(dǎo)已經(jīng)活化的T細(xì)胞凋亡[29-30]。

2.B淋巴細(xì)胞：B淋巴細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)體液免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)育成熟的B淋巴細(xì)胞接受抗原刺激后，在輔助性T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞的共同作用下分化成漿細(xì)胞，漿細(xì)胞能合成并分泌抗體發(fā)揮體液免疫的作用。當(dāng)B淋巴細(xì)胞功能異常時(shí)可分泌針對自身組織的抗體導(dǎo)致多種抗體相關(guān)的自身免疫炎性疾病的發(fā)生。目前關(guān)于MSCs來源的外泌體與B淋巴細(xì)胞的研究報(bào)道較少，但以往的研究表明MSCs分泌的TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-10 等可以抑制B淋巴細(xì)胞的增殖，減少IgA、IgG、IgM 抗體的分泌，同時(shí)抑制趨化受體CXCR4、CXCR5、CXCR7的表達(dá)[31]；此外在骨髓來源的MSCs與B淋巴細(xì)胞非接觸的共培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)MSCs 還可通過下調(diào)Blimp-1和上調(diào)PAX-5表達(dá)來抑制B淋巴細(xì)胞向漿細(xì)胞的分化[32]。Budoni 等[33]研究則發(fā)現(xiàn)來源于MSCs的微泡可以抑制B淋巴細(xì)胞的增殖與抗體的分泌，并且呈劑量依賴。但是MSCs 發(fā)揮這些作用是否是通過外泌體途徑或者旁分泌的其它途徑，還有待進(jìn)一步考證。

機(jī)體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用是一個(gè)復(fù)雜的過程，以上各種免疫細(xì)胞在這個(gè)過程中并非獨(dú)立的個(gè)體，它們可以相互作用、相互影響。雖然MSCs來源的外泌體對非特異性免疫和獲得性免疫中多種細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)較為明確，但外泌體作用于這些靶細(xì)胞的具體機(jī)制、關(guān)鍵靶點(diǎn)以及外泌體作用于這些細(xì)胞時(shí)，這些細(xì)胞相互作用的特點(diǎn)、效應(yīng)仍不清楚，還有待揭示。

三、MSCs來源的外泌體在自身免疫炎性疾病中的應(yīng)用

自身免疫炎性疾病是一種免疫應(yīng)答紊亂，免疫系統(tǒng)對機(jī)體自身組織抗原產(chǎn)生攻擊，造成組織長期處于慢性非細(xì)菌性炎癥狀態(tài)的疾病，具有較高的發(fā)病率并且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。以往應(yīng)用MSCs的免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制作用治療各種自身免疫炎性疾病的研究為MSCs來源外泌體在這一方面的研究提供了良好基礎(chǔ)。目前，利用MSCs來源的外泌體治療各種自身免疫炎性疾病的研究已經(jīng)逐步展開并取得了一定的療效，但各種報(bào)道還是基于各種動(dòng)物模型上，其基本情況見表1。從這些報(bào)道可知，用于治療的MSCs 外泌體既有來自于自身或者同一種屬的也有跨物種的（主要為人MSCs來源的外泌體應(yīng)用于各種自身免疫炎性疾病的動(dòng)物模型），這種同種異體和異種異體均沒有引起排異或過敏反應(yīng)，因此外泌體沒有免疫源性；在應(yīng)用方式方面，外泌體既有局部也有通過尾靜脈注射的全身應(yīng)用，無論何種方式，MSCs外泌體均取得了明顯的效果，但何種方式更優(yōu)，目前還沒有對比研究報(bào)道；在使用劑量上，目前MSCs 外泌體的定量都是根據(jù)所含蛋白質(zhì)的多少來確定，但從機(jī)制上可知，外泌體發(fā)揮作用并不一定是所含的蛋白分子，也有可能是所含的其他分子，例如在治療SD 大鼠燒傷時(shí)，MSCs 外泌體是通過miRNA-181c抑制信號(hào)通路TLR4 從而抑制巨噬細(xì)胞向促炎型M1型極化來發(fā)揮抗炎效應(yīng)[17]，因此在該情況下應(yīng)用外泌體所含蛋白質(zhì)的多少來確定使用劑量是不科學(xué)的；在機(jī)制上，MSCs 外泌體是通過所含的各種信號(hào)分子來影響免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)控和抗炎作用，但外泌體除了含有這些效應(yīng)分子，還含有多種其他分子，這些分子在治療中扮演著何種角色是未知的，需要進(jìn)一步探究。

表1 MSCs來源的外泌體在自身免疫炎性疾病中的研究進(jìn)展

四、總結(jié)與展望

雖然MSCs來源的外泌體在自身免疫炎性疾病方面顯示出良好的應(yīng)用前景，但是其廣泛應(yīng)用還存在著諸多挑戰(zhàn)。（1）MSCs種類多，包括：脂肪、骨髓和臍帶MSCs 等，它們來源的外泌體之間是否存在著差異，這種差異對免疫調(diào)控作用的影響有多大目前還不明確；（2）外泌體的提取方法較多，包括密度梯度離心、超速離心和超濾法等，每種方法對外泌體的純度、形態(tài)和功能均有影響，采用何種方法最優(yōu)目前沒有定論；（3）外泌體的功能在保存過程中會(huì)受到溫度、pH值、溶劑等的影響，何種保存條件最為理想，目前沒有標(biāo)準(zhǔn)；（4）外泌體、微囊泡和脂蛋白等成份在目前條件下很難全面的分離純化，它們的存在影響了外泌體功能的研究；（5）各個(gè)外泌體之間存在異質(zhì)性，如何調(diào)控MSCs 產(chǎn)生外泌體的過程并對外泌體進(jìn)行修飾，提高外泌體在自身免疫炎性疾病應(yīng)用中的一致性和靶向性還需要繼續(xù)研究。

MSCs來源的外泌體作為潛在替代MSCs細(xì)胞間傳遞信息的新型媒介，可通過影響非特異性免疫和獲得性免疫中的多種細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，是一種極具吸引力的治療自身免疫炎性疾病的新型生物療法。外泌體在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定，穿透能力強(qiáng)，在應(yīng)用中未見有不良反應(yīng)報(bào)道，也不像MSCs 本身的臨床應(yīng)用會(huì)涉及倫理等問題。盡管目前MSCs來源外泌體的研究尚處于起步階段，但初步研究結(jié)果揭示MSCs來源的外泌體與免疫系統(tǒng)中各種細(xì)胞的相互作用機(jī)制對于治療自身免疫炎性疾病意義重大。相信隨著外泌體制備工藝和修飾手段的不斷進(jìn)步以及對MSCs來源外泌體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的深入研究，MSCs來源的外泌體將為自身免疫炎性疾病的治療提供一種全新的手段。