陳永濤 柯崇榕 楊欣偉 黃建忠

摘?要：四氫嘧啶是天冬氨酸的環(huán)狀氨基酸衍生物，廣泛應用于化妝品、食品、藥品等領域。通過比較了5個不同來源的四氫嘧啶合成基因簇ectABC，發(fā)現(xiàn)從專性嗜堿芽孢桿菌（Bacillus pseudofirmus OF4）來源的基因簇整合到大腸桿菌BW25113中后，得到的重組菌pYB1s-BPectABC/BW25113產四氫嘧啶能力最好。利用單因素試驗初步優(yōu)化了pYB1s-BPectABC/BW25113全細胞催化條件： 以100 mmol·L-1天冬氨酸鈉和100 mmol·L-1甘油為底物，在100 mmol·L-1 KCl的轉化液（pH=7.0）中，30℃下反應24 h，最終四氫嘧啶的產量可達3.10 g·L-1，轉化產率達到0.129 g·L-1·h-1。本研究初步得到了四氫嘧啶合成重組菌pYB1s-BPectABC/BW25113，為后續(xù)四氫嘧啶的研究奠定了基礎。

關鍵詞：四氫嘧啶;全細胞催化;天冬氨酸鈉;大腸桿菌;重組

中圖分類號：TQ922.2?文獻標志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）10-0010-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.10.002

Abstract： Ectoine is a cyclic amino acid derivative of aspartic acid， which is widely used in the fields such as cosmetics， food， medicine and so on. In this paper， by comparing the synthetic gene clusters ectABC of ectoine from five different sources， it was found that the recombinant strain pYB1s-BPectABC/BW25113 obtained from Bacillus pseudofirmus OF4 had the best ability to produce ectoine when it was integrated into Escherichia coli BW25113. The conditions for whole-cell catalysis of pYB1s-BPectABC/BW25113 were preliminarily optimized by single factor experiment： the pYB1s-BPectABC/BW25113 was reacted with 100 mmol·L-1 sodium aspartate and 100 mmol·L-1 glycerine as the substrates in the conversion solution （pH=7.0） of 100 mmol·L-1 KCl for 24 h at 30℃， and the final production of ectoine reached 3.10 g·L-1， and the transformation efficiency reached 0.129 g·L-1·h-1. In this experiment， the ectoine synthetic recombinant strain pYB1s-BPectABC/BW25113 was preliminarily obtained， which laid a foundation for the subsequent researches on ectoine.

Key words： Ectoine;Whole-cell catalysis;Sodium aspartate;Escherichia coli;Recombinant

四氫嘧啶，化學名為1，4，5，6四氫2甲基4嘧啶羧酸，是天冬氨酸的環(huán)狀氨基酸衍生物[1]。四氫嘧啶廣泛存在于嗜鹽或耐鹽的細菌域或古菌域中，是一種對極端溫度、高滲透壓和干燥等極端環(huán)境具有保護性作用的電解質物質[2]。四氫嘧啶因其獨特的保護特性被廣泛應用于化妝品、食品及藥品等領域，包括防止皮膚老化和細胞損傷的化妝品添加劑[3]，保護蛋白質的穩(wěn)定劑[4]、PCR反應的增強劑[5]、微生物的干燥保護劑[6]，以及治療阿爾茲海默癥[7]、過敏性鼻炎[8]、特應性皮炎[9]、結腸炎[10]和肺部炎癥

[11]等疾病的藥物成分。目前四氫嘧啶的交易價格在1000美元·kg-1，是市場上的高價商品[12]。因此，四氫嘧啶成為當下的研究熱點之一。四氫嘧啶的生物合成途徑最初是在1990年，由Peters等[13]在延長鹽單胞菌Halomonas elongata中通過同位素標記以及核磁共振（NMR）方法發(fā)現(xiàn)的。它是從合成天冬氨酸家族氨基酸的中心代謝樞紐物質L天冬氨酸β半醛（LASA）開始，由四氫嘧啶3個獨特的酶[L2，4二氨基丁酸轉氨酶（EctB;EC 2.6.1.76），L2，4二氨基丁酸乙酰轉移酶（EctA;EC 2.3.1.178）和四氫嘧啶合成酶（EctC;EC 4.2.1.108）]介導，通過轉氨、乙酰化和分子內縮合三步反應合成了四氫嘧啶[13-15]。

