原 翔，劉怡文，孫 蔚，孔金玉，張 灝，高社干

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，每年發(fā)病人數(shù)約22萬，死亡人數(shù)約19萬[1]。其中90% 以上為食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[2]，河南省林州市、輝縣、安陽等地是我國食管癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)[3]。多數(shù)患者確診時已屬晚期或伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，5 a生存率極低[4]。目前，雖然對食管癌治療方面的研究已取得了很大進(jìn)展，但仍沒有有效的治療方法。多年來，學(xué)者們一直致力于食管癌分子靶向治療研究，以預(yù)測其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后情況。

糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase 3,GSK3)是一個廣泛表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括GSK3α和GSK3β兩種亞型。二者具有85%的同源性，催化結(jié)構(gòu)域具有93%同源性，但在哺乳動物中執(zhí)行不同的功能[3]。GSK3β是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵激酶之一，主要參與慢性炎癥的調(diào)控，并與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-15]。本研究采用Wound-healing、Transwell、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法檢測GSK3β對食管癌KYSE450細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，并分析其調(diào)控作用及意義，為食管鱗癌的分子靶向治療提供新的靶點(diǎn)和思路,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑食管癌KYSE450細(xì)胞系(上海博古生物細(xì)胞所)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；胰酶、青鏈霉素(中國索萊寶公司)；慢病毒包裝試劑盒(美國selleck公司)。

1.2 細(xì)胞系培養(yǎng)常規(guī)細(xì)胞系培養(yǎng)：食管癌KYSE450細(xì)胞系，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；2～3 d換液、傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 慢病毒載體包裝常規(guī)培養(yǎng)293T細(xì)胞，密度至50%～60%時，開始轉(zhuǎn)染。配制“DNA質(zhì)粒-EndoFectin”混合物，室溫放置30 min。將混合物加入293T細(xì)胞，5%CO2、37 ℃恒溫箱孵育8～14 h，向培養(yǎng)基中加入1/500體積的“Titer Boost”。分別于48、96 h收獲病毒，將細(xì)胞上清至0.45 μm濾器去除細(xì)胞碎片，取上清(立即進(jìn)行感染)。將目的細(xì)胞鋪板，待密度長至50%～60%時，直接加入含病毒的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染病毒后，每天在熒光顯微鏡下觀察信號。待視野中大部分細(xì)胞都帶有熒光時，用嘌呤霉素或潮霉素進(jìn)行篩選。提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4 Western blot方法檢測GSK3β蛋白敲降效率將對數(shù)生長期的KYSE450細(xì)胞消化下來后，分成兩組，即450-GFP(對照組)與450-1(GSK3β敲降組)應(yīng)用慢病毒包裝試劑盒進(jìn)行GSK3β蛋白敲降處理，并篩選穩(wěn)定細(xì)胞系。然后將兩組細(xì)胞提取新鮮蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western blot檢測GSK3β的表達(dá)。具體步驟為：提取細(xì)胞蛋白質(zhì)后，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量(康為公司)。用10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行上層膠恒壓90 V 30 min，下層膠恒壓120 V 60 min電泳，切膠后采用“三明治夾心法”，恒壓90 V 150 min轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，TBST 清洗1次，每次30 s，加入GSK3β兔一抗(1∶1 000，Abcam)和內(nèi)參GAPDH(1∶2 000，康為公司)4 ℃過夜，TBST清洗3次，每次5 min，加入兔二抗(1∶2 000，康為公司)室溫孵育2 h，再用TBST漂洗3次，每次5 min，采用ECL(美國Invitrogen公司)檢測目的蛋白條帶，凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)采集圖像并進(jìn)行定量分析。

1.5 細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)①通過Wound-healing實(shí)驗(yàn)比較各組細(xì)胞不同時間點(diǎn)遷移面積的大小。將對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后制成5×103·mL-1的單細(xì)胞懸液，分為兩組，450-GFP(對照組)與450-1(GSK3β敲降組)，分別于0 h和24 h對同一位置細(xì)胞拍照，比較兩組細(xì)胞24 h遷移面積。應(yīng)用Image J軟件測量不同時間點(diǎn)劃痕內(nèi)空白面積的大小，并用以下公式計(jì)算遷移面積：遷移面積(n h)=空白面積(0 h)-空白面積(n h)，進(jìn)而比較各組細(xì)胞不同時間點(diǎn)遷移面積的大小，采用t檢驗(yàn)，分析各組之間差異，檢測腫瘤細(xì)胞的體外遷移能力。②通過Transwell實(shí)驗(yàn)比較各組細(xì)胞降解基質(zhì)，向深層侵襲的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)分為450-GFP(對照組)與450-1(GSK3β敲降組)，每組鋪2個平行對照，分別于16 h和24 h固定1組細(xì)胞拍照并計(jì)數(shù)穿過下層膠細(xì)胞數(shù)量，采用t檢驗(yàn)，分析各組之間差異，檢測腫瘤細(xì)胞的體外侵襲能力。③通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞形成單克隆的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)分為450-GFP(對照組)與450-1(GSK3β敲降組)，設(shè)置兩個細(xì)胞鋪板密度，分別于6孔板中鋪入500個細(xì)胞和1 000個細(xì)胞，采用t檢驗(yàn)，分析各組之間差異，檢測腫瘤細(xì)胞的體外增殖及克隆形成能力。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。Wound-healing、Transwell、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析采用配對樣本t檢驗(yàn)。以GrapPad Prism5.0統(tǒng)計(jì)繪圖軟件處理、分析數(shù)據(jù)、繪制圖形。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot方法檢測GSK3β蛋白敲降效率通過Western blot檢測GSK3β蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，450-1(GSK3β敲降組)組中GSK3β蛋白表達(dá)被顯著抑制。

