汪夢(mèng)馨 高天 劉洋 劉淑娟 邢金良

作者單位：710000 西安 1空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；010110 呼和浩特 2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；710032 西安 3空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理教研室

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，因早期缺乏典型癥狀和體征以及有效的早期診斷方式，約75%的患者確診時(shí)已處于晚期［1-2］。早期患者5年生存率可達(dá)71%～93%［3-4］，而晚期患者僅為 29%［4］。因此，開發(fā)早期診斷和精準(zhǔn)治療標(biāo)志物，對(duì)延長(zhǎng)患者生存期十分關(guān)鍵。目前卵巢癌臨床上常用的診斷方法主要包括血清學(xué)檢測(cè)［糖類抗原 125（CA125）聯(lián)合人附睪蛋白 4（HE4）］和經(jīng)陰道 B 超檢查（transvaginal sonograph，TVS）［5］等。CA125在卵巢癌早期診斷中靈敏度較低，僅為50%；TVS在卵巢癌診斷中靈敏度為90.63%，特異度為88.57%，可以幫助診斷伴有卵巢明顯增大的卵巢癌，但對(duì)于病灶不明顯的卵巢癌，診斷效果不理想［6］。線粒體是幾乎存在于所有真核細(xì)胞中的重要細(xì)胞器，每個(gè)細(xì)胞都包含多個(gè)拷貝的線粒體基因組［7］。已有研究表明，幾乎所有類型的腫瘤組織中均可檢測(cè)到mtDNA變異，且其引起的線粒體功能障礙與腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。近年研究［8］表明，腫瘤組織或轉(zhuǎn)移灶中的mtDNA可釋放到外周血循環(huán)中，因此檢測(cè)外周血循環(huán)中的mtDNA變異在腫瘤早期診斷、腫瘤進(jìn)展以及轉(zhuǎn)移方面有巨大的應(yīng)用前景［9］。本文將對(duì)卵巢癌中mtDNA變異檢測(cè)及其臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 mtDNA變異與卵巢癌

mtDNA變異主要分為兩大類：“質(zhì)變”和“量變”?！百|(zhì)變”包括單堿基替換、短片段插入或缺失、長(zhǎng)片段缺失等；“量變”主要指mtDNA拷貝數(shù)變異。

1.1 mtDNA“質(zhì)變”與卵巢癌

1.1.1 單堿基替換 單堿基替換又稱點(diǎn)突變，是腫瘤細(xì)胞中最常見的mtDNA變異。腫瘤中點(diǎn)突變存在明顯偏倚：G-A突變頻率最高，T-C突變頻率次之，A-G和C-T突變頻率再次之，但均顯著高于其他類型的點(diǎn)突變［10］。且卵巢癌中的mtDNA突變大多數(shù)是T-C或G-A躍遷［11］。LIU 等［12］報(bào)道約 60%的卵巢癌中存在mtDNA點(diǎn)突變。同其他腫瘤［13］一樣，卵巢癌中mtDNA的點(diǎn)突變多發(fā)生在非編碼區(qū)，即D環(huán)（D-loop）區(qū)，可能是由于D-loop區(qū)具有獨(dú)特的三鏈結(jié)構(gòu)而更易產(chǎn)生突變。而mtDNA D-loop區(qū)點(diǎn)突變與較低的mtDNA拷貝數(shù)和較差的預(yù)后密切相關(guān)［14］。KONG 等［15］針對(duì) 89例原發(fā)性上皮性卵巢癌患者血液樣本的游離mtDNA D-loop區(qū)進(jìn)行靶向測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D-loop區(qū)的突變與上皮性卵巢癌患者的臨床結(jié)局相關(guān)。以上研究結(jié)果說明，檢測(cè)mtDNA D-loop區(qū)點(diǎn)突變有助于明確患者基因型，預(yù)測(cè)患者預(yù)后。