當前，四氫嘧啶的生產方法以微生物發(fā)酵法為主，微生物發(fā)酵法又分為直接發(fā)酵法和全細胞催化法[16-17]。直接發(fā)酵法生產四氫嘧啶常用的工程菌有嗜鹽或耐鹽細菌以及異源細菌大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌[18-20]，而全細胞催化法主要使用大腸桿菌[21-22]。與直接發(fā)酵法相比，全細胞催化法可以避免嗜鹽或耐鹽細菌帶來的高鹽誘導問題，不存在對發(fā)酵罐及相關設備的腐蝕，具有反應條件溫和的優(yōu)勢;全細胞催化使用大腸桿菌，相比于其他細菌更易于培養(yǎng)和實現(xiàn)產業(yè)化[19];此外，全細胞催化法生產四氫嘧啶還具有雜質含量少、產物易于分離純化、菌體可以重復利用等優(yōu)點，因此全細胞催化法合成四氫嘧啶近年來備受推崇[22]。本研究擬以價格低廉，易于獲得的天冬氨酸鈉和甘油為底物，合成高價值的四氫嘧啶。通過以大腸桿菌BW25113為底盤細胞，構建了合成四氫嘧啶的工程菌株，并對該工程菌株的全細胞催化條件進行了優(yōu)化，獲得高產四氫嘧啶的菌株及優(yōu)化條件，為四氫嘧啶的產業(yè)化奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

1.1.1?主要試劑?質粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;Gibson酶購自NEB（北京）有限公司;胰蛋白胨和酵母提取粉購自英國Oxoid公司;L天冬氨酸、L阿拉伯糖和氫氧化鈉購自中國國藥集團有限公司;鏈霉素購自生工（上海）生物工程有限公司;冰醋酸和乙酸鈉西隴化工股份有限公司;其余均是分析純試劑。

1.1.2?質粒、菌株及培養(yǎng)基?質粒pYB1s、菌株大腸桿菌BW25113均來自本實驗保藏。LB培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g。ZYM自誘導培養(yǎng)基（1 L）：955 mL ZY培養(yǎng)基，20 mL 50×5052，20 mL 50×M，10 mL 20%阿拉伯糖，200 μL 1000×微量元素，200 μL 1 mol·L-1硫酸鎂，1 mL鏈霉素。ZY培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g。50×5052（1 L）：25%甘油，2.50%葡萄糖。50×M（1 L）：1.25 mol·L-1磷酸二氫鈉，1.25 mol·L-1磷酸二氫鉀，2.5 mol·L-1氯化銨，0.25 mol·L-1硫酸鈉。1000×微量元素：50 mmol·L-1氯化高鐵，20 mmol·L-1氯化鈣，10 mmol·L-1氯化錳，10 mmol·L-1硫酸鋅，2 mmol·L-1氯化鈷，2 mmol·L-1氯化銅，2 mmol·L-1氯化鎳，2 mmol·L-1鉬酸鈉，2 mmol·L-1硼酸。

1.2?儀器與設備

貝克曼J26冷凍離心機購自美國貝克曼有限公司;waters高效液相購自沃特世科技（上海）有限公司;UV1800分光光度計購自日本島津公司;自動凝膠成像系統(tǒng)JS68D購自上海培清科技有限公司;蛋白電泳儀購自美國Bio-rad公司;恒溫培養(yǎng)箱購自上海智誠分析儀器有限公司。

1.3?試驗方法

1.3.1?重組表達質粒的構建?在NCBI上查找得到專性嗜堿芽孢桿菌Bacillus pseudofirmus OF4、伸長鹽單胞菌Halomonas elongata ATCC 33173、施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri A1501、支氣管敗血波氏桿菌Bordetella bronchiseptica S798、擬態(tài)弧菌Vibrio mimicus SCCF01等5株菌的四氫嘧啶合成基因簇ectABC序列，委托上海生物工程公司進行合成，通過Gibson酶將目的基因與質粒pYB1s連接構建5個重組質粒，分別轉化到大腸桿菌BW25113感受態(tài)細胞中，獲得pYB1s-BPectABC/BW25113（ectABC基因簇來源于B.pseudofirmus）、pYB1s-HEectABC/BW25113（ectABC基因簇來源于H.elongata）、pYB1s-PSectABC/BW25113（ectABC基因簇來源于P.stutzeri）、pYB1s-BBectABC/BW25113（ectABC基因簇來源于B.bronchiseptica）和pYB1s-VMectABC/BW25113（ectABC基因簇來源于V.mimicus）5株重組菌。

1.3.2?目的基因的誘導表達?挑單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中37℃、220 r·min-1培養(yǎng)8～9 h，再按1%接菌量轉接至ZYM自誘導培養(yǎng)基中，30℃、220 r·min-1自誘導培養(yǎng)18 h。以菌體（OD600 nm=10）經(jīng)0.9%氯化鈉洗滌2次后破碎離心，取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。

