王姝宏 余幼林李凱 林宇晟甘進(jìn)鋒 謝飛凌 李勇 黃思銓張灝

作者單位：510632 廣州 1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)與病理研究所；432000 孝感 2武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院；9700 AD 格羅寧根 3荷蘭格羅寧根大學(xué)醫(yī)學(xué)中心血液科；NSW 2217 悉尼 4澳大利亞新南威爾斯大學(xué)圣喬治醫(yī)院腫瘤中心；999077 香港 5香港理工大學(xué)醫(yī)療及社會科學(xué)院

外泌體攜帶豐富的核酸、蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)等成分，可通過運輸這些內(nèi)容物至靶細(xì)胞，扮演細(xì)胞間信息交換的使者，參與多種生理和病理過程［1-2］。研究表明病理條件下（如腫瘤等），細(xì)胞釋放外泌體的豐度顯著提升，且外泌體內(nèi)容物組分及含量有所不同，說明外泌體內(nèi)容物可用于指示疾病狀態(tài)。更重要的是，大量研究表明腫瘤患者體液（如血液、唾液、尿液、腹水、胸膜積液等）外泌體的內(nèi)容物組分及含量可如實地反映源細(xì)胞的特征和狀態(tài)［1，3-4］。同時，與循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）和循環(huán)腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）相比，外泌體脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)對其內(nèi)容物可起到良好的保護(hù)作用，且外泌體分泌量大，攜帶信息多樣化（核酸、蛋白、脂質(zhì)等），在開發(fā)液體活檢標(biāo)志物方面前景廣闊，可應(yīng)用于腫瘤診斷、療效評價和預(yù)后分析等［4-7］。目前外泌體標(biāo)志物的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，為早期篩查惡性腫瘤提供了新的手段。相較組織活檢外泌體優(yōu)勢為非介入性，可重復(fù)性地獲得樣本，能夠減少組織異質(zhì)性對診斷造成的偏差，同時及時反映疾病發(fā)展的動態(tài)變化。外泌體在腫瘤免疫等極端環(huán)境方面也起重要作用。而靶向外泌體生物過程和以外泌體作為藥物載體的治療也將是腫瘤治療的新興手段［1-2］。此外，細(xì)胞在腫瘤免疫微環(huán)境、低氧、氧化應(yīng)激和致病因素（煙酒暴露）等多種條件下，也可通過外泌體將其內(nèi)容物信息遞送至其他細(xì)胞，從而參與腫瘤免疫、腫瘤轉(zhuǎn)移等病理過程［2］。近年來外泌體相關(guān)研究呈爆發(fā)式增長，相關(guān)技術(shù)（如外泌體提取和示蹤技術(shù)）也取得了長足的發(fā)展，但仍然未能滿足研究或臨床轉(zhuǎn)化的需要。本文對外泌體液體活檢、極端條件下外泌體的功能和機制，以及外泌體提取和示蹤技術(shù)等研究進(jìn)展及前景進(jìn)行綜述和分析。

1 外泌體檢測及示蹤

傳統(tǒng)的外泌體提取方法，如密度依賴的超離和梯度離心都依賴昂貴的設(shè)備且耗時長；過濾法存在外泌體黏附濾器問題；免疫捕獲法可能遺漏某些重要的外泌體亞群；而沉降法雜質(zhì)較多，限制了其臨床推廣應(yīng)用。近期開發(fā)了更快速、更具有指向性的腸道病毒（enterovirus，EV）提取手段：交流電芯片和微流控芯片。KO等［8］利用微流控技術(shù)開發(fā)了一種磁性納米孔分選芯片，基于多種屬性進(jìn)行捕獲，如粒子大小、免疫捕獲和密度等，這種基于芯片的技術(shù)可以實現(xiàn)快速分離提純并已用于分離特定癌癥分泌的外泌體。LEWIS等［9］設(shè)計了一種交流電芯片，可在30 min內(nèi)從全血中捕獲外泌體并進(jìn)行原位免疫熒光分析。這些技術(shù)使外泌體的提取和分析與臨床診斷通道實現(xiàn)無縫銜接，對其臨床應(yīng)用至關(guān)重要。