同其他腫瘤一樣，卵巢癌中mtDNA突變最常發(fā)生的位置除了 D-loop 區(qū)，還有 ND4、ND5、ND1、cytb 等區(qū)域［16］。而發(fā)生在編碼區(qū)的突變可能影響mtDNA的轉(zhuǎn)錄，從而影響線粒體功能。如ND5基因編碼復(fù)合物Ⅰ的核心亞基，而該亞基對(duì)線粒體呼吸鏈中還原型輔酶（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）到泛醌的電子傳遞至關(guān)重要，ND5出現(xiàn)突變或與復(fù)合物Ⅰ相關(guān)的基因（如ND4）出現(xiàn)缺陷，都可能導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化損傷以及活性氧生成增加，從而導(dǎo)致腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移［17］。此外，cytC基因中的mtDNA改變也可能阻礙細(xì)胞凋亡過程，而mtDNA ATP合酶亞基6（MTATP6）基因的突變可能通過抑制細(xì)胞凋亡而促進(jìn)癌癥的發(fā)生［18］。

1.1.2 短片段的插入或缺失 迄今為止，已有一百種mtDNA短片段插入缺失在腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。研究顯示，卵巢癌中易出現(xiàn)插入/缺失的位置是位于np303-309、np568-573 區(qū)域［11］。盡管如此，大部分已報(bào)道的mtDNA插入缺失變異呈隨機(jī)分布，且未發(fā)現(xiàn)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有顯著相關(guān)性。HUNG等［19］研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的癌組織中，約5%的組織在上述兩處區(qū)域存在插入，然而在相應(yīng)癌旁組織中也可檢測(cè)到上述插入突變，因此認(rèn)為短片段的插入或缺失不具有腫瘤特異性。

1.1.3 長(zhǎng)片段缺失 在腫瘤細(xì)胞mtDNA中，np8470/8482至np13447/13459之間總計(jì)4 977 bp的缺失是最常見的線粒體DNA大片段缺失［20］，被命名為“常見缺失”。缺失的4977 bp片段中包含了7個(gè)氧化磷酸化亞基編碼基因（ATP6、ATP8、COXIII、ND3、ND4L、ND4、ND5）和5個(gè)tRNA編碼基因，因此此片段的缺失嚴(yán)重影響線粒體正常功能。在子宮內(nèi)膜癌［21］和宮頸癌［22］研究中發(fā)現(xiàn)，mtDNA 4977 bp片段的積累可能與患者衰老過程有關(guān)，尤其體現(xiàn)在圍絕經(jīng)期婦女中。在卵巢癌［23］研究中發(fā)現(xiàn)，與卵巢惡性腫瘤組織中幾乎未檢測(cè)到缺失相比，卵巢良性腫瘤組織中mtDNA 4977 bp缺失率達(dá)63%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與在乳腺癌、胃癌、頭頸部腫瘤［24］和直腸癌［25］中進(jìn)行的研究結(jié)果一致。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因一方面可能是腫瘤細(xì)胞大量擴(kuò)增導(dǎo)致帶有缺失的細(xì)胞總量下降，另一方面可能是大量缺失細(xì)胞存在代謝異常，惡性腫瘤在大量擴(kuò)增過程中通過凋亡的方式淘汰這些細(xì)胞［26］。但是總體而言，卵巢癌中有關(guān)長(zhǎng)片段缺失方面的研究極少，仍有待進(jìn)一步研究。

1.1.4 微衛(wèi)星不穩(wěn)定 微衛(wèi)星是遍布于人類基因組中的短串聯(lián)重復(fù)序列。微衛(wèi)星不穩(wěn)定（micro satellite instability，MSI）是指DNA甲基化或者基因突變導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)基因缺失，從而導(dǎo)致微衛(wèi)星重復(fù)序列插入或缺失，繼而導(dǎo)致DNA長(zhǎng)度發(fā)生改變，這一過程與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［27］。線粒體微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（mitochondrial micro satellite instability，mtMSI）被定義為正常組織和腫瘤組織之間mtDNA短堿基重復(fù)序列長(zhǎng)度的變化。而mtMSI是人類腫瘤中常見的事件［28］。在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中，MSI多見于子宮內(nèi)膜癌［29］。而在卵巢癌中，MSI更常見于子宮內(nèi)膜樣卵巢癌［30］。發(fā)生在卵巢癌中的mtMSI，其中在D-loop區(qū)最常見。WANG等［11］在73例原發(fā)性卵巢癌體細(xì)胞標(biāo)本中提取mtDNA，發(fā)現(xiàn)mtMSI在卵巢癌早期腫瘤細(xì)胞中較常見，且含量顯著高于晚期腫瘤細(xì)胞，但樣本量較小，這一結(jié)論有待進(jìn)一步研究。

