覃一峰，薛 佳，張國中

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

疫苗泛指具有抗原性，接種機(jī)體后能夠產(chǎn)生特異性免疫力，并可抵御其針對傳染病的發(fā)生或流行的生物學(xué)制劑[1]。目前，臨床上使用的畜禽病毒病疫苗主要是弱毒苗和滅活苗。弱毒苗在臨床應(yīng)用中可能會存在毒株返強(qiáng)以及疫苗株與野生型毒株基因重組等安全性問題[2-3]。而滅活苗更傾向于誘導(dǎo)體液免疫，其誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力相對較弱[4-5]。一個理想的疫苗除應(yīng)具有安全性之外，還應(yīng)同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫。通過誘導(dǎo)體液免疫產(chǎn)生高親和力中和抗體，阻止病毒與靶細(xì)胞受體的結(jié)合。而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫則產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)，CTL識別靶細(xì)胞后能夠直接裂解靶細(xì)胞或者誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡[6-7]，從而抑制病毒在體內(nèi)的復(fù)制。

多表位疫苗是近年發(fā)展起來的一種基于目標(biāo)抗原表位設(shè)計(jì)的新型疫苗，相對于傳統(tǒng)弱毒疫苗，其安全性更高[8]。將病毒蛋白上的多個B細(xì)胞或T細(xì)胞表位整合到特定載體上構(gòu)建的多表位疫苗能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生針對多個表位的B細(xì)胞或T細(xì)胞克隆，從而有利于控制病毒的感染。多表位疫苗在抑制病毒復(fù)制和對抗免疫逃逸株等方面都具有獨(dú)特優(yōu)勢[9-10]，是目前疫苗研究的一個熱點(diǎn)。本文就多表位疫苗的構(gòu)建策略及動物病毒多表位疫苗研究進(jìn)展作簡單綜述，為了解該類型疫苗在動物疫病防控中的應(yīng)用潛力奠定基礎(chǔ)。

1 表位的研究

表位又稱抗原決定簇，是存在于病毒蛋白上能與相應(yīng)淋巴細(xì)胞受體結(jié)合的一段短的氨基酸序列。按照其結(jié)合淋巴細(xì)胞受體類型的不同，主要分為B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位兩大類[11]。

1.1 B細(xì)胞表位 B細(xì)胞表位是指能被B細(xì)胞受體(B cell receptor,BCR)識別的一段氨基酸序列，根據(jù)構(gòu)型不同可以分為線性表位和構(gòu)象表位。B細(xì)胞線性表位是連續(xù)的氨基酸序列，而構(gòu)象表位的氨基酸不連續(xù)延伸，通過蛋白質(zhì)折疊在空間上聚集在一起[11]。目前對B細(xì)胞表位的研究主要集中于線性表位，構(gòu)象表位的研究相對滯后，主要是因?yàn)闃?gòu)象表位的研究技術(shù)相對較為復(fù)雜。目前研究B細(xì)胞表位的技術(shù)主要包括表位預(yù)測、化學(xué)“切割”法、肽探針掃描技術(shù)和噬菌體隨機(jī)肽庫法等幾種。沈友林等[12]通過表位預(yù)測結(jié)合間接ELISA方法在I型鴨甲肝病毒(DHAV-1)的VP3蛋白上鑒定出2個線性B細(xì)胞表位。周國輝等[13]利用單克隆抗體結(jié)合噬菌體展示技術(shù)在A型口蹄疫病毒的VP1蛋白上鑒定一個構(gòu)象中和表位。韓宗璽等[14]通過噬菌體隨機(jī)肽庫法和肽掃描技術(shù)在禽傳染性支氣管炎病毒核衣殼蛋白上鑒定出2個保守的B細(xì)胞線性表位。鑒定的B細(xì)胞表位為開發(fā)畜禽診斷試劑和多表位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1.2 T細(xì)胞表位 T細(xì)胞表位是供T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)識別的一段短氨基酸序列，與B細(xì)胞表位不同的是，T細(xì)胞表位都是線性表位，而且具有MHC(Major Histocompatibility Complex,MHC)限制性，即它們必須與特定MHC分子結(jié)合后才能被對應(yīng)的T細(xì)胞識別，從而刺激T細(xì)胞的增殖與分化[11]。根據(jù)識別T細(xì)胞種類的不同，T細(xì)胞表位又分為CD4+T細(xì)胞表位和CD8+T細(xì)胞表位。CD8+T細(xì)胞表位與MHC I分子結(jié)合，MHC I分子兩端封閉，主要結(jié)合長度為8～11氨基酸(AA)的肽段[15-16]。CD4+T細(xì)胞表位與MHC II分子結(jié)合，由于MHC II類分子的兩端不封閉，所以其結(jié)合的肽段長度不受嚴(yán)格限制[17]。隨著不同種類動物MHC分子結(jié)合基序的解析，越來越多的動物病毒T細(xì)胞表位被鑒定。丁鏟等[18]通過已知的雞MHC I分子結(jié)合基序在禽傳染性支氣管炎病毒S1蛋白上預(yù)測出21個T細(xì)胞表位，并通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISpot)和T細(xì)胞增殖試驗(yàn)鑒定出4個CD8+T細(xì)胞表位。Reemers等[19]在H7N1的NP和M1蛋白上預(yù)測33個T細(xì)胞表位，通過ELISpot鑒定16個為功能性CTL表位。Bai等[20]通過在牛白血病病毒的env，gag和tax蛋白上合成一系列重疊多肽，利用WST-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)和乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗(yàn)鑒定11個CD8+T細(xì)胞表位，并認(rèn)為env蛋白上的gp30是研究牛白血病病毒疫苗的最佳候選區(qū)域。

