喬彥華，姚紫彤，孫 泉，陳柏安，盧 靜

(首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部，北京 豐臺 100069)

實(shí)驗(yàn)動物在生命科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，實(shí)驗(yàn)動物的質(zhì)量直接決定著生命科學(xué)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。而病原微生物是影響實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量的重要因素之一。仙臺病毒(Sendai virus,SV)是嚙齒類動物最難控制的病毒之一，傳染性強(qiáng)且容易擴(kuò)散。大鼠、小鼠、倉鼠和豚鼠在自然條件下均可感染，大鼠感染仙臺病毒多數(shù)呈亞臨床經(jīng)過，有時(shí)可引起肺炎，對使用大鼠進(jìn)行的麻醉實(shí)驗(yàn)和吸入毒理學(xué)研究等均可產(chǎn)生嚴(yán)重干擾[1]。

本試驗(yàn)以屏障設(shè)施條件下大鼠感染仙臺病毒為例，重點(diǎn)從墊料及飼養(yǎng)盒、隔離服、飲水瓶等物品的高壓滅菌、飼料的滅菌、動物飲用水的凈化、動物的引進(jìn)、人員管理、空調(diào)設(shè)備維護(hù)等方面分析感染原因并提出相應(yīng)的防控措施，為生命科學(xué)研究提供高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)動物。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)耗材 121 ℃壓力蒸汽滅菌化學(xué)指示卡(四環(huán)生物)，3M嗜熱脂肪桿菌芽孢菌(3M公司)；直徑90 mm一次性滅菌瓊脂培養(yǎng)皿(國藥科興化工產(chǎn)品有限公司)。

1.2 檢測方法

1.2.1 大鼠仙臺病毒檢測 2018年5月，隨機(jī)抽取4個(gè)小鼠飼養(yǎng)間哨兵鼠共10只(品系為ICR)、 3個(gè)大鼠飼養(yǎng)間哨兵鼠共10只(品系為SD)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物微生物質(zhì)量抽檢，檢測單位為中國食品藥品檢定研究院，檢測項(xiàng)目及方法按國標(biāo)(GB 14922.2-2011 實(shí)驗(yàn)動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測)進(jìn)行。

1.2.2 墊料及飼養(yǎng)盒、飲水瓶及隔離服滅菌方法及微生物檢測 使用雙扉脈動真空滅菌器進(jìn)行高壓濕熱滅菌，滅菌程序?yàn)槊}動3次、121 ℃ 滅菌30 min、干燥30 min。對滅菌后儲存在潔物間3 d的墊料及飼養(yǎng)盒、飲水瓶、隔離服分別進(jìn)行取樣檢測，具體如下：隨機(jī)抽取3盒墊料(墊料在飼養(yǎng)盒內(nèi))，每盒墊料不同部位混合取50 g放入滅菌瓶內(nèi)，在無菌操作臺內(nèi)將墊料樣本放入滅菌的裝有適量蒸餾水的錐形瓶中，用滅菌玻璃棒攪拌使其充分溶解，靜置30 min后，用滅菌吸管吸取1 mL注入一次性瓊脂平皿，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況。隨機(jī)抽取3套隔離服及3個(gè)飲水瓶，使用無菌棉簽蘸取滅菌水在隔離服上涂抹5 cm×5 cm大小面積，每1套隔離服取樣3個(gè)點(diǎn)。使用無菌棉簽蘸取滅菌水在飲水瓶內(nèi)部涂抹5 cm×5 cm大小面積，將涂抹后的棉簽接種于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況。

1.2.3 飼料滅菌方法及微生物檢測 購買經(jīng)Co60照射滅菌的全價(jià)顆粒飼料，由非潔凈區(qū)人員用0.5%～2%過氧乙酸噴霧消毒后，碼放在傳遞倉內(nèi)，再經(jīng)紫外線消毒20 min后進(jìn)入潔物間。隨機(jī)抽取3袋潔物間內(nèi)飼料，對同一袋飼料用滅菌鑷子上、中、下3個(gè)部位混合取樣，放入滅菌瓶中，在無菌操作臺內(nèi)將飼料樣本放入滅菌的裝有適量蒸餾水的錐形瓶中，用滅菌玻璃棒攪拌使其充分溶散，靜置30 min后用滅菌吸管吸取1 mL注入一次性瓊脂平皿，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況。