1.2 mtDNA“量變”與卵巢癌

mtDNA作為電子傳遞鏈的必要模板，其拷貝數(shù)的多少在一定程度上決定了細(xì)胞的氧化還原能力。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在能量密集型組織（如心臟和骨骼?。┲?，每個(gè)細(xì)胞中含有4 000～6 000個(gè)mtDNA拷貝，而肝臟、腎臟和肺組織中平均含有500～2 000個(gè)拷貝［31］。與其他腫瘤組織相比，卵巢癌組織中mtDNA拷貝數(shù)明顯增多［10，32］。且越來(lái)越多的證據(jù)表明，卵巢癌患者與健康人的血漿或血清游離mtDNA（cf-mtDNA）拷貝數(shù)水平存在顯著差異［33］。ZACHARIAH 等［34］研究亦發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌與良性上皮性卵巢腫瘤、子宮內(nèi)膜異位癥患者和健康對(duì)照者相比，血漿cf-mtDNA水平顯著升高。熱孜婉古麗·吾布力等［35］檢測(cè)30例卵巢癌患者、30例卵巢良性腫瘤患者和60名健康志愿者的外周血樣本，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血漿中cf-mtDNA含量明顯高于其余兩組。因此認(rèn)為，mtDNA拷貝數(shù)變異在卵巢癌診斷中起重要作用。

2 mtDNA變異在卵巢癌中的臨床應(yīng)用

2.1 早期診斷

如前所述，盡管目前卵巢癌診斷已有多種成熟的方法，但是因特異度或靈敏度不理想，在臨床上使用效果不理想。隨著二代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，mtDNA變異被廣泛應(yīng)用于區(qū)分卵巢癌患者和健康者。越來(lái)越多的研究表明，檢測(cè)mtDNA拷貝數(shù)變異可能有助于從無(wú)癥狀人群中識(shí)別患者［18］。ZACHARIAH等［34］研究報(bào)道，血漿cf-mtDNA數(shù)量與傳統(tǒng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)，如腫瘤分期、腫瘤體積和CA125等無(wú)相關(guān)性，提示cf-mtDNA可能是卵巢癌患者血液循環(huán)中的獨(dú)立標(biāo)志物，可用于腫瘤的早期診斷。但是在卵巢癌的早期階段，單純進(jìn)行CA125檢測(cè)靈敏度并不高。而對(duì)于卵巢癌，早期進(jìn)行cf-mtDNA拷貝數(shù)檢測(cè)，靈敏度為79%，特異度為63%［34］。盡管該實(shí)驗(yàn)中mtDNA檢測(cè)在早期診斷的靈敏度上表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)，但特異度仍不高，且近年來(lái)缺乏相關(guān)研究，因此mtDNA變異在卵巢癌早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值仍有待進(jìn)一步探索和研究。

2.2 鑒別診斷

卵巢癌患者往往雙側(cè)卵巢均受累，然而位于兩側(cè)卵巢之間的子宮卻極少受累。且雙側(cè)卵巢同時(shí)出現(xiàn)病灶時(shí)是同時(shí)發(fā)生，還是一側(cè)癌細(xì)胞經(jīng)由腹膜播散到了對(duì)側(cè)？mtDNA測(cè)序的應(yīng)用或許可以幫助臨床醫(yī)師解答這些疑問。VAN TRAPPEN等［36］對(duì)35例卵巢癌患者的52個(gè)不同腫瘤樣本以及匹配的正常組織的D-loop區(qū)進(jìn)行了測(cè)序，其中17例為雙側(cè)卵巢癌，這17例中有13例患者雙側(cè)卵巢病灶的mtDNA變異相同，4例不同；而來(lái)自同一患者的多個(gè)腫瘤樣本可能含有不同的mtDNA變異，且腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移灶至少與一側(cè)卵巢病灶的突變相同。

