傅瀟 姚煜

作者單位：710061 西安 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）是指在腫瘤形成和發(fā)展過程中，從實體腫瘤病變脫落并進(jìn)入血流循環(huán)的腫瘤細(xì)胞［1］。CTC是腫瘤發(fā)生發(fā)展的直接證據(jù)，真實反映了腫瘤負(fù)荷和特征，并可以提示療效及預(yù)后。既往研究認(rèn)為CTC的出現(xiàn)即提示腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，然而近期研究在早期腫瘤患者外周血中也發(fā)現(xiàn)了CTC的存在，因此CTC也可用于早期診斷。此外，與循環(huán)腫瘤DNA/RNA和腫瘤細(xì)胞來源外泌體相比，CTC還可進(jìn)行RNA和蛋白組學(xué)的表達(dá)譜分析、體外細(xì)胞形態(tài)和功能研究以及信號共定位展示等，為個體化治療提供了堅實基礎(chǔ)。雖然CTC檢測具有方便、快捷、無創(chuàng)和可重復(fù)采樣等優(yōu)勢，但是外周血中CTC數(shù)量非常少（轉(zhuǎn)移性乳腺癌中每106～108個有核細(xì)胞僅有1個CTC），通常需要富集之后再進(jìn)行檢測或分析。以往因受限于提取和富集技術(shù)，CTC并未得到進(jìn)一步研究和應(yīng)用。直至近十幾年，基于CTC物理特性和分子生物學(xué)特征的分離、提取和富集技術(shù)的發(fā)展，CTC才被應(yīng)用于臨床，并獲批為腫瘤標(biāo)志物，在腫瘤的早期診斷及療效和預(yù)后評估中凸顯優(yōu)勢，現(xiàn)就CTC的發(fā)展歷史、提取技術(shù)及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 CTC發(fā)展概況

1869年Thomas Ashworht首次報道了CTCs的存在［2］。之后Stephen Paget等提出了“種子與土壤”假說，認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制是癌細(xì)胞通過血液和淋巴擴(kuò)散至身體不同地方，從而誘導(dǎo)周圍正常細(xì)胞形成“腫瘤微環(huán)境”［3］。1998年，CTC首次從血液中分離，并被證實與病理分期相關(guān)［4］。此后，CTC才被應(yīng)用于臨床。發(fā)表在N Engl J Med的一項前瞻性研究結(jié)果提示CTC數(shù)目是預(yù)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）的獨立預(yù)后因子［5］。自此CTC被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的“前兆”，即CTC是腫瘤轉(zhuǎn)移病灶（血行轉(zhuǎn)移）形成的“種子”細(xì)胞，部分細(xì)胞可在循環(huán)中存活，并在遠(yuǎn)端器官與新的微環(huán)境相互作用下形成轉(zhuǎn)移灶。因此2007年，CTC被美國臨床腫瘤學(xué)會（ASCO）納為腫瘤標(biāo)志物。然而，2010年發(fā)表在J Clin Invest的研究表明，腫瘤早期也發(fā)現(xiàn)CTC的存在［6］?；诖耍?012年病理學(xué)年鑒不再認(rèn)為血液中發(fā)現(xiàn)CTC僅提示腫瘤轉(zhuǎn)移的“前兆”。目前隨著高通量測序技術(shù)和單細(xì)胞測序技術(shù)的出現(xiàn)，CTC全外顯子測序和單細(xì)胞測序?qū)⒂兄诟M(jìn)一步揭示腫瘤異質(zhì)性和腫瘤演進(jìn)過程。

