李陽(yáng)春， 王昭萍??， 劉 劍， 馬培振

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2. 煙臺(tái)海益苗業(yè)有限公司，山東 煙臺(tái) 264000)

三倍體貝類(lèi)具有生長(zhǎng)快、風(fēng)味好、育性差、夏季死亡率低等優(yōu)勢(shì)[1-3]，自Stanley[4]利用細(xì)胞松弛素B(Cytochalasin B, CB)成功誘導(dǎo)美洲牡蠣(Crassostreavirginica)三倍體以來(lái)，三倍體育種已相繼在三十余種貝類(lèi)中開(kāi)展了研究。目前采用的誘導(dǎo)方法主要有物理法(靜水壓[5]、冷/熱休克[6])、化學(xué)法(CB，6-二甲基氨基嘌呤[7]，咖啡因[8])和生物法(二倍體和四倍體親本配合[9])。近年來(lái)，王昭萍等[10]研究顯示，低鹽作為一種新的三倍體誘導(dǎo)方式，具有誘導(dǎo)效果好，成本低、操作便捷、安全無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的推廣前景。

之前對(duì)于低鹽誘導(dǎo)三倍體的研究中，于瑞海[11]、孔靜[12]、陳宏發(fā)[13]等相繼給出了不同鹽度誘導(dǎo)條件下太平洋牡蠣(Crassostreagigas)受精卵的卵裂率、孵化率和三倍體率，同時(shí)應(yīng)用“孵化率×三倍體率”的值作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，判斷三倍體的誘導(dǎo)效果，從而得出最佳的誘導(dǎo)條件。然而，為了給生產(chǎn)實(shí)踐提供更好的理論依據(jù)，有必要對(duì)卵裂率和孵化率隨誘導(dǎo)鹽度的變化趨勢(shì)進(jìn)行進(jìn)一步分析，同時(shí)探索一種更為科學(xué)合理的綜合評(píng)價(jià)方法。

利用已有數(shù)據(jù)建立模型估測(cè)不同卵裂率、孵化率對(duì)應(yīng)的誘導(dǎo)鹽度，其原理與半數(shù)效量的估測(cè)類(lèi)似。半數(shù)效量廣泛應(yīng)用于評(píng)測(cè)外界脅迫的致死率[14]、致畸率[15]、致突變率[16](半數(shù)致死劑量，LD50)，及評(píng)斷藥物的有效劑量[17](半數(shù)有效劑量，ED50)，在貝類(lèi)中也被用來(lái)探究細(xì)菌感染、金屬沉積物等的危害[18-20]。統(tǒng)計(jì)學(xué)中可以通過(guò)概率單位加權(quán)回歸，得到脅迫程度(藥物劑量、細(xì)菌感染量等)和脅迫效果(有效率、死亡率等)之間的回歸曲線，從而反映不同脅迫條件下的致死效應(yīng)[21]，該回歸可利用Probit回歸分析實(shí)現(xiàn)[15]。

主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)是研究如何通過(guò)少數(shù)幾個(gè)主成分來(lái)解釋多個(gè)變量的分析方法。其通過(guò)正交變換將原變量進(jìn)行線性組合得到一組新變量(主成分)，使它們盡可能多地保留原始變量的信息，且彼此不相關(guān)，并選取少數(shù)幾個(gè)在變差總信息量中比例較大的主成分來(lái)進(jìn)行分析，從而達(dá)到減少變量的目的[22-23]。該方法十分適用于綜合分析多個(gè)因素，以探討三倍體的誘導(dǎo)效果。

本研究利用概率單位加權(quán)回歸法，分別得到了鹽度與卵裂率及鹽度與孵化率的回歸擬合，為估測(cè)特定卵裂率和孵化率對(duì)應(yīng)的誘導(dǎo)鹽度提供了模型，并應(yīng)用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)對(duì)該模型的可信性進(jìn)行了驗(yàn)證；同時(shí)利用主成分分析法，對(duì)不同誘導(dǎo)鹽度下的卵裂率、孵化率和三倍體率進(jìn)行了降維，抽取了兩個(gè)分別代表卵裂、孵化率和三倍體率的主成分，分別計(jì)算了主成分的得分和不同誘導(dǎo)鹽度的綜合得分，為探究三倍體最佳誘導(dǎo)條件提供了一種更加全面科學(xué)的評(píng)價(jià)方法。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用2齡種貝(殼長(zhǎng)8～14 cm)取自煙臺(tái)海益苗業(yè)有限公司，經(jīng)升溫促熟培育后待用。