在外泌體檢測及示蹤技術(shù)方面，傳統(tǒng)的手段存在諸多局限性，包括靈敏度低、耗時長、樣品需求量大，難以實現(xiàn)實時監(jiān)測、大批量檢測等［10］。BETZER等［11］利用葡萄糖圖層金納米粒子（GNP）標(biāo)記外泌體，發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼻給藥的標(biāo)記外泌體在腦部大量積聚，體現(xiàn)出這種外泌體標(biāo)記技術(shù)作為腦部疾病診斷及治療工具的潛力。VERWEIJ等［12］利用綠色熒光蛋白（GFP）衍生物pHluorin標(biāo)記CD63，對外泌體進(jìn)行體內(nèi)示蹤，揭示了內(nèi)源性外泌體的分泌、擴(kuò)散和被靶細(xì)胞攝取的過程?？傊饷隗w示蹤技術(shù)的發(fā)展將為外泌體的體內(nèi)活動可視化提供基礎(chǔ)，促進(jìn)外泌體機制的研究和藥物載體的開發(fā)。

2 外泌體與腫瘤免疫

2.1 腫瘤來源外泌體的抗腫瘤作用

外泌體可參與機體免疫調(diào)節(jié)，如腫瘤來源外泌體（tumor-derived exosomes，TEXs）可攜帶多種分子（腫瘤相關(guān)抗原、共刺激分子及MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子）刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)［13］。外泌體也參與轉(zhuǎn)運機體固有免疫細(xì)胞間抗原成分、殺傷性蛋白分子和炎癥因子等免疫相關(guān)物質(zhì)，活化免疫效應(yīng)細(xì)胞并增強其細(xì)胞免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)固有免疫。機體自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）分泌的外泌體含有Fas配體及穿孔素分子等殺傷性蛋白，發(fā)揮強大的抗腫瘤細(xì)胞毒作用，從而維持機體免疫監(jiān)視及穩(wěn)態(tài)［14］。同時TEXs攜帶的核酸成分能激活樹突狀細(xì)胞中TLR3、cGAS-STING等，同樣發(fā)揮了抗腫瘤免疫應(yīng)答［15-16］。抗原提呈細(xì)胞分泌的外泌體攜帶T淋巴細(xì)胞共刺激分子及MHCⅠ類和Ⅱ類分子，可在不依賴于抗原提呈細(xì)胞的情況下直接激活CD8+T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答［15-17］。而白血病細(xì)胞分泌的外泌體作用于樹突狀細(xì)胞可以有效促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖，以及輔助T細(xì)胞對細(xì)胞因子的分泌，激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答［18］。

2.2 腫瘤來源外泌體抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)

TEXs可以降低樹突狀細(xì)胞的分化和成熟，減少NK細(xì)胞活化受體的表達(dá)，抑制T細(xì)胞增殖、活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。TEXs也可促進(jìn)骨髓源性免疫抑制細(xì)胞（MDSC）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Breg）分化和增殖，導(dǎo)致免疫抑制。有研究報道卵巢癌等腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可通過攜帶免疫抑制分子而下調(diào)抗原提呈細(xì)胞的抗原提呈能力［19］，誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞凋亡［20］，從而抑制機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。在乳腺癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)其外泌體表面表達(dá)細(xì)胞因子TGF-β、IL-10和前列腺素E2，可顯著抑制T細(xì)胞增殖［21］。也有研究報道，TEXs攜帶的PD-L1可通過與PD-1結(jié)合，從而抑制CD8+T細(xì)胞增殖［22］。而CD4+T細(xì)胞增殖和分化也可被TEXs抑制［23］。GOBBO等［24］研究顯示，TEXs可誘導(dǎo)骨髓前體細(xì)胞分化為MDSCs，其攜帶的多種熱休克蛋白能激活MDSCs，從而增強MDSC的免疫抑制功能。在食管癌中，TEXs可通過誘導(dǎo)初始B細(xì)胞分化為表達(dá)TGF-β的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞，從而抑制CD8+T細(xì)胞活化［25］。

巨噬細(xì)胞具有高度可塑性，TEXs可改變其極化類型，包括M1型和M2型。M1型可分泌促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，參與抗原呈遞和抗腫瘤免疫反應(yīng)；M2型則分泌抑制性細(xì)胞因子，具有促癌功能，而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞即屬于M2型［26］。在胰腺癌中，TEXs可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2分化，并促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移［27］。也有研究發(fā)現(xiàn)，肝臟Kupffer細(xì)胞攝取胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體后可分泌TGF-β，從而募集更多的骨髓源性巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)肝臟形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境，增加肝臟轉(zhuǎn)移性負(fù)擔(dān)［28］。在腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成的過程中，肺臟上皮細(xì)胞TLR3也可通過識別腫瘤細(xì)胞來源的外泌體攜帶的RNA分子，上調(diào)多個趨化因子，募集中性粒細(xì)胞到達(dá)肺臟部位，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移［29］。此外，腫瘤細(xì)胞也可通過外泌體調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答。腫瘤外泌體可傳遞自身的瘤源性受體、蛋白質(zhì)及RNA給受體細(xì)胞而塑造腫瘤生長的微環(huán)境，其表面表達(dá)免疫抑制分子，可負(fù)性調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在黑色素瘤外泌體研究中觀察到外泌體可誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞向促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的表型分化［30］。總之，腫瘤源性外泌體發(fā)揮抑制腫瘤特異性的免疫應(yīng)答［31-32］。