體內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)兩種不同腫瘤，這種情況在卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌中較常見［37-39］。mtDNA基因分型可以揭示檢測(cè)到的子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌是否同時(shí)發(fā)生。此外，在交界性卵巢腫瘤和腹膜淺表病變中也存在此情況，mtDNA測(cè)序被證明具有較好的鑒別效果。GIROLIMETTI等［40］對(duì)8例同時(shí)存在交界性卵巢腫瘤和腹壁種植物的患者進(jìn)行了mtDNA測(cè)序，以評(píng)估其克隆性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)37.5%的病例中，交界性卵巢腫瘤和腹膜種植物中都存在相同的mtDNA突變，這表明種植物可能是單一卵巢部位擴(kuò)散的結(jié)果。

2.3 腫瘤進(jìn)展監(jiān)測(cè)

在乳腺癌等腫瘤研究［41］中，不同階段的mtDNA水平已被證實(shí)可用于腫瘤進(jìn)展監(jiān)測(cè)。在卵巢癌中mtDNA水平也同樣可作為監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志物。卵巢癌患者mtDNA拷貝數(shù)增高的水平是否會(huì)隨著腫瘤的進(jìn)展而變化？WANG等［32］研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA拷貝數(shù)變異與卵巢癌患者年齡、腫瘤分期無(wú)關(guān)，但腫瘤病理分級(jí)較低的患者mtDNA拷貝數(shù)顯著高于中高分級(jí)患者。然而，ZACHARIAH等［34］研究表明血漿中的cf-mtDNA可用于評(píng)估腫瘤分期。KESER等［42］收集了24例卵巢癌患者（其中Ⅰ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者各8例）和24名健康志愿者的外周血標(biāo)本進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，晚期卵巢癌患者的mtDNA拷貝數(shù)明顯高于其他組，早期卵巢癌患者的mtDNA拷貝數(shù)也顯著高于健康志愿者。MENG等［43］將165例卵巢上皮性癌患者和60名健康志愿者外周血標(biāo)本中mtDNA上16s RNA基因的79-bp（短）和230-bp（長(zhǎng)）片段進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康志愿者相比，卵巢上皮性癌患者的mtDNA 79和mtDNA 230水平顯著升高，說明mtDNA小片段的增加與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，該研究還發(fā)現(xiàn)mtDNA 79和mtDNA 230的高水平與晚期病理特征和轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)（腹膜及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）。以上研究說明，mtDNA拷貝數(shù)變異可能是卵巢癌進(jìn)展中的重要事件，但是目前相關(guān)研究仍較少，兩者的關(guān)系研究可作為下一步的研究方向。

2.4 化療療效監(jiān)測(cè)