1.2 方法

1.2.1 精卵獲取及受精 實(shí)驗(yàn)所用海水均為過(guò)濾自然海水，鹽度為30，水溫為23～25 ℃，器械每次操作前均使用淡水殺死精子，避免精子污染。挑選性腺發(fā)育程度較好的親貝，洗刷干凈后開(kāi)殼，解剖針挑取適量性腺鏡檢，區(qū)分雌雄。雌性親貝取卵，卵液先用300目篩絹過(guò)濾去除組織碎屑，后用1 000目篩絹以過(guò)濾海水沖洗2～3遍去除混入的組織液消化液等，不同親貝的卵液置于不同的100 mL燒杯內(nèi)，浸泡50 min促熟，鏡檢，選取卵子形狀近圓、卵內(nèi)物質(zhì)致密的卵液混合，濃縮卵液至700～800 mL，調(diào)整卵子密度為7 000～8 000個(gè)/mL[24]。受精前10 min解剖取精子，挑選精子活力高的精液，用300目篩絹過(guò)濾去除組織碎屑，以卵子∶精子=1∶5～1∶6的比例進(jìn)行受精[13]。

1.2.2 低鹽誘導(dǎo)處理及幼蟲(chóng)培養(yǎng) 40%～50%受精卵出現(xiàn)第一極體(PB1)時(shí)將受精卵液加入500 mL燒杯中，使得終鹽度分別為4，6，8，10，12，14，16和30，低鹽誘導(dǎo)15 min。后迅速轉(zhuǎn)入20 L桶中進(jìn)行培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)卵裂率、孵化率，24 h后收集D型幼蟲(chóng)，利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定三倍體率，染色劑為DAPI，流式細(xì)胞儀型號(hào)為FC500 MPL(Beckman Coulter, USA)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

卵裂率 = 卵裂卵數(shù)/受精卵總數(shù)×100%。

孵化率 = D形幼蟲(chóng)數(shù)/受精卵總數(shù)×100%。

三倍體率 = 三倍體D形幼蟲(chóng)數(shù)/(三倍體D形幼蟲(chóng)數(shù)+二倍體D形幼蟲(chóng)數(shù))×100%。

數(shù)據(jù)表示方法：平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)。

1.3 概率單位加權(quán)回歸及模型驗(yàn)證

1.3.1 概率單位加權(quán)回歸 采用SPSS 19.0中的Probit回歸對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行概率單位加權(quán)回歸，模型選擇概率模型，對(duì)回歸得到的結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化殘差分析，去除不適合進(jìn)行回歸直線擬合的數(shù)據(jù)，對(duì)剩下的數(shù)據(jù)進(jìn)行第二次Probit回歸，得到最終模型。

1.3.2 模型驗(yàn)證 根據(jù)Probit回歸得到的模型選擇若干合適的鹽度，按照1.2中的方法測(cè)定這些鹽度處理?xiàng)l件下的卵裂率及孵化率，采用SPSS 19.0中配對(duì)樣本T檢驗(yàn)的方法與模型擬合的卵裂率和孵化率進(jìn)行比較。

1.4 主成分分析

采用SPSS 19.0對(duì)卵裂率、孵化率和三倍體率進(jìn)行主成分分析，參照王芳[22]、李艷雙[23]等的方法，以累計(jì)方差貢獻(xiàn)率≥85%作為主成分的選取標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)以下公式計(jì)算綜合得分：

綜合評(píng)價(jià)指數(shù)=主成分1得分×主成分2的方差貢獻(xiàn)率+主成分2得分×主成分1的方差貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同鹽度誘導(dǎo)條件下的卵裂率、孵化率和三倍體率

由圖1可知，隨著誘導(dǎo)鹽度的增加，受精卵的卵裂率、孵化率也隨之增加，而三倍體率呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，且鹽度8時(shí)三倍體率最高，這與于瑞海、孔靜[11-12]等的結(jié)果一致。

圖1 不同鹽度誘導(dǎo)條件下的卵裂率、孵化率及三倍體率

2.2 卵裂率與鹽度及孵化率與鹽度的概率單位加權(quán)回歸

Pearson擬合度檢驗(yàn)可用來(lái)判斷曲線的擬合效果，其卡方值越小，R2值越接近1，擬合效果越好，由表1可知，該擬合的R2接近0，遠(yuǎn)小于1，說(shuō)明有顯著偏離曲線的點(diǎn)對(duì)數(shù)據(jù)的回歸擬合造成了干擾，因此對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化殘差分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。其中，調(diào)整的R2值越接近1，P值越小，說(shuō)明殘差回歸效果越好，數(shù)據(jù)的殘差越接近正態(tài)分布，擬合效果越好。

表1 卵裂率及孵化率的Pearson擬合度檢驗(yàn)

注：CR即卵裂率(cleavage rate)，HR即孵化率(hatching rate)。下同。

Note: CR refers to the cleavage rate, HR refers to the hatching rate. The same below.