1.3.3?全細胞催化?自誘導18 h后，通過在8000 r·min-1離心5 min收集菌體，用0.9%氯化鈉溶液洗滌2次，然后再懸浮在含有100 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）、50 mmol·L-1天冬氨酸鈉、100 mmol·L-1 KCl和100 mmol·L-1甘油的反應轉化液中，形成細胞懸浮液（OD600 nm=10）。使用50 mL三角瓶中裝10 mL細胞懸浮液在30℃，220 r·min-1，進行催化試驗，分別取0、3、6、9、21、24 h的轉化液1 mL，12000 r·min-1離心1 min，取上清用0.22 μm濾膜過濾完待液相檢測（設置3組平行試驗）。

1.3.4?全細胞催化體系的優(yōu)化?為了優(yōu)化轉化液的組分，在全細胞催化試驗中比較了不同濃度的天冬氨酸鈉 （50、100、150、200和300 mmol·L-1）對四氫嘧啶生產的影響，獲得最適天冬氨酸鈉濃度之后，在最適的天冬氨酸鈉濃度下，比較了不同濃度的甘油（50、100、150、200和300 mmol·L-1），以及KCl （0、50、100、200和300 mmol·L-1）對四氫嘧啶生產的影響;為了評估溫度對四氫嘧啶生產的影響，分別在25、30、35、40、45℃下pH 7.0時進行催化試驗;為了評估pH的影響，將反應轉化液調節(jié)至pH為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，并在30℃進行催化試驗（設置3組平行試驗）。

1.3.5?四氫嘧啶的檢測方法?四氫嘧啶檢測采用XBridge Amide色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），檢測波長為210 nm，柱溫40℃，流速0.8 mL·min-1，流動相配比為75%乙腈和25%甲酸水（含0.1%甲酸）。

2?結果與分析

2.1?目的基因的表達

5株重組大腸桿菌經(jīng)SDS-PAGE分析，結果見圖1。在5株重組大腸桿菌中，EctA的條帶在20 kDa左右，EctB的條帶在44 kDa 左右，EctC的條帶在18 kDa 左右，SDS-PAGE結果與B.pseudofirmus、H.elongata、P.stutzeri、B.bronchiseptica、V.mimicus預測的EctA、EctB和EctC分子質量大小非常相近。此外，通過比較上清液與沉淀，可知上清液中蛋白條帶非常明顯，而沉淀中蛋白條帶不明顯，說明大部分蛋白都是可溶性蛋白，此外，也可分析出重組pYB1s-BPectABC/BW25113的EctB表達最好。試驗結果表明了四氫嘧啶合成基因成功在大腸桿菌BW25113中表達。

2.2?重組大腸桿菌BW25113的篩選

5株重組菌在50 mmol·L-1天冬氨酸鈉、100 mmol·L-1甘油和100 mmol·L-1 KCl的100 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）轉化液中，在溫度30℃下進行全細胞催化24 h，結果如圖2。

如圖2所示，重組大腸桿菌pYB1s-BPectABC/BW25113、pYB1s-HEectABC/BW25113、 pYB1s-PSectABC/BW25113、pYB1s-BBectABC/BW25113和pYB1s-VMectABC/BW25113催化24 h四氫嘧啶產量分別為1.79、1.41、0.21、0.92、0.78 g·L-1，結果表明不同來源的ectABC簇構建的工程菌株生產四氫嘧啶，產量之間有顯著的差異，其中，重組大腸桿菌pYB1s-BPectABC/BW25113表現(xiàn)出最高的轉化效率（0.074 g·L-1·h-1）和四氫嘧啶產量（1.79 g·L-1）。因此，選擇最高產量的pYB1s-BPectABC/BW25113作為產四氫嘧啶的出發(fā)菌株，進一步優(yōu)化其產四氫嘧啶的反應條件。

2.3?全細胞催化體系的優(yōu)化

2.3.1?天冬氨酸鈉對四氫嘧啶產量的影響?天冬氨酸鈉是四氫嘧啶合成的底物，其濃度影響四氫嘧啶產量的因素之一。因此，首先考察了不同濃度的天冬氨酸鈉對合成四氫嘧啶的影響。如圖3所示，隨著天冬氨酸鈉濃度的提高，四氫嘧啶產量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。天冬氨酸鈉為100 mmol·L-1時，四氫嘧啶產量最高，為3.06 g·L-1， 提高天冬氨酸鈉濃度到150、200 mmol·L-1時，四氫嘧啶產量沒有進一步提高，當天冬氨酸鈉濃度為300 mmol·L-1時，僅有1.57 g·L-1四氫嘧啶產生。因此，最佳的天冬氨酸鈉濃度為100 mmol·L-1。