2 多表位疫苗的構(gòu)建策略

2.1 多表位疫苗的設(shè)計(jì) 由于單個表位只是一段短的氨基酸多肽，分子量較小，很容易被降解，同時(shí)其免疫原性也較差。因此在實(shí)際應(yīng)用中一般需要將它們進(jìn)行合理設(shè)計(jì)才能更好地發(fā)揮作用。目前表位疫苗的設(shè)計(jì)主要包括脂肽模式、空間伸展模式和線性串聯(lián)設(shè)計(jì)三種方式[17]。其中，脂肽模式是將含抗原表位的多肽共價(jià)連接到脂質(zhì)分子上構(gòu)建的脂肽疫苗，該類型疫苗利用脂質(zhì)分子的高親脂性將多肽導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，能夠有效激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫[21]；空間伸展模式是將多個抗原表位與分枝狀多聚賴氨酸核心骨架偶聯(lián)，構(gòu)成多聚抗原肽，利用該方式可提高抗原表位的穩(wěn)定性和免疫原性[22]；而線性串聯(lián)設(shè)計(jì)是將多個抗原表位按照一定的順序串聯(lián)起來，并將串聯(lián)的多肽鏈連接到特定載體上構(gòu)建出的表位疫苗，該方法最直接，且能有效避免單個表位易降解和免疫原性較差等缺點(diǎn)，所以其在多表位疫苗的設(shè)計(jì)中應(yīng)用相對最為廣泛。

2.2 多表位疫苗的優(yōu)化 構(gòu)建串聯(lián)表位時(shí)在表位間引入一定的間隔序列可以提高表位疫苗的蛋白酶水解和抗原遞呈效率，同時(shí)避免在相鄰表位間引入新的連接表位。Livingston等[23]在構(gòu)建CD4+T淋巴細(xì)胞多表位疫苗時(shí)發(fā)現(xiàn)，若將表位按順序首尾相連時(shí)，會在表位連接處引入新的與MHC II分子結(jié)合的連接表位。若在相鄰表位間引入GPGPG間隔序列，能夠明顯提高表位的免疫原性。劉祖強(qiáng)等[24]分別構(gòu)建包含GSGGGGS、GS和RS三種不同表位間隔序列的免疫原，研究結(jié)果表明，表位間隔序列對免疫原刺激機(jī)體產(chǎn)生表位特異性抗體有著顯著影響。除此之外，表位的側(cè)鏈殘基對于精確處理表位也十分重要，一些研究認(rèn)為，側(cè)鏈含有丙氨酸的表位可以提高T細(xì)胞的表位處理和識別能力[15,25-26]。Cole等[27]發(fā)現(xiàn)通過修飾流感病毒血凝素表位(HA305-320)C末端肽側(cè)翼區(qū)域可以改變其與T細(xì)胞受體結(jié)合的親和力，進(jìn)而影響T細(xì)胞的激活。在多表位疫苗的設(shè)計(jì)過程中，還可以通過表位重復(fù)策略提高特異性免疫應(yīng)答。劉祖強(qiáng)等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)抗體水平方面，八重復(fù)表位明顯優(yōu)于四重復(fù)表位，更優(yōu)于單表位，說明在重組蛋白中增加表位的重復(fù)次數(shù)可以明顯提高表位的特異性抗體應(yīng)答。

