趙世杰，原 翔，劉怡文，楊海軍，張耀文，馮連杰，周福有

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)是目前研究廣泛且證據(jù)充足的重要牙周致病菌之一?？谇籔g感染與口腔鱗癌的相關性研究較多，已證明其與口腔鱗癌的發(fā)病呈正相關[1-2]。Gao等研究首次發(fā)現(xiàn)Pg感染與食管鱗癌的相關性[3]，提出酸性環(huán)境的變化對Pg的定植影響顯著[4]。Pg在口腔、食管上、中、下段鱗癌組織中的定植分布狀況如何？自上而下是否也有一定規(guī)律？其與患者臨床病理特征及預后是否相關？本研究就針對上述問題研究總結(jié)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集安陽市腫瘤醫(yī)院(河南科技大學第四附屬醫(yī)院)口腔鱗癌及食管鱗癌術后石蠟組織207例，分為4組，口腔、食管胸上、中、下段鱗癌分別為50、50、57和50例?；颊呦鄳R床病理資料均來自病歷資料。納入標準：R0切除，T1-3NxM0。排除標準：術前行新輔助治療(放療、化療、放化療)，術前1個月內(nèi)行抗炎治療。該項目經(jīng)過安陽市腫瘤醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.2 方法所有鱗癌石蠟組織4 μm厚連續(xù)切片，免疫組織化學SP法染色觀察。免疫組化SP超敏試劑盒購于中杉金橋公司，HRP標記山羊抗兔IgG抗體購于康為公司，山羊抗兔IgG(H+L)熒光抗體購于CST公司。

1.3 結(jié)果評估隨機挑選5個高倍鏡視野(400倍)，根據(jù)切片胞質(zhì)及胞核著色的陽性細胞數(shù)以及著色面積進行評分，對組織切片的染色強度和染色面積進行半定量分析； 染色強度評分標準為：0分，未著色，陰性；1分，著色較弱，呈淺黃色，弱陽性；2分，中性著色，呈棕黃色，中度陽性；3分，著色較強，呈棕褐色，強陽性；染色面積評分標準為：陽性細胞0%～5%，0分；陽性細胞6%～25%，1分；陽性細胞25%～75%，2分；陽性細胞超過75%，3分；免疫組化評分計算方法：總得分=染色強度×染色面積。0分，陰性(-)；1～3分，弱陽性(+)；4～8分，中陽性(++)；9～12分，強陽性(+++)。實驗結(jié)果統(tǒng)計標準：0分為陰性，>1分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法使用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以百分率(%)表示，Pg在不同組陽性率及與臨床病理特征的比較采用χ2檢驗，Kaplan-Meier方法繪制生存曲線并以Log-rank檢驗生存時間之間的差異。隨訪時間至2018年底, 以死亡為終點事件，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4組免疫組化染色結(jié)果分析4組均有陽性表達率，Pg的陽性定位主要在鱗癌細胞的胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。口腔鱗癌組普遍以強陽性為主，食管胸上、中段鱗癌組普遍以中度陽性為主，食管胸下段鱗癌組普遍以弱陽性為主，免疫組化染色評分由上至下呈逐漸下降趨勢，見圖1。

圖1 免疫組化染色結(jié)果(蘇木素襯染，×400)

2.2 4組的免疫組化陽性率分析4組Pg陽性率存在差異，從解剖位置上分析由上到下陽性率遞減，4組的陽性率依次為54.00%、48.00%、42.10%、40.00%，見圖2。

2.3 Pg與口腔鱗癌臨床病理特征的相關性及生存分析在口腔鱗癌組中Pg與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期與生存情況具有相關性，在腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期與生存方面Pg陰性組優(yōu)于Pg陽性組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。生存分析顯示：在口腔鱗癌患者中Pg陽性組的中位生存期為69個月，5 a生存率為44.40%。Pg陰性組中位生存未達到，5 a生存率為55.60%，Pg陽性組生存期低于Pg陰性組患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖2 口腔鱗癌與食管上、中、下段鱗癌Pg陽性率差異分析

表1 Pg與口腔鱗癌臨床病理特征的相關性分析例(%)