2.3.2?甘油對四氫嘧啶產量的影響?甘油可以為EctA催化中乙酰輔酶A的產生提供底物和能量，是影響四氫嘧啶合成的因素之一。因此，進一步考察了甘油對合成四氫嘧啶的影響。如圖4所示，隨著甘油濃度的提高，四氫嘧啶產量呈現(xiàn)先升高再趨于平穩(wěn)后降低的趨勢。甘油為100 mmol·L-1和150 mmol·L-1時，四氫嘧啶產量最高，約為3.08 g·L-1， 提高甘油濃度到200 mmol·L-1以上時，四氫嘧啶產量下降，進一步提高甘油濃度為300 mmol·L-1時，僅有1.61 g·L-1四氫嘧啶產生。因此，最佳的甘油濃度為100 mmol·L-1。

2.3.3?KCl對四氫嘧啶產量的影響?KCl具有穩(wěn)定EctB活性的作用，為了解KCl對四氫嘧啶產量的影響，試驗考察了不同濃度的KCl對合成四氫嘧啶的影響。如圖5所示，隨著KCl濃度的提高，四氫嘧啶產量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在KCl濃度為100 mmol·L-1，此時四氫嘧啶產量達到最大3.07 g·L-1，當不存在KCl時或在較高的KCl濃度（300 mmol·L-1）下，四氫嘧啶產量顯著降低。因此，最佳的KCl濃度為100 mmol·L-1。

2.3.4?溫度對四氫嘧啶產量的影響?溫度是影響酶活性的重要因素之一，因此試驗考察了溫度對合成四氫嘧啶的影響。如圖6所示，隨著溫度的提高，四氫嘧啶產量呈現(xiàn)先升高再趨于平穩(wěn)后下降趨勢。溫度的最適范圍是30～35℃，在此溫度范圍內，可以催化合成四氫嘧啶約3.08 g·L-1。當溫度高于40℃后產量急劇下降，45℃時四氫嘧啶產量僅為1.27 g·L-1。因此，為了節(jié)約成本，最佳溫度為30℃。

2.3.5?pH對四氫嘧啶產量的影響?除溫度外，pH也是影響酶活性的重要因素之一，因此試驗考察了pH對合成四氫嘧啶的影響。如圖7所示，隨著pH的提高，四氫嘧啶產量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當pH為7.0，此時四氫嘧啶產量達到最高（3.10 g·L-1）。然而當pH高于7.5后產量急劇下降，pH為8.0時，四氫嘧啶產量僅為1.89 g·L-1。因此，最佳pH為7.0。

3?結論與討論

四氫嘧啶的合成途徑在多種好氧異養(yǎng)細菌中都存在，如鹽紅酵母屬、鹽單胞菌屬、嗜色鹽桿菌屬、弧菌屬、γ蛋白細菌類假單胞菌，甚至古生菌亞硝基藻或嗜堿甲氧菌等[18，23-24]。本研究以大腸桿菌BW25113為底盤細胞構建了5株四氫嘧啶合成菌株，并從中篩選出具有四氫嘧啶合成能力的工程菌株pYB1s-BPectABC/BW25113，其ectABC基因簇來源于Bacillus pseudofirmus OF4。為進一步提高四氫嘧啶的產量，本研究利用單因素試驗探討了天冬氨酸鈉濃度、甘油濃度、KCl濃度、催化溫度及pH等反應因素對四氫嘧啶產量的影響，最終在100 mmol·L-1天冬氨酸鈉、100 mmol·L-1甘油和100 mmol·L-1 KCl轉化液中，反應溫度為30℃，反應pH 為7.0，反應24 h，四氫嘧啶的產量可達3.10 g·L-1，轉化產率達到0.129 g·L-1·h-1。經(jīng)初步優(yōu)化后，pYB1s-BPectABC/BW25113催化合成四氫嘧啶的轉化效率比優(yōu)化前提高1.73倍，表明優(yōu)化反應條件能夠提高四氫嘧啶的產量。本研究為產四氫嘧啶工程菌的進一步代謝工程改造和實現(xiàn)產業(yè)化奠定基礎。但是仍然存在一些問題需要解決和研究，如EctA、EctB和EctC 3種蛋白表達量存在明顯差異，是否是限制四氫嘧啶產量提高的重要因素之一;重組菌pYB1s-BPectABC/BW25113的表達及四氫嘧啶的轉化等未進行放大試驗;四氫嘧啶的分離純化等也未研究。

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（責任編輯：柯文輝）