1.2.4 動物飲水滅菌方法及微生物檢測 動物飲用水由純水系統(tǒng)凈化滅菌后用飲水瓶取用，每季度監(jiān)測1次飲水微生物情況，檢測時(shí)用滅菌容器從水龍頭處取1～2 mL動物飲用水，在無菌操作臺內(nèi)接種于一次性瓊脂平皿中。置于37 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落生長情況。

2 結(jié)果

2.1 大鼠仙臺病毒檢測 2018年5月，將隨機(jī)抽取的10只ICR小鼠及10只SD大鼠送至中國食品藥品檢定研究院按國標(biāo)要求進(jìn)行SPF級別微生物檢測。結(jié)果顯示，10只小鼠微生物檢測結(jié)果均為陰性，10只SD大鼠微生物檢測結(jié)果見表1，其中3只大鼠仙臺病毒檢測為陽性，均來自同一個(gè)飼養(yǎng)間。

表1 大鼠微生物學(xué)檢測

2.2 墊料及飼養(yǎng)盒、飲水瓶、隔離服微生物檢測 為了檢測高壓滅菌效果，對潔物間儲存3 d的墊料、飲水瓶及隔離服分別取樣進(jìn)行微生物培養(yǎng)，結(jié)果顯示，菌落總數(shù)均為0(表2)。

表2 墊料、飲水瓶及隔離服微生物檢測

2.3 飼料滅菌效果檢測 為了檢測飼料的滅菌效果，隨機(jī)抽取潔物間3袋飼料，每袋飼料分別從上、中、下3個(gè)部位混合取樣，微生物培養(yǎng)48 h后，3袋飼料菌落總數(shù)均為0，說明飼料滅菌效果符合要求。

2.4 飲水滅菌效果檢測 按國標(biāo)要求，實(shí)驗(yàn)動物飲用水需為無菌水。從潔凈區(qū)水龍頭取飲水1～2 mL，經(jīng)微生物培養(yǎng)后觀察，菌落數(shù)為0 CFU/皿(表3)，符合要求。

表3 2018年屏障設(shè)施動物飲水微生物檢測

3 討論

屏障設(shè)施條件下能夠感染大、小鼠的病原微生物有很多，有些病原會引起暴發(fā)流行，甚至毀滅整個(gè)動物群，有些人獸共患病原會威脅人類健康，還有些病原雖然不會引起明顯的臨床癥狀，但會對科研工作產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，如小鼠肝炎病毒、仙臺病毒、鼠支原體等。

世界各地大、小鼠攜帶仙臺病毒的現(xiàn)象非常普遍。尤其是近10多年來，我國實(shí)驗(yàn)大、小鼠中檢出仙臺病毒感染的鼠群數(shù)量和樣品陽性率呈上升趨勢，2013年陽性率高達(dá)15.87%[2]。王翠娥等對2012-2013年國內(nèi)多家單位送檢的大小鼠血清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)大、小鼠仙臺病毒均有較高的陽性率(8.3%、14.0 %)[3]。屏障設(shè)施內(nèi)動物一旦感染仙臺病毒，需要及時(shí)隔離感染房間，淘汰鼠群，或通過胚胎移植方式重建鼠群。

屏障設(shè)施動物微生物感染的原因有很多，有時(shí)為單一因素造成，更多時(shí)候是多種因素相互關(guān)聯(lián)、共同作用的結(jié)果[4]。因此，病原微生物的防控也必須多管齊下，主要從以下三方面入手：人流(人員管理及規(guī)章制度制定)、物流(進(jìn)入屏障物品的滅菌及引進(jìn)動物的隔離檢疫)、氣流(設(shè)施內(nèi)環(huán)境空氣潔凈度及空調(diào)凈化設(shè)備的維護(hù))。