2 CTC分離、富集和檢測技術(shù)

CTC的應(yīng)用與分離技術(shù)發(fā)展密切相關(guān)。第一代CTC分離技術(shù)主要依靠CTC物理特征，如基于細(xì)胞大小和密度法是通過膜過濾、密度梯度離心等方法進(jìn)行分離。這一類方法不依賴CTC抗原表達(dá)情況，操作方便，但因CTC變形性以及密度差異易導(dǎo)致漏檢，影響分離效果。第二代分離技術(shù)是基于CTC表面抗原的表達(dá)，利用免疫磁珠進(jìn)行分選。從本質(zhì)上講，這種方法可以分為兩大類：基于特定抗原的表達(dá)捕獲CTC細(xì)胞的陽性選擇和耗盡給定樣品中非CTC的所有細(xì)胞的陰性選擇。目前唯一獲得FDA批準(zhǔn)的Cell Search系統(tǒng)［7］就是利用表面抗原的表達(dá)進(jìn)行CTC分選。但該方法受上皮標(biāo)志物表達(dá)影響。到目前為止，仍未有公認(rèn)和普適性的腫瘤表面抗原標(biāo)志物，原因有以下幾方面：⑴并非所有腫瘤細(xì)胞均表達(dá)上皮標(biāo)志物，例如黑色素瘤并不表達(dá)上皮標(biāo)志物。⑵腫瘤細(xì)胞入血時會發(fā)生上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal translation，EMT），下調(diào)上皮標(biāo)志物表達(dá)量，導(dǎo)致磁珠對CTC的吸附能力下降，影響檢出率。⑶在正常情況下，有極少量的正常上皮細(xì)胞脫落入血，或者腫瘤患者在進(jìn)行手術(shù)或其他創(chuàng)傷性治療后，上皮細(xì)胞可進(jìn)入血液，導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。第三代分離技術(shù)是利用芯片，包括CTC芯片和微流控芯片等對CTC進(jìn)行分離、富集。該技術(shù)并不是一種獨立的分離技術(shù)，而是優(yōu)化各類技術(shù)的一種手段。該技術(shù)分離原理多樣，包括基于腫瘤細(xì)胞大小、流體力學(xué)特性、表面分子標(biāo)記以及去除白細(xì)胞進(jìn)行陰性富集等［8］。第一代芯片以CTC-Chip為代表，包括Captura公司的GEDI-Chip和Biocept公司的OncoCEE微流微柱富集，主要是利用CTC與血細(xì)胞生化特性的差異，在芯片中設(shè)置微柱陣列將CTC從血液中分離出來。然而，微柱設(shè)計比較復(fù)雜，難以進(jìn)行高通量生產(chǎn)。第二類芯片是以HB-Chip為代表，包括GEM-Chip、GO-Chip以及BioFluidica公司的Modular Sinusoidal Microsystem微流表面富集，此類芯片使用抗體包被捕獲CTC，能更高效地捕獲CTC，捕獲效率約為90%，更適合大規(guī)模生產(chǎn)。但是，這類芯片所捕獲的CTC被固定在抗體包被的裝置表面，難以進(jìn)一步分離。雖然胰蛋白酶能將CTC從裝置表面消化并釋放，但是經(jīng)胰蛋白酶消化釋放的CTC可能失去很多有意義的表面受體。第三代芯片以CTC-iChip為代表，包括Ephesia公司的Ephesia，Cynvenio公司的Liquid Biopsy和Fluxion公司的Isoflux微流免疫磁珠富集，這類芯片將免疫磁珠和微流控富集技術(shù)相結(jié)合，捕獲效率與第二代芯片相當(dāng)。以上芯片均基于CTC化學(xué)特性或表面生物標(biāo)志物進(jìn)行分離，目前也有基于CTC物理特性進(jìn)行分選的分離技術(shù)，包括基于細(xì)胞大小和變形性差異的芯片技術(shù)，基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的芯片技術(shù)和基于細(xì)胞介電性質(zhì)的雙向電泳技術(shù)等。

CTC檢測主要包括從蛋白、染色體、DNA和RNA水平實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的定性工作。在蛋白水平，利用免疫熒光標(biāo)記，如選用CD45-/CK+/DAPI+作為腫瘤細(xì)胞定性的標(biāo)志物，EPISPOT方法可以區(qū)分凋亡和有活性的CTC。細(xì)胞骨架蛋白對上皮細(xì)胞具有特異性，因此細(xì)胞角蛋白家族成員（CK8、CK18和CK19）也成為檢測上皮表型CTC的標(biāo)志物［9］。鑒于上皮標(biāo)志物的局限性，針對干細(xì)胞標(biāo)志物（CD133），間充質(zhì)標(biāo)志物（波形蛋白）和腫瘤組織特異性抗原，例如前列腺特異性抗原（PSA）、乳腺特異性抗原乳珠蛋白等也被用于CTC檢測。在染色體水平，熒光原位雜交技術(shù)能檢測特定染色體的擴(kuò)增情況和靶基因的擴(kuò)增情況；在DNA水平，基因測序和ARMS可以檢測到豐度低至0.1%～1.0%的突變基因；在RNA水平，基因表達(dá)圖譜和qPCR技術(shù)可檢測CTC基因表達(dá)水平。