圖2 卵裂率數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化殘差回歸分析

圖2中顯示，鹽度4的試驗(yàn)點(diǎn)，其標(biāo)準(zhǔn)化殘差小于-2，落在正態(tài)分布區(qū)間外，因此應(yīng)將其判定為異常試驗(yàn)點(diǎn)，不參與回歸擬合。同時(shí)，表2中顯示，將鹽度4及30的數(shù)據(jù)依次刪除之后，標(biāo)準(zhǔn)化殘差回歸的R2值增加至接近1，P值降低，表現(xiàn)為極顯著，說(shuō)明除鹽度4外，鹽度30亦為異常試驗(yàn)點(diǎn)，將這兩組數(shù)據(jù)刪除后，數(shù)據(jù)的殘差符合正態(tài)分布，擬合出的曲線可信性較高。

將卵裂率和孵化率中鹽度4、30組數(shù)據(jù)均刪除之后，對(duì)剩余數(shù)據(jù)進(jìn)行第二次Probit回歸分析，協(xié)變量(鹽度)選擇不進(jìn)行轉(zhuǎn)換、進(jìn)行以10為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換或自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。由表1可知，對(duì)于卵裂率來(lái)說(shuō)，對(duì)鹽度進(jìn)行以10為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換和進(jìn)行自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換得到的結(jié)果相同(卡方=1.135，R2=0.951)，且均優(yōu)于不對(duì)鹽度進(jìn)行轉(zhuǎn)換得到的結(jié)果(卡方=1.586，R2=0.903)，因此隨機(jī)采用對(duì)鹽度進(jìn)行以10為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換；對(duì)于孵化率來(lái)說(shuō)，不對(duì)鹽度進(jìn)行轉(zhuǎn)換得到的結(jié)果優(yōu)于對(duì)鹽度進(jìn)行以10為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換或自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的結(jié)果，因此本次回歸未對(duì)鹽度進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。概率回歸結(jié)果見(jiàn)表3、4和5。其中卵裂率為50%的誘導(dǎo)鹽度估計(jì)值為5.648，孵化率為50%的誘導(dǎo)鹽度估計(jì)值為8.644。

表2 卵裂率和孵化率的標(biāo)準(zhǔn)化殘差回歸

表3 卵裂率及孵化率與誘導(dǎo)鹽度的PROBIT模型構(gòu)建

注：PROBIT 模型: PROBIT(p-CR) = -1.578 + 2.099×鹽度以10為底轉(zhuǎn)換后的對(duì)數(shù)值; PROBIT(p-HR) = -0.851 + 0.098×鹽度。

Note: Probit model: PROBIT(p-CR) = -1.578 + 2.099×Log10(Salinity);PROBIT (p-HR) = -0.851 + 0.098 × Salinity.

表4 卵裂率與誘導(dǎo)鹽度的PROBIT回歸

注：表中黑體數(shù)據(jù)為了突出顯示該組數(shù)據(jù)，以方便讀者查閱，無(wú)特殊含義。下表同。

Note: Some data in the table are highlighted in boldface for convenience of reference only and shall not affect the construction or interpretation thereof. The same below.

表5 孵化率與誘導(dǎo)鹽度的PROBIT回歸

2.3 概率單位加權(quán)回歸模型的驗(yàn)證

由于Probit回歸分析采用的鹽度范圍是6～18，因此驗(yàn)證鹽度的選擇范圍也應(yīng)為6～18，因此，根據(jù)表4和5的結(jié)果，卵裂率選擇的驗(yàn)證鹽度及其對(duì)應(yīng)估計(jì)百分比分別為：7.5/60%，10.0/70%，14.2/80%；孵化率選擇的驗(yàn)證鹽度及其對(duì)應(yīng)估計(jì)百分比分別為：6.1/40%，8.6/50%，11.2/60%，14.0/70%，17.2/80%。驗(yàn)證結(jié)果如表6所示。

表6 不同誘導(dǎo)鹽度下觀測(cè)值與回歸模型估計(jì)值的比較

由表6可得，所有組別的P值均大于0.05，說(shuō)明估計(jì)值和觀測(cè)值之間不存在顯著差異，即該模型對(duì)不同誘導(dǎo)鹽度下卵裂率和孵化率的估計(jì)較為可信。因此，生產(chǎn)實(shí)踐中可參考表4和5的結(jié)果，根據(jù)鹽度與卵裂率、孵化率的關(guān)系選擇更為合適的誘導(dǎo)鹽度。