卵巢癌常用的一線化療方案是以鉑類藥物為基礎(chǔ)，紫杉類藥物為輔。同大多數(shù)惡性腫瘤一樣，長(zhǎng)期使用鉑類藥物化療的卵巢癌患者可能產(chǎn)生鉑類藥物耐藥性，從而減弱化療效果，甚至治療無(wú)效。近年來(lái)，學(xué)者們?cè)噲D通過對(duì)腫瘤中的mtDNA變異研究，找到機(jī)體對(duì)鉑類藥物產(chǎn)生耐藥性的原因。史宏暉等［44］檢測(cè)7例初治卵巢癌患者和同期經(jīng)若干療程化療后復(fù)發(fā)的9例卵巢癌患者腫瘤組織及其周圍正常組織中的mtDNA，發(fā)現(xiàn)與初治患者相比，化療后復(fù)發(fā)的患者mtDNA多態(tài)性變化位點(diǎn)明顯增加，而mtDNA突變無(wú)明顯增加。以上結(jié)果提示，mtDNA多態(tài)性變化與突變的發(fā)生機(jī)制可能存在差異。多態(tài)性變化可能與化療等外界因子有關(guān)，對(duì)線粒體功能的影響較??；而突變可嚴(yán)重影響線粒體功能，可能是腫瘤組織固有的，可反映疾病的特性并決定疾病的發(fā)展和預(yù)后。該研究后續(xù)進(jìn)一步針對(duì)20對(duì)卵巢癌組織及其癌旁組織，以及2個(gè)卵巢癌細(xì)胞系及其4個(gè)鉑耐藥細(xì)胞系（SKOV3，A2780等）的mtDNA進(jìn)行測(cè)序，并比較了兩組患者與兩種細(xì)胞系的mtDNA變異、氨基酸改變的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論在體內(nèi)還是體外研究中，mtDNA損傷均可能由化療藥物造成。對(duì)比同一復(fù)發(fā)患者兩次化療前后的組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)其腫瘤組織中的mtDNA突變數(shù)量未明顯增加，說明在卵巢癌中mtDNA損傷可能并不嚴(yán)重［45］。由于該研究的樣本量較小，因此其研究結(jié)果有待進(jìn)一步研究。

目前已有大量研究者致力于在卵巢癌細(xì)胞系中尋找卵巢癌細(xì)胞對(duì)鉑類藥物耐藥的原因。趙晉等［46］發(fā)現(xiàn)，在人卵巢癌耐藥細(xì)胞株中mtDNA點(diǎn)突變明顯高于敏感細(xì)胞株，推測(cè)突變的增加可能與卵巢癌耐藥性有關(guān)。KLEIH等［47］報(bào)道與耐順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞相比，順鉑敏感的卵巢高級(jí)別漿液性上皮性癌細(xì)胞系含有更多的線粒體拷貝數(shù)和更高水平的線粒體ROS（mtROS）。也有研究表明，在人卵巢癌細(xì)胞（OVCAR-3）克隆亞系中，線粒體拷貝數(shù)和基礎(chǔ)耗氧量與順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性相關(guān)。GIROLIMETTI等［48］報(bào)道，接受鉑類藥物治療后，癌細(xì)胞中的mtDNA會(huì)被誘導(dǎo)，經(jīng)紫杉醇陽(yáng)性篩選后，存在mtDNA突變的線粒體，其呼吸功能、增殖和致瘤潛能、遷移和侵襲能力均下降，說明鉑類藥物誘導(dǎo)的有害mtDNA突變會(huì)產(chǎn)生對(duì)紫杉醇的耐藥性。此外，檢測(cè)mtDNA拷貝數(shù)的變異也可用于監(jiān)測(cè)化療藥物療效。KALAVSKA等［49］檢測(cè)67例卵巢癌患者mtDNA含量，其中25例接受紫杉醇+卡鉑化療，42例接受紫杉醇+卡鉑+貝伐珠單抗化療，6個(gè)周期化療后檢測(cè)，結(jié)果顯示mtDNA含量均明顯下降。

3 小結(jié)與展望

以往對(duì)卵巢癌mtDNA變異的研究大多在卵巢組織中進(jìn)行，因難以取樣，研究樣本普遍較少，因此研究結(jié)論意義有限。但隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，可更好地使用石蠟切片和外周血標(biāo)本中的mtDNA對(duì)腫瘤進(jìn)行研究，可減輕對(duì)患者損傷，同時(shí)也可以獲得更加充足的樣本量，是將來(lái)進(jìn)行深入研究的重要手段。但目前mtDNA變異在卵巢癌早期診斷和治療監(jiān)測(cè)中的作用仍所知甚少，未來(lái)還需進(jìn)一步對(duì)mtDNA變異在卵巢癌早期診斷、手術(shù)前后、復(fù)發(fā)前后及化療前后等診療效果監(jiān)測(cè)方面進(jìn)行更深入的研究，以明確mtDNA突變作為卵巢癌可靠生物標(biāo)志物的價(jià)值，以進(jìn)一步提高卵巢癌患者的預(yù)后，改善生存質(zhì)量。