3 CTC對腫瘤早期診斷的作用

傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查難以發(fā)現(xiàn)腫瘤早期病灶。當(dāng)病灶＜1 cm時，CTC檢測有可能早于影像學(xué)或臨床表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤，從而實現(xiàn)早期診斷。法國巴斯德醫(yī)院一項研究納入了168例慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者、42 例吸煙者和35名健康人，研究發(fā)現(xiàn)168例COPD患者中CTC陽性的5例患者在隨訪的5年內(nèi)均被診斷為肺癌［10］?；诖隧椦芯拷Y(jié)果，LEROY等［11］在法國21個研究中心開展了一項前瞻性、非隨機(jī)、多中心、雙盲AIR研究（NCT02500693），以期在肺癌高危人群（吸煙者、COPD患者等）中探討CTC對肺癌發(fā)生的預(yù)測作用。近年研究還發(fā)現(xiàn)具有特定核型或分子標(biāo)記的CTC在腫瘤早期診斷中發(fā)揮了重要作用。一項納入136例新診斷的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者、142 例肺部良性疾病患者和32名健康受試者的臨床研究，通過陰性富集技術(shù)和FISH技術(shù)檢測8號染色體擴(kuò)增型CTC，發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)量能較好地區(qū)分NSCLC及肺部良性疾病患者［12］。CTC中8號染色體的計數(shù)和非整倍性還在鼻咽癌早期診斷中有一定臨床意義［13］。近期的一項研究在低劑量CT提示肺部結(jié)節(jié)的患者中，以組織活檢結(jié)果作為對照，通過檢測10q22.3/CEP10和3p22.1/3q29 FISH探針標(biāo)記的CTC，與組織活檢相比，10q22.3/CEP10和3p22.1/3q29標(biāo)記的CTC診斷肺癌的準(zhǔn)確性為94.2%，敏感性為89.0%，特異性為100.0%［14］。在乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌中，干細(xì)胞樣CTC對早期肝細(xì)胞癌診斷具有較高的敏感性（82.1%）和特異性（94.2%），并且能區(qū)分肝癌、乙肝和肝硬化［15］。此外，CTC與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合也有助于提高腫瘤早期診斷的準(zhǔn)確性。一項納入155例前列腺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，PSA、CTC和12基因檢測平臺結(jié)合后，診斷的準(zhǔn)確性達(dá)92.7%，CTC還與更高的Gleason評分和高風(fēng)險相關(guān)［16］。CTC與包含CCNE2、DKFZp762E1312、EMP2、MAL2、PPIC和SLC6A8的6基因檢測平臺相結(jié)合也有助于女性生殖系統(tǒng)腫瘤的早期診斷，聯(lián)合診斷宮頸癌的準(zhǔn)確率達(dá)44%，對子宮內(nèi)膜癌診斷準(zhǔn)確率達(dá)64%，對卵巢癌診斷準(zhǔn)確率為19%［17］。

雖然CTC最早被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期分子標(biāo)志，但是隨著CTC在早期腫瘤患者外周血中的發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究提示CTC不僅對早期腫瘤診斷具有重要的作用，而且與腫瘤分級和TNM分期也具有相關(guān)性。

4 CTC在腫瘤療效和預(yù)后評估中的作用

CTC已被認(rèn)為是一個可靠的預(yù)后指標(biāo)，無論在手術(shù)、化療、放療、靶向治療及免疫治療過程中都顯示出了良好的療效和預(yù)后評估價值。

在手術(shù)治療方面，LI等［18］在可手術(shù)切除的NSCLC患者中發(fā)現(xiàn)，術(shù)前外周血和靜脈血CTC計數(shù)是治療失敗時間（time to failure of strategy，TFS）和OS的獨立危險因素，而術(shù)中首先離斷流出靜脈可減少腫瘤細(xì)胞的播散，改善NSCLC患者的生存結(jié)局［19］。也有研究證實術(shù)前肺靜脈CTC陽性預(yù)示更高的疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險［20］。一項納入 200例胰腺癌患者的前瞻性CLUSTER研究提示，無論是否接受新輔助化療，術(shù)前CTC計數(shù)與胰腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)顯著相關(guān)［21］。因此，術(shù)前CTC檢測不僅可預(yù)測無疾病生存期，也為手術(shù)方式和術(shù)后治療方案的選擇提供依據(jù)。