2.3 腫瘤來源外泌體與腫瘤免疫治療

免疫治療在臨床腫瘤治療上展現(xiàn)了良好的應(yīng)用價值，目前研究認(rèn)為TEXs也參與了腫瘤免疫治療。研究發(fā)現(xiàn)，人類黑色素瘤細(xì)胞的外泌體攜帶PD-L1，而外泌體PD-L1可直接與T細(xì)胞結(jié)合抑制其功能，因此可通過測量治療前的PD-L1水平預(yù)測患者的腫瘤負(fù)荷程度及治療的有效性［22］。但是不同患者、不同腫瘤類型對免疫治療的敏感性存在差異。目前臨床上只有10%～30%的患者對PD-L1/PD-1抗體治療有效，部分原因可能是細(xì)胞外的PD-L1可通過抑制局部或全身免疫反應(yīng)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，因此阻斷腫瘤細(xì)胞分泌攜帶PD-L1的外泌體可以提高抗腫瘤免疫反應(yīng)而延長生存期。外泌體PD-L1也可在引流淋巴結(jié)處抑制T細(xì)胞功能，從而導(dǎo)致PD-L1抗體治療的耐受性［33］。可見，腫瘤的免疫逃逸不僅與細(xì)胞膜PD-L1相關(guān)，還可能與外泌體PD-L1相關(guān)。因此，阻斷外泌體PD-L1與PD-1結(jié)合可發(fā)揮免疫治療作用。PD-L1表達(dá)水平在部分腫瘤如黑色素瘤，可作為預(yù)測免疫治療療效的生物標(biāo)志物；連續(xù)監(jiān)測外周血中可溶性PD-L1和外泌體PD-L1的變化有助于指導(dǎo)患者的免疫治療。此外，游離PD-L1可能與PD-L1抑制劑原發(fā)耐藥相關(guān)。因此，聯(lián)合使用抑制外泌體釋放的小分子藥物和免疫檢查點抑制劑是提高療效的潛在有效手段［34］。

綜上，腫瘤外泌體具有激活或抑制免疫的雙重作用，且參與免疫治療，其具體的主導(dǎo)作用可能與腫瘤類型、腫瘤分期、外泌體種類及內(nèi)容物有關(guān)。因此認(rèn)為，在時空上對外泌體進(jìn)行更細(xì)致的分類研究，將有助于闡明特定條件下外泌體在腫瘤免疫中的真正作用。

3 極端條件下的外泌體

3.1 微酸環(huán)境

腫瘤等疾病中的酸性微環(huán)境可改變外泌體的形成與釋放。以黑色素瘤為例，微酸不僅能增加腫瘤細(xì)胞外泌體釋放，還能增加外泌體中脂質(zhì)體的修飾，且針對性地抑制酸度后，外泌體的釋放量顯著降低，此外腫瘤酸性環(huán)境所導(dǎo)致的外泌體釋放增加也可能是腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的一種適應(yīng)機制［35］。最近也有研究報道腫瘤患者中的外泌體數(shù)量顯著高于非腫瘤患者，尤其在黑色素瘤和前列腺癌中，3種不同的捕獲方法均證實腫瘤患者的外泌體含量顯著升高，體外實驗也證明外泌體分泌的增加依賴酸性環(huán)境［36］。以上研究結(jié)果為闡明腫瘤進(jìn)展機制提供了新的理論，也提示靶向腫瘤酸性環(huán)境或靶向腫瘤外泌體的釋放可能是腫瘤治療的新策略。

3.2 乏氧環(huán)境

乏氧是腫瘤環(huán)境的主要特征之一，大量研究表明低氧可促進(jìn)外泌體的釋放和腫瘤血管生成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移并改變腫瘤的免疫環(huán)境［37-38］。乏氧誘導(dǎo)外泌體的分泌增加及其對腫瘤進(jìn)展的作用日益受關(guān)注，但是仍需更進(jìn)一步研究，以更好地了解缺氧條件下外泌體產(chǎn)生和釋放的機制，實現(xiàn)靶向外泌體治療手段的開發(fā)。