2.4 綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)計(jì)算

前人的研究往往采用將孵化率與三倍體率的乘積作為綜合指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)誘導(dǎo)效果，然而生產(chǎn)實(shí)踐中需考慮的評(píng)價(jià)因素不僅只有孵化率與三倍體率，卵裂率、附著變態(tài)率、生長(zhǎng)速度、抗逆性等因素都應(yīng)當(dāng)列入最優(yōu)誘導(dǎo)條件評(píng)價(jià)體系中，主成分分析作為一種能同時(shí)考慮多種影響因素的評(píng)價(jià)方法，對(duì)于誘導(dǎo)條件的選擇是很有意義的。

2.4.1 卵裂率、孵化率與鹽度的主成分分析 由于本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不存在量綱及數(shù)量級(jí)的區(qū)別，因此卵裂率、孵化率和三倍體率的數(shù)據(jù)無(wú)需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，可直接進(jìn)行主成分分析。

主成分分析共抽取了三個(gè)主成分，其方差貢獻(xiàn)率分別是73.62%，26.16%和0.22%，為了能夠盡可能多地保留原始變量的信息，主成分的選取通常遵循“累計(jì)方差貢獻(xiàn)率≥85%”的標(biāo)準(zhǔn)。按照該標(biāo)準(zhǔn)，我們選取了前兩個(gè)主成分用于綜合指數(shù)的計(jì)算，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為99.78% (見(jiàn)表7)。對(duì)于主成分1，它在卵裂率與孵化率上的特征向量分別為0.936/0.986，而在三倍體率上的特征向量為負(fù)值(-0.600)，說(shuō)明主成分1主要反映了卵裂率和孵化率這兩個(gè)原始變量；而主成分2在三倍體率上的特征向量(0.800)則顯著高于在卵裂、孵化率上的特征向量(0.348、0.157)，說(shuō)明主成分2主要反映的是三倍體率這個(gè)原始變量，也就是說(shuō)主成分1和主成分2很好的反映了所有的原始變量，成功地達(dá)到了減少變量的目的。

表7 提取主成分的負(fù)荷及其方差貢獻(xiàn)率

2.4.2 綜合評(píng)價(jià)指數(shù) 根據(jù)這兩個(gè)主成分的特征值、特征向量及方差貢獻(xiàn)率得出的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)見(jiàn)表8。結(jié)果顯示，隨著鹽度的增加，誘導(dǎo)的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)先升后降，在鹽度為8時(shí)達(dá)到最大值(0.67)，這與之前的研究結(jié)果一致，說(shuō)明鹽度8的確為適宜的誘導(dǎo)鹽度。然而通過(guò)該表格還可以看出，鹽度10的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)也較高(0.54)，與鹽度8相比，表現(xiàn)出更高的卵裂、孵化率(PC1: 0.04>-0.53)和較低的誘導(dǎo)效果(PC2: 0.72<1.09)。因此，生產(chǎn)實(shí)踐中可以根據(jù)實(shí)際需要選擇誘導(dǎo)鹽度為8(更高的誘導(dǎo)率)或10(更高的存活率)。當(dāng)然，僅根據(jù)卵裂率、孵化率和三倍體率得出的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)是不全面的，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供不同誘導(dǎo)鹽度條件下幼蟲(chóng)的存活、附著及后續(xù)的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，以期得到更為完善的評(píng)價(jià)體系，為生產(chǎn)實(shí)踐提供科學(xué)的指導(dǎo)。

表8 不同誘導(dǎo)鹽度條件下的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)

3 結(jié)語(yǔ)

本研究通過(guò)對(duì)卵裂率、孵化率與鹽度進(jìn)行概率加權(quán)回歸擬合和主成分分析，為低鹽誘導(dǎo)太平洋牡蠣三倍體提供了可參考模型與更科學(xué)的綜合評(píng)價(jià)方法。Probit模型提供了不同誘導(dǎo)鹽度下卵裂率與孵化率的估計(jì)值，要達(dá)到50%卵裂率和50%孵化率的誘導(dǎo)鹽度應(yīng)分別大于5.648和8.644。主成分分析得出了各誘導(dǎo)鹽度的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)，其中鹽度8，10評(píng)價(jià)指數(shù)最高，鹽度8誘導(dǎo)率最高但存活率相對(duì)較低，鹽度10誘導(dǎo)率稍低但存活率較高，在生產(chǎn)實(shí)踐中根據(jù)具體需要，選擇更好的誘導(dǎo)效果或更高的存活率。