在化療方面，有研究報道晚期NSCLC患者化療后CTC數(shù)量下降與更長的PFS顯著相關(guān)，而治療前高CTC計數(shù)與更差的病理分期和更高轉(zhuǎn)移率相關(guān)［22-23］。在乳腺癌中，新輔助治療前CTC陽性被認(rèn)為是獨立預(yù)后因素，結(jié)合pCR有助于識別需治療干預(yù)的乳腺癌患者［24］。SPARANO 等［25］在Ⅱ～Ⅲ期 HER2陰性接受術(shù)后輔助治療的乳腺癌患者研究中也發(fā)現(xiàn)，CTC與臨床復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)。一項納入了430例接受化療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的前瞻性、多中心臨床研究也證實，治療前和治療過程中的CTC數(shù)量是轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者PFS和OS的獨立預(yù)測因素［26］。動態(tài)監(jiān)測CTC數(shù)量變化對療效評估和預(yù)測預(yù)后具有重要作用。除CTC數(shù)量外，在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中，CTC中不同雄激素受體（AR）剪切體也被證實與卡巴他賽療效相關(guān)［27］。

在放療方面，迄今最大規(guī)模的綜合了來自美國國家癌癥數(shù)據(jù)庫的1 697例和Ⅲ期SUCCESS研究的1 516例早期乳腺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，放療顯著延長了CTC陽性患者的局部無復(fù)發(fā)生存期（local recurrencefree survival，LRFS）和OS［28］。Ⅲ期隨機(jī) CONVERT 研究（NCT00433563）則證實了CTC數(shù)量預(yù)測接受放療局限期小細(xì)胞肺癌的療效［29］。PREDICT-HN研究（NCT03491176）提示，在頭頸部腫瘤中，CTC聯(lián)合MRI能更好評估放療療效，并為后續(xù)放療劑量選擇提供依據(jù)。在局部晚期直腸癌中，CTC數(shù)量變化和CTC中胸苷酸合酶（TYMS）和切除修復(fù)蛋白RAD23同系物B（RAD23B）表達(dá)變化與接受新輔助同步放化療后的pCR相關(guān)，檢測CTC數(shù)量和TYMS、RAD23B表達(dá)的變化能夠預(yù)測局部晚期直腸癌患者對新輔助放化療療效，為下一步治療提供決策［30］。由此可見，CTC不僅能夠預(yù)測放療療效，還可能為優(yōu)化放療人群和放射劑量提供依據(jù)。

在靶向治療方面，表達(dá)特定靶點CTC的變化能夠預(yù)測靶向治療療效。在41例接受培美曲塞聯(lián)合厄洛替尼的EGFR突變晚期NSCLC患者中，78%的患者在治療基線的外周血中檢測到CTC，且高水平CTC與不良預(yù)后相關(guān)；治療過程中，CTC水平下降與療效呈正相關(guān)［31］。JIANG 等［32］在 232例一線接受EGFR-TKI治療的EGFR突變晚期NSCLC患者中證實，葉酸受體陽性CTC計數(shù)可用于動態(tài)監(jiān)測和預(yù)測EGFR-TKIs療效和患者預(yù)后。PAILLER等［33］通過FISH技術(shù)檢測18例ALK陽性的NSCLC患者CTC中的ALK重排情況，發(fā)現(xiàn)CTC與組織ALK重排具有較高的一致性，認(rèn)為CTC可作為ALK陽性NSCLC的補(bǔ)充診斷，同時監(jiān)測ALK抑制劑療效。新近研究還發(fā)現(xiàn)CTC可用于探索ALK抑制劑的耐藥機(jī)制［34］。CTC不僅代表了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)和基因組學(xué)特性，而且反映了腫瘤的異質(zhì)性。在納入19例ER+/HER2-乳腺癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，84%的患者在治療過程中獲得了表達(dá)HER2的CTC，隨后的功能學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，HER2+CTC增殖能力更強(qiáng)，且不依賴HER2通路；而HER2-CTC中Notch通路和DNA損傷通路被激活［35］。之后也有研究報道HER2+CTC的轉(zhuǎn)移性HER2陰性乳腺癌患者能從HER2靶向治療中獲益［36］。