劉艷等對我國1980-2010年實(shí)驗(yàn)動物屏障設(shè)施感染事件分析發(fā)現(xiàn)，工作人員的操作不當(dāng)和失誤等人為因素是引起實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施感染事件發(fā)生的主要原因[5]。因此，建議制作詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程并加強(qiáng)人員培訓(xùn)，人員進(jìn)出不同房間時(shí)更換一次性PPE(手套、口罩、帽子)，更換墊料最好在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，防止氣溶膠產(chǎn)生。

外界病原微生物可能通過未經(jīng)滅菌或滅菌不徹底的物品進(jìn)入屏障。因此，筆者對潔物間儲存了3 d的墊料、隔離服、飲水瓶及飼料、動物飲用水進(jìn)行了微生物培養(yǎng)，結(jié)果顯示均無微生物污染。為了保證滅菌效果，建議每次滅菌時(shí)除使用化學(xué)指示卡外，應(yīng)定期使用生物指示劑進(jìn)行監(jiān)測[6]。滅菌器由有資質(zhì)的專業(yè)人員進(jìn)行管理和維護(hù)，建立設(shè)備管理檔案，定期進(jìn)行儀器維護(hù)和檢查。物品盡量隨滅隨用，避免二次污染，物品在潔物間儲存最多不超過3 d[7]。

新引進(jìn)動物的隱性感染是屏障設(shè)施微生物污染的主要原因之一。文中仙臺病毒陽性大鼠所在的飼養(yǎng)間在1個(gè)月前有引進(jìn)動物記錄，且該房間大鼠在此前和此后的定期微生物監(jiān)測(每季度一次)中均未發(fā)現(xiàn)感染仙臺病毒。因此，本次仙臺病毒極有可能來源于此批新引進(jìn)的動物。由此建議引進(jìn)新動物時(shí)，都要嚴(yán)格進(jìn)行隔離檢疫或生物凈化；購買動物時(shí)選擇有生產(chǎn)許可證的大型動物供應(yīng)商，接收動物時(shí)仔細(xì)檢查包裝盒，包裝破損的動物不得進(jìn)入屏障。

屏障設(shè)施通過空調(diào)凈化系統(tǒng)將溫度、濕度、風(fēng)量、換氣次數(shù)和空氣潔凈度等內(nèi)環(huán)境指標(biāo)控制在國標(biāo)規(guī)定的范圍內(nèi)。內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定對于微生物控制非常重要。王晶等的研究表明，飼養(yǎng)活動可使屏障內(nèi)落下菌與塵埃粒子數(shù)明顯升高，飼養(yǎng)結(jié)束后噴霧消毒可使屏障內(nèi)落下菌與塵埃粒子數(shù)明顯下降[8]。劉香梅等通過研究發(fā)現(xiàn)，屏障設(shè)施由于部分高效過濾器密封不好,導(dǎo)致外界微生物隨氣流進(jìn)入屏障設(shè)施內(nèi)。由于高效過濾器發(fā)生堵塞,致使換氣次數(shù)減少,壓差紊亂,氣體發(fā)生倒流,最終使屏障設(shè)施內(nèi)空氣遭受污染[9]。因此，建議加強(qiáng)對屏障設(shè)施內(nèi)環(huán)境的維持性消毒，定期監(jiān)測落下菌及塵埃粒子數(shù)，定期更換空調(diào)過濾器。

除了從人流、物流、氣流三方面切斷病原微生物進(jìn)入屏障設(shè)施的途徑外，應(yīng)定期對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行微生物學(xué)監(jiān)測，目前，國內(nèi)外檢測機(jī)構(gòu)多采用血清學(xué)檢測方法[10]。但由于ELISA試劑盒不同批次、操作人員及儀器存在差異等原因，檢測結(jié)果會出現(xiàn)假陽性和假陰性現(xiàn)象。因此，針對陽性結(jié)果，建議更換實(shí)驗(yàn)室或試劑盒進(jìn)行復(fù)核?；蛴肊LISA和IFA法進(jìn)行比對檢測，可降低假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)率[11]。