3 多表位疫苗在畜禽病毒病防控中的應(yīng)用潛力

多表位疫苗作為一種新型疫苗，近年來在畜禽病毒病中的研究較為廣泛，尤其是一些對養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重且基因變異較大的病毒病。邵軍軍等[28]通過將O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白上的141-160AA和200-213AA兩個表位重復(fù)3次，并連接到豬免疫球蛋白G重鏈恒定區(qū)構(gòu)建多表位重組疫苗，免疫豬群后誘導(dǎo)高滴度的FMDV中和抗體，達(dá)到甚至超過OIE的推薦值，同時(shí)誘導(dǎo)高比例的淋巴細(xì)胞增殖，完全保護(hù)豬群抵抗同源病毒感染。成子強(qiáng)等[29]將4個在禽白血病病毒(ALV-J)分離株中普遍存在的變異表位克隆到pET-32a (+)載體上，通過原核表達(dá)獲得多表位蛋白抗原，將其免疫雞群后獲得高滴度抗體，能夠識別并中和不同的ALV-J毒株，且能免疫期至少維持126 d，免疫雞群獲得對抵抗ALV-J感染100%的保護(hù)率。彭金美等[30]以H5N1亞型禽流感病毒的HA和NA基因及其表位為基礎(chǔ)構(gòu)建多表位DNA疫苗，免疫雞群后血清HI效價(jià)和外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞都有不同程度的升高，并在高致病性禽流感病毒H5N1攻擊時(shí)對雞群提供一定程度的保護(hù)。譚磊等[31]將禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)S1蛋白上的4個CD8+T細(xì)胞表位和3個B細(xì)胞中和表位通過柔性肽(G4S)連接構(gòu)建多表位DNA疫苗，免疫雞群后產(chǎn)生與表達(dá)完整S1蛋白免疫組相同的中和抗體水平，但是其誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)明顯高于表達(dá)完整S1蛋白的免疫組。在同源病毒攻擊時(shí)完全保護(hù)雞群，并能更有效地降低雞群排毒和維持氣管纖毛活性，說明細(xì)胞免疫在抵抗IBV感染中起重要作用。

4 展望

雖然近年來多表位疫苗的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)步，但是目前還存在一些問題需要解決，主要是：(1)目前對B細(xì)胞表位的研究主要集中在線性表位，而對構(gòu)象表位的研究相對較少，這可能會錯過部分中和表位，導(dǎo)致疫苗的效力降低；(2)相對于人類，目前對動物MHC分子的研究較為滯后，這會阻礙動物病毒T細(xì)胞表位的鑒定以及設(shè)計(jì)覆蓋面更廣的通用型多表位疫苗；(3)通過生物信息學(xué)預(yù)測表位的準(zhǔn)確率還不夠高，可能會漏掉一些主要抗原決定簇，提高表位預(yù)測技術(shù)將會在一定程度上降低表位疫苗的開發(fā)成本；(4)如何提高表位肽的免疫原性也是研究的熱點(diǎn)，對于串聯(lián)表位疫苗來說，目前的研究主要集中在提高表位蛋白的表達(dá)水平、表位的處理和遞呈效率和添加免疫刺激因子等方面。多表位疫苗作為一種新型疫苗，一經(jīng)問世即成為免疫學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，相信隨著更多MHC分子結(jié)構(gòu)的解析以及生物信息學(xué)的發(fā)展，會有更多有效的多表位疫苗被開發(fā)，在抵抗人類和動物病毒感染中發(fā)揮更大作用。