在近年來興起的免疫治療中，發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)量和CTC表面PD-L1表達(dá)的動態(tài)變化與Nivolumab療效相關(guān)［37］。然而，也有研究報道在接受Nivolumab治療的Ⅳ期NSCLC中未發(fā)現(xiàn)治療前PD-L1+CTC與預(yù)后有相關(guān)性，但對Nivolumab原發(fā)耐藥的患者治療基線時具有更高的 PD-L1+CTC數(shù)（≥1%）［38］。在頭頸鱗癌中，PD-L1+CTC 提示更短的 PFS和OS［39］。在肝癌、胃癌和胃食管結(jié)合部癌中，檢測CTC表面PD-L1的表達(dá)也可用于預(yù)測PD-1抑制劑SHR-1210的療效［40］。與腫瘤組織中PD-L1表達(dá)情況相似，CTC中PD-L1表達(dá)與免疫檢查點抑制劑療效的關(guān)系也仍需進(jìn)一步探索。除PD-L1外，CTC中MART-1、MAGE-A3和PAX3表達(dá)也被證實與免疫治療療效相關(guān)［41］。此外，CTC與免疫細(xì)胞活性、血小板等腫瘤微環(huán)境檢測相結(jié)合，能共同分析腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險，有利于更全面評估預(yù)后［42］。

除CTC數(shù)量外，CTC簇、CTC染色體改變、基因突變和基因表達(dá)、細(xì)胞分型等也被證實與腫瘤療效和預(yù)后相關(guān)。CTC簇被認(rèn)為是乳腺癌轉(zhuǎn)移的寡克隆前體［43］，且能通過改變DNA甲基化，促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移［44］。CARTER 等［45］探討了 CTC 拷貝數(shù)畸變在預(yù)測小細(xì)胞肺癌化療耐藥中的作用，發(fā)現(xiàn)CTC拷貝數(shù)畸變區(qū)分化療敏感組或耐藥組的準(zhǔn)確率達(dá)83.3%，且兩組患者的PFS差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在結(jié)直腸癌CTC中，鳥苷酸交換因子表達(dá)升高與較短的PFS呈正相關(guān)［46］。在胰腺癌中，不同CTC細(xì)胞分型也與預(yù)后相關(guān)：上皮型CTC的存在與不良預(yù)后相關(guān)，可作為獨立的預(yù)后預(yù)測因子，同時上皮型、間質(zhì)混合型CTC與復(fù)發(fā)密切相關(guān)［47］。在多發(fā)性骨髓瘤中，二代測序結(jié)果表明CTC和對應(yīng)的骨髓細(xì)胞中的基因表達(dá)具有高度一致性，CTC中CD44的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)［48］。不僅如此，在乳腺癌中，全基因組測序結(jié)果提示CTC中信號量4D與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)生相關(guān)［49］。因此，根據(jù)CTC染色體和基因突變以及表達(dá)情況對CTC進(jìn)行分型，確定具有特殊臨床意義（如耐藥、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等）的CTC亞型，能夠為后續(xù)CTC單細(xì)胞研究提供更明確的指導(dǎo)意義。

5 小結(jié)

CTC可作為分析患者腫瘤生物學(xué)特征的樣本，目前研究認(rèn)為CTC有助于及時發(fā)現(xiàn)腫瘤的生物學(xué)變化，并為及時調(diào)整治療方案提供參考，從而實現(xiàn)實時、個體化治療，是目前具有發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無創(chuàng)診斷和實時療效監(jiān)測手段。與傳統(tǒng)的影像學(xué)診斷、內(nèi)窺鏡檢查以及病理學(xué)診斷相比，CTC對發(fā)現(xiàn)疾病變化更敏感，能更科學(xué)、迅速地評價療效。2019年NCCN乳腺癌指南已引入cM0（i+）分期，確認(rèn)CTC在腫瘤分期系統(tǒng)中的重要意義。我國也發(fā)表了《循環(huán)腫瘤細(xì)胞在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用專家共識》，明確了CTC在動態(tài)評估結(jié)直腸癌患者疾病狀態(tài)、早期篩查、預(yù)后評估及治療反應(yīng)監(jiān)測中的重要作用。同時得益于分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，CTC的研究和應(yīng)用將不僅僅局限于疾病篩查、診斷、療效和預(yù)后評估，CTC細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和基因組學(xué)的特征已受到了越來越多的關(guān)注。此外，還有研究將CTC進(jìn)行改造，使其表達(dá)TGF-β；或?qū)TC作為藥物運輸載體，靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，且發(fā)現(xiàn)改造后或攜帶藥物的CTC具有抑制腫瘤效應(yīng)，但是這些研究仍在臨床前階段，需要更進(jìn)一步探索。