臨床病理特征Pg(+)Pg(-)χ2 P性別男12(48.00)13(52.00)女15(60.00)10(40.00)0.7250.395年齡<60歲10(66.70)5(33.30)≥60歲17(48.60)18(51.40)1.3840.239吸煙有8(47.10)9(52.90)無19(57.60)14(42.40)0.5000.480飲酒有4(40.00)6(60.00)無23(57.50)17(42.50)0.9860.321分化程度高分化18(54.50)15(45.50)中/低分化9(52.90)8(47.10)0.0120.914浸潤深度<肌層5(29.40)12(70.60)≥肌層22(66.70)11(33.30)6.2690.012淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有9(90.00)1(10.00)無18(45.00)22(55.00)6.5220.011臨床分期Ⅰ/Ⅱ期11(35.50)20(64.50)Ⅲ/Ⅳ期16(84.20)3(15.80)11.260.001生存生存16(44.40)20(55.60)死亡11(78.60)3(21.40)4.7260.030

2.4 Pg與食管胸上段鱗癌臨床病理特征的相關性及生存分析食管胸上段鱗癌組中Pg與飲酒、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及生存具有相關性，在腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及生存Pg陰性組優(yōu)于Pg陽性組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。生存分析顯示：在食管胸上段鱗癌患者中，Pg陽性組的中位生存期為29個月，5 a生存率為38.90%。Pg陰性組中位生存未達到，5 a生存率為61.10%。Pg陽性組生存期低于Pg陰性組患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖3 口腔鱗癌組生存分析

表2 Pg與食管胸上段鱗癌臨床病理特征的相關性分析例(%)

臨床病理特征Pg(+)Pg(-)χ2 P性別男17(54.80)14(45.20)女7(36.80)12(63.20)1.5290.216年齡<60歲8(72.70)3(27.30)≥60歲16(41.00)23(59.00)3.4550.063吸煙有14(50.00)14(50.00)無10(45.50)12(54.50)0.1020.749飲酒有13(65.00)7(35.00)無11(36.70)19(63.30)3.8600.049分化程度中/低分化22(51.20)21(48.80)高分化2(28.60)5(71.40)1.2310.267浸潤深度<纖維膜4(25.00)12(75.00)≥纖維膜20(58.80)14(41.20)4.9870.026淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有19(73.10)7(26.90)無5(20.80)19(79.20)13.6470.001臨床分期Ⅰ/Ⅱ期1(9.10)10(90.90)Ⅲ/Ⅳ期23(59.00)16(41.00)8.5540.003生存生存14(38.90)22(61.10)死亡10(71.40)4(28.60)4.2760.039

2.5 Pg與食管胸中段鱗癌臨床病理特征的相關性及生存分析在食管胸中段鱗癌組中Pg與年齡、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關性，在腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面Pg陰性組優(yōu)于Pg陽性組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。由于所選病人均為2018年新診斷為食管癌病人，隨訪時間短，生存分析無意義。

圖4 食管胸上段鱗癌組生存分析

表3 Pg與食胸中段鱗癌臨床病理特征的相關性分析例(%)

臨床病理特征Pg(+)Pg(-)χ2 P性別男17(47.20)19(52.80)女7(33.30)14(66.70)1.050.306年齡<60歲10(71.40)4(28.60)≥60歲14(32.60)29(67.40)6.5460.011吸煙有9(45.00)11(55.00)無15(40.50)22(59.50)0.1060.745飲酒有6(46.20)7(53.80)無18(40.90)26(59.10)0.1130.736分化程度低分化7(53.80)6(46.20)中/高分化17(38.60)27(61.40)0.9520.329浸潤深度<纖維膜2(10.00)18(90.00)≥纖維膜22(59.50)15(40.50)13.0280.001淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有22(64.70)12(35.30)無2(8.70)21(91.30)17.6560.001臨床分期Ⅰ/Ⅱ期1(33.30)2(66.70)Ⅲ/Ⅳ期23(42.60)31(57.40)0.10.752生存生存23(41.10)33(58.90)死亡1(100.00)0(0.00)1.40.237

2.6 Pg與食管胸下段鱗癌臨床病理特征的相關性及生存分析在食管胸下段鱗癌組中Pg與性別、飲酒、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及生存具有相關性，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及生存方面，Pg陰性組優(yōu)于Pg陽性組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。生存分析顯示：在食管胸下段鱗癌患者中，Pg陽性組的中位生存期為40個月，5 a生存率為20.60%。Pg陰性組中位生存未達到，5 a生存率為79.40%。Pg陽性組生存期低于Pg陰性組患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖5。