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續(xù)前表

期刊名稱郵發(fā)代號刊期年定價(jià)/元聯(lián)系人電話地址郵編E-mail中國豬業(yè)80493雙月刊180.00 張愛華01082106274北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號100081zhuye@caas.cn中國牛業(yè)科學(xué)52113雙月刊72.00 張 琪02987091423陜西楊凌、西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院712100Huangn2002813@aliyun.com動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展5260月刊180.00 黃建文02987092574陜西楊凌、西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院712100dyjzyilan@263.net家畜生態(tài)學(xué)報(bào)52112月刊72.00 陳小強(qiáng)02987091130陜西楊凌、西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院712100jcst@x263.net飼料與畜牧82612月刊120.00 黃 偉01062123852北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號、農(nóng)科院飼料所輔助樓504100081newfeed@caas.cn畜牧與飼料科學(xué)16101雙月刊90.00 趙俊利04715294608內(nèi)蒙古呼和浩特市昭君路22號、內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院010031cnmxky@vip.163.com內(nèi)蒙古畜牧業(yè)(蒙文)1650雙月刊42.00 畢力格巴圖04716652216內(nèi)蒙古呼和浩特市烏蘭察布東街70號010010nmgxmy@sohu.com當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)1649月刊120.00 菅瑞珍04716652261內(nèi)蒙古呼和浩特市烏蘭察布東街70號010010nmgxmy2008@sina.com四川畜牧獸醫(yī)6243月刊120.00 胡 麗 02885571780四川省成都市武侯祠大街4號、四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳內(nèi)610041scxmsy@sina.com中國動物檢疫24112月刊240.00 王曉華053285642906山東省青島市南京路369號266032zgdwjy2016@cahec.cn中國畜禽種業(yè)80222月刊312.00 張躍武01082106255北京市中關(guān)村南大街12號、中國農(nóng)科院中國畜禽種業(yè)編輯部100081zgxq010@126.com家禽科學(xué)24146月刊72.00 孫 凱053185990243山東省濟(jì)南市交校路1號250023jqkxzz@163.com青海畜牧獸醫(yī)雜志5610雙月刊30.00 李 威09715318387青海省西寧市生物園區(qū)緯二路1號、青海省牧科院810016qhxmsyzz@qhmky.com草業(yè)學(xué)報(bào)5484月刊300.00 裴世芳09318913494甘肅省蘭州市嘉峪關(guān)西路768號、蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院730020cyxb@lzu.edu.cn草原與草坪5413雙月刊60.00 周愛琴09317631885甘肅省蘭州市安寧區(qū)迎門村1號、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)730070cyycp@gsau.edu.cn貴州畜牧獸醫(yī)6658雙月刊54.00 劉 輝085185400593貴州省貴陽市南明區(qū)小碧鄉(xiāng)老里坡550005gzxmsy@163.com浙江畜牧獸醫(yī)自辦發(fā)行雙月刊42.00 徐寧迎/黃利權(quán)057186971701杭州市西湖區(qū)余杭塘路866號、浙江大學(xué)紫金港校區(qū)310058zjxmsy@zju.edu.cn福建畜牧獸醫(yī)3481雙月刊48.00 謝新東059187807454福建省福州市鼓屏路183號350003fjxmsy@163.com草業(yè)科學(xué)5451月刊240.00 武艷培09318912486甘肅省蘭州市嘉峪關(guān)西路768號730020cykx@lzu.edu.cn中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)1470月刊180.00 彭永剛045151051812黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)哈平路678號150069zgyfsyxbhvri@vip.163.com中國草食動物科學(xué)5457雙月刊48.00 魏云霞09312115279甘肅省蘭州市七里河區(qū)鹼溝沿335號730050xumuchj@163.com湖北畜牧獸醫(yī)38352月刊120.00 龍小玲02787389001湖北省武漢市洪山區(qū)南湖瑤苑1號、湖北省農(nóng)科院內(nèi)430064hbxm87389001@163.com養(yǎng)殖與飼料38381月刊96.00 汪長春02787287074湖北省武漢市洪山區(qū)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)430070yzcl@mail.hzau.edu.cn安徽畜牧獸醫(yī)自辦發(fā)行季刊免費(fèi)謝俊龍055162658681安徽省合肥市徽州大道197號、農(nóng)業(yè)大廈1601室230001ahxmsyxh@163.com今日畜牧獸醫(yī)18339月刊96.00 包尚義15130116013河北省石家莊市裕華區(qū)興苑街4號050031jrxmsy@126.com北方牧業(yè)18323半月刊120.00 孫秀娟13931175960河北省石家莊市裕華區(qū)興苑街4號050031beifangmuye88@sohu.com江西畜牧獸醫(yī)雜志44109雙月刊60.00 夏宗群079188503157江西省南昌市文教路359號710室330046jx3975401@126.com山東畜牧獸醫(yī)24231月刊60.00 焦景旭05388242644山東省泰安市山東農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)271018xmxh@sdau.edu.cn