3.3 氧化應(yīng)激

研究表明，氧化應(yīng)激可以促進(jìn)肥大細(xì)胞釋放外泌體，從而向暴露于氧化應(yīng)激下的受體細(xì)胞傳遞保護(hù)信號，進(jìn)而減少細(xì)胞死亡［39］。有研究［40］將 Jurkat和Raji細(xì)胞系作為研究T細(xì)胞和B細(xì)胞白血病/淋巴瘤中NKG2D受體-配體系統(tǒng)的模型，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激可顯著增加Jurkat和Raji白血病/淋巴瘤細(xì)胞的外泌體分泌。而外泌體攜帶NKG2D配體，可導(dǎo)致體外NKG2D受體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性下調(diào)，從而損害NK細(xì)胞功能。這一結(jié)果可部分解釋白血病/淋巴瘤患者臨床觀察到的NK細(xì)胞功能障礙。因此，設(shè)計細(xì)胞抑制和高溫抗癌療法時，應(yīng)考慮熱和氧化應(yīng)激引起的免疫抑制性外泌體釋放。

3.4 煙酒暴露

在多種腫瘤中，吸煙和飲酒被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的危險因素。近期研究也發(fā)現(xiàn)吸煙和飲酒可對外泌體的形成與分泌產(chǎn)生影響。如酒精的暴露可影響小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的活力、凋亡和細(xì)胞周期，還可影響與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運、囊泡形成和分泌相關(guān)蛋白Rab的分布，從而影響外泌體的生物形成，并促進(jìn)熱休克蛋白組裝至外泌體中［41］。BABUTA 等［42］研究報道，溶酶體功能在慢性酒精性肝病中有缺陷，可導(dǎo)致自噬破壞和外泌體分泌增加。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)暴露于香煙煙霧提取物可以促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞分泌外泌體，后者可通過抑制成纖維細(xì)胞自噬導(dǎo)致組織重塑［43］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧提取物不僅可誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞外泌體的產(chǎn)生，還可通過其引起的機體氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生氧化產(chǎn)物，如丙烯醛而促進(jìn)EVs釋放［44］。由此認(rèn)為，吸煙飲酒導(dǎo)致的外泌體變化可能是促進(jìn)腫瘤發(fā)展的重要機制之一。

綜上，不同的應(yīng)激和極端條件可影響外泌體的形成和釋放。外泌體通過傳遞各種信號分子參與調(diào)節(jié)多種信號通路，影響細(xì)胞間的信息交流作用，調(diào)控受體細(xì)胞活性，從而參與不同極端條件對疾病的調(diào)節(jié)作用。這些研究結(jié)果也提示，不同刺激和極端條件誘導(dǎo)釋放的外泌體所攜帶的內(nèi)容物改變，與相關(guān)疾病過程密切相關(guān)，具有作為特異性指示疾病發(fā)生和進(jìn)展標(biāo)志物以及治療靶標(biāo)的潛力。

4 小結(jié)與展望

獲得用于檢測外泌體生物標(biāo)志物的腫瘤組織樣本是實現(xiàn)個性化精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的重要環(huán)節(jié)。然而，侵入性手術(shù)存在組織數(shù)量有限，獲得的組織質(zhì)量不合格，由于腫瘤位置難以進(jìn)行活檢以及手術(shù)和患者管理成本高等問題。因此，開發(fā)循環(huán)外泌體生物標(biāo)志物，特別是用于腫瘤診斷的外泌體RNA，成為一個新的方向。目前研究顯示外泌體RNA在癌細(xì)胞通訊中具有重要作用，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，甚至轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官，在非侵入性腫瘤診斷以及預(yù)后和治療療效預(yù)測中具有巨大潛力。然而外泌體標(biāo)志物的研究仍存在許多問題亟待解決：一方面，目前雖然外泌體的分離方法豐富多樣，但是均難以將外泌體與其他細(xì)胞外囊泡亞群徹底分離；另一方面，雖然外泌體有豐富的內(nèi)涵物，但豐度普遍偏低，致使外泌體標(biāo)志物的診斷效率與實際臨床應(yīng)用存在較大差異。因此，標(biāo)準(zhǔn)化的提取和分析技術(shù)以及組學(xué)的、圖譜式的標(biāo)志物概念是外泌體轉(zhuǎn)化應(yīng)用到臨床的關(guān)鍵。未來需進(jìn)一步探索其檢測方法包括提取方案和分子診斷平臺的標(biāo)準(zhǔn)化甚至自動化，以實現(xiàn)分批測定及各研究結(jié)果的可比性。此外，未來還需對外泌體在時空上進(jìn)行更加細(xì)致的分類研究，找到高效、簡捷的提取方法，開發(fā)特異性干預(yù)外泌體生物過程的技術(shù)手段，才能更好地推動外泌體向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。