圖1 Western blot顯示敲降組中GSK3β蛋白表達(dá)顯著被抑制

2.2 Wound-healing實(shí)驗(yàn)通過Wound-healing實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞的體外遷移能力。結(jié)果顯示，與450-GFP(對照組)相比，450-1(GSK3β敲降組)細(xì)胞24 h遷移面積顯著變小(t=11.66，P<0.05，圖2)，其體外遷移能力明顯減弱。

圖2 GSK3β對食管癌細(xì)胞系遷移能力的影響

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測GSK3β對食管癌細(xì)胞系侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，與450-GFP(對照組)相比，450-1(GSK3β敲降組)16 h(t=3.31，P<0.05，圖3)及24 h(t=4.80，P<0.05，圖3)穿過下層膠細(xì)胞數(shù)目顯著減少，其體外侵襲能力明顯減弱。

圖3 GSK3β對食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響

2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測GSK3β對食管癌細(xì)胞系體外克隆增殖能力的影響，結(jié)果顯示，與450-GFP(對照組)相比， 450-1(GSK3β敲降組)500個細(xì)胞(t=8.69，P<0.05，圖4)和1 000個細(xì)胞(t=6.85，P<0.05，圖4)的細(xì)胞克隆數(shù)均顯著減少，其細(xì)胞克隆增殖能力明顯減弱。

3 討論

GSK3β是多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的一種，不僅可通過抑制磷酸化糖原合酶的活性升高機(jī)體血糖濃度，還可通過調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子的活性/穩(wěn)定性(如AP-1、NF-κB、c-Myc、β-catenin、P53和STATs)而參與多種腫瘤相關(guān)病理過程，包括細(xì)胞增生、分化、遷移、凋亡、黏附及產(chǎn)生炎癥因子等。因此，GSK3β與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。然而，GSK3β在腫瘤發(fā)生及演進(jìn)過程中的作用，目前報(bào)道不一。在骨肉瘤、肝癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、白血病等腫瘤中能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，而在肺癌、口腔癌、皮膚癌、乳腺癌中，則可抑制腫瘤惡性進(jìn)展[5-13]。

圖4 GSK-3β對食管癌細(xì)胞系克隆增殖能力的影響

本研究通過Wound-healing、Transwell、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法檢測GSK3β對食管癌KYSE450細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，發(fā)現(xiàn)在食管癌KYSE450細(xì)胞系中，對GSK3β進(jìn)行下調(diào)時，其遷移、侵襲及克隆增殖方面惡性生物學(xué)行為顯著減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Li RL等[14]檢測GSK3β在前列腺癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GSK3β表達(dá)與前列腺癌臨床病理分期、Gleason評分及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，表明GSK3β高表達(dá)與前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移及惡性進(jìn)展相關(guān)。周曉波等[15]檢測GSK3β在正常食管上皮及食管癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GSK3β在食管癌組織中表達(dá)明顯升高，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示GSK3β高表達(dá)與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移及惡性進(jìn)展相關(guān)。上述兩項(xiàng)研究均與本研究結(jié)果有一致性，即GSK3β高表達(dá)可顯著促進(jìn)腫瘤遷移、侵襲等方面惡性生物學(xué)進(jìn)展。但本研究更深入探討了敲降GSK3β后，食管癌細(xì)胞KYSE450體外遷移、侵襲及克隆增殖方面惡性生物學(xué)行為顯著減弱，更明確了GSK3β可能為食管癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在食管癌細(xì)胞KYSE450中，對GSK3β進(jìn)行下調(diào)時，其遷移、侵襲及克隆增殖方面惡性生物學(xué)行為均顯著減弱。抑制GSK3β的表達(dá)能顯著抑制食管癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，提示GSK3β可能成為食管癌治療的新指標(biāo)，并為食管癌的治療提供新的靶點(diǎn)。