續(xù)前表

期刊名稱郵發(fā)代號刊期年定價(jià)/元聯(lián)系人電話地址郵編E-mail中國奶牛80401月刊240.00 劉文嬌010 62673764北京海淀區(qū)圓明園西路2號、中國農(nóng)科院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧醫(yī)3號樓206100193zgnn126@126.com中國動物傳染病學(xué)報(bào)4748雙月刊90.00 鄭海紅02134293142上海市閔行區(qū)紫月路518號、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所200241bianjibu@shvri.ac.cn中國動物保健82991月刊180.00 張小清?01062819396北京市昌平區(qū)王莊工業(yè)園中農(nóng)華威內(nèi)102206fangtingsong@163.com現(xiàn)代畜牧科技14304月刊216.00 黃 紅04526116741黑龍江省齊齊哈爾市龍沙區(qū)合意大街2號161005xdxmkj@126.com中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志5455雙月刊72.00 陸金萍09312115280甘肅省蘭州市小西湖鹼溝沿335號730050zsyyyzz@sina.com草食家畜5871雙月刊72.00 楊 志09913075315新疆烏魯木齊市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)阿里山街468號、新疆畜牧科學(xué)院830011caoshijiachu@sina.cn畜牧獸醫(yī)科學(xué)自辦發(fā)行月刊240.00 金 峰01056106282北京德勝門外北沙灘1號、中國農(nóng)機(jī)化科學(xué)研究院100083xmsykxbjb@163.com今日養(yǎng)豬業(yè)80261雙月刊90.00 趙秋菊01051503820北京市海淀區(qū)曙光花園中路9號、北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與經(jīng)濟(jì)研究所100097pigstoday@vip.163.com廣西畜牧獸醫(yī)48107 雙月刊30.00 羅 林07713235650廣西省南寧市秀靈路、廣西大學(xué)東校園530005gxxmsy5650@126.com中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)12105月刊240.00 李文紅043187836534吉林省長春市西安大路5333號130062xbcjvs@163.com當(dāng)代畜牧82338月刊120.00 李建秋01062014549北京市西城區(qū)德外冰窖口胡同75號100088ddxm123@sina.com畜禽業(yè)62184月刊192.00 邱 燕02885256716四川省成都市大慈寺路32號610016xqyzzs@163.com畜牧獸醫(yī)雜志5256雙月刊54.00 劉炳琪02987092806陜西省楊凌區(qū)西農(nóng)路22號、西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院712100xmsy2806@163.com云南畜牧獸醫(yī)自辦發(fā)行雙月刊30.00 蔣文俊087165017073云南省昆明市盤龍區(qū)金殿青龍山、云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院650224ynxmsy@188.com糧食與飼料工業(yè)38151雙月刊60.00 梅 竹02787406138/02750657966湖北省武漢市卓刀泉南路3號430079lsyslgy@126.com畜牧獸醫(yī)科技信息1448月刊120.00 朱明艷045151051813黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)哈平路678號150069xmsykjxx2016@163.com國外畜牧學(xué)豬與禽4361月刊96.00 王晶晶02162204554上海市閔行區(qū)北翟路2901號201106shzyq2005@126.com中國畜牧獸醫(yī)報(bào)1155周刊147.00 魏敬秋01085835474北京市朝陽區(qū)惠新西街15號100029zgxmsyb@sina.com養(yǎng)禽與禽病防治469月刊60.00 王玉芳02085283636廣東省廣州市天河區(qū)五山鎮(zhèn)、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)23號樓208210房510642scvm@21cn.net中獸醫(yī)學(xué)雜志4446月刊180.00 周建榮079186266201/13979117757 江西省南昌市高新區(qū)京東大道698號、江西省動物疫控大樓330029sy1096@163.com湖南畜牧獸醫(yī)42276雙月刊36.00 蔡文杰073184615356湖南省長沙市遠(yuǎn)大二路泉塘、畜牧獸醫(yī)研究所內(nèi)410131hiavs@163.com廣東畜牧獸醫(yī)科技自辦發(fā)行雙月刊60.00 馬新燕02087576452廣東省廣州市天河區(qū)五山大豐一街1號510640gdxmsykj@163.com中國農(nóng)業(yè)科學(xué)2138半月刊1188.00 林鑒非01082109808北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號100081zgnykx@caas.cn農(nóng)業(yè)大數(shù)據(jù)學(xué)報(bào)80388季刊200.00 黃 朝01082106275北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號100081agbigdata@caas.cn