表4 Pg與食管胸下段鱗癌臨床病理特征的相關性分析 例(%)

臨床病理特征Pg(+)Pg(-)χ2 P性別男20(45.50)24(54.50)女0(0)6(100.00)4.5450.033年齡<60歲10(45.50)12(54.50)≥60歲10(35.70)18(64.30)0.4870.485吸煙有11(50.00)11(50.00)無9(32.10)19(67.90)1.6370.201飲酒有10(71.40)4(28.60)無10(27.80)26(72.20)8.0030.005分化程度中/低分化18(40.90)26(59.10)高分化2(33.30)4(66.70)0.1260.722浸潤深度<纖維膜4(36.40)7(63.60)≥纖維膜16(41.00)23(59.00)0.0780.780淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有18(56.30)14(43.80)無2(11.10)16(88.90)9.780.002臨床分期Ⅰ/Ⅱ期0(0)8(100.00)Ⅲ/Ⅳ期20(47.6)22(52.40)6.3490.012生存生存7(20.6)27(79.40)死亡13(81.3)3(18.80)16.6820.001

圖5 食管胸下段鱗癌組生存分析

3 討論

細菌感染與癌癥發(fā)生發(fā)展的相關性是近年癌癥研究熱點之一，有關Pg在癌癥發(fā)生發(fā)展的相關性研究也日漸增多。研究表明Pg感染與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展呈正相關[5]，Pg感染與多種消化道、呼吸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有關[6-7]。Pg感染導致宿主細胞癌變的機制可能是多方面的，已知的如Pg可增加IL-6和STAT3活性，促進腫瘤發(fā)生[8]。Pg能上調(diào)微RNAs(micro-RNAs)，例如miR-203在牙齦上皮細胞中可以抑制凋亡等[6]。2016年高社干等[3]首次研究已提示Pg感染可能是食管鱗癌一個新的危險因素，應作為食管鱗癌的預后生物標志物之一。

本研究結(jié)果顯示Pg在口腔、食管上、中、下段癌組織中均有一定的檢出率。從口腔到食管胸下段鱗癌組，Pg的檢出率從上而下依次遞減，免疫組化染色評分由上至下也呈逐漸下降趨勢?？紤]與Pg不耐酸性環(huán)境，而從口腔至食管下段接觸胃酸的機會逐漸增加有關。通過對Pg與食管胸上、中、下段3組鱗癌的臨床病理特征的相關性進行分析，縱向比較結(jié)果顯示：在食管胸上段鱗癌組中，Pg與飲酒、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及生存具有顯著相關性；在食管胸中段鱗癌組中，Pg與年齡、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關性；在食管胸下段鱗癌組中，Pg與性別、飲酒、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及生存具有顯著相關性，并且各組中Pg陽性組在以上相關因素中均較Pg陰性組差，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

通過縱向比較發(fā)現(xiàn)，在腫瘤浸潤深度方面，食管胸上段鱗癌組浸潤深度達到或超過纖維膜的Pg檢出率58.00%，明顯高于下段組的41.00%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中段與下段無差別(P>0.05)；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，食管上段鱗癌組中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Pg檢出率73.10%，食管胸中段組64.70%，食管下段組56.30%。3組發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例由上到下逐漸下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在臨床分期方面，分期為Ⅲ/Ⅳ期的食管上、中、下段鱗癌組的Pg檢出率分別為59.00%、42.60%和47.60%，上、下段差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中、下段無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。Pg在口腔和食管鱗癌組織中的感染率和腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期3個方面的相關性分析，均提示Pg感染是促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的危險因素，生存分析也提示Pg感染者預后較差。

本研究結(jié)果表明：Pg感染在口腔和食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中具有明顯的促進作用，可能是口腔和食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的重要危險因素，并可能作為評價其惡性程度和預后的生物標志物之一；防治Pg感染可能會改善口腔和食管鱗癌的治療效果及預后。上述結(jié)論有待于進一步的基礎和臨床研究證據(jù)支持。