翟紅梅， 張澤宇2， 杜天慶， 楊舒添， 高志強(qiáng)， 崔福柱

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 山西 太谷 030801； 2.山西應(yīng)用科技學(xué)院， 山西 太原 030062)

硒在生物體中起著重要的作用，被稱為“生命的火種”，硒在增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗癌、預(yù)防心血管疾病、解毒等方面有顯著作用[1-3]。而中國2/3的土壤處于缺硒狀態(tài)，導(dǎo)致食物營養(yǎng)狀況被制約[4]。植物作為人和動物攝入硒的重要環(huán)節(jié)，也是唯一的直接來源[5-6]。人體補(bǔ)充硒營養(yǎng)的根本途徑就是提高農(nóng)產(chǎn)品硒水平[7]。紅蕓豆是十分重要的蛋白來源，富含多種人體所需的氨基酸，籽粒營養(yǎng)豐富，兼有藥用價值，深受國內(nèi)外市場歡迎[8-9]。因此，通過施加硒肥提高紅蕓豆硒含量十分重要。

微肥常用的方法之一就是浸種，目前有諸多關(guān)于硒浸種對作物種子萌發(fā)方面的研究[10-13]。大量研究表明，硒浸種可以有效促進(jìn)大豆、綠豆、豌豆等種子萌發(fā)，提高種子發(fā)芽率[14-16]，并且適當(dāng)硒濃度可以有效提高種子萌發(fā)過程中SOD、SOD、PPO等氧化酶活性，此外，硒浸種還能促進(jìn)種子萌發(fā)過程中可溶性糖、可溶性蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)的合成。而有關(guān)紅蕓豆硒浸種的研究寥寥無幾。周大寨等在研究硒浸種對蕓豆萌發(fā)的影響時發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量的硒處理能夠促進(jìn)蕓豆種子萌發(fā)，高質(zhì)量的硒處理抑制蕓豆種子萌發(fā)[17]。大部分有關(guān)硒浸種的研究采用無機(jī)硒處理，關(guān)于有機(jī)硒浸種的研究鮮有報道。因此，本試驗通過比較2種硒源浸種處理下紅蕓豆種子萌發(fā)情況，各生理指標(biāo)及硒含量的變化，探討適宜硒源及最佳硒浸種濃度，為生產(chǎn)富硒紅蕓豆提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蕓豆材料為英國紅蕓豆，是山西境內(nèi)種植的主要蕓豆品種。該品種籽粒營養(yǎng)豐富，是出口創(chuàng)匯的優(yōu)質(zhì)品種。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2018年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)栽培實驗室進(jìn)行。選取大小均勻，健康飽滿的紅蕓豆種子，采用有機(jī)硒和無機(jī)硒2種硒肥浸種，2種硒源各設(shè)7個濃度梯度：0，7.5，15，22.5，30，37.5，45 mg·L-1(以純硒計算)。3次重復(fù)，共42個處理。先用1%的氯化汞浸種消毒5 min，然后將消毒后的種子放入相應(yīng)濃度的2種硒源中浸種6 h，隨后放入消毒過的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿鋪2層含飽和水分的濾紙，各均勻放入20粒紅蕓豆種子，腹溝向下，種胚朝上。在25 ℃下模擬黑白交替發(fā)芽，每天噴灑蒸餾水，使種子保持較濕潤的狀態(tài)，每天記錄發(fā)芽種子數(shù)。

1.3 樣品采集與測定

在蕓豆發(fā)芽期間，第4天計算發(fā)芽勢，第7天統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)，隨機(jī)測量5株幼苗的苗長、根長、稱量單株幼苗鮮重、苗干重，取平均值，計算簡化活力指數(shù)和抑制率，并測定相關(guān)生理指標(biāo)。

生理指標(biāo)測定[18]：過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法，超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍(lán)四唑法，丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法。

DPPH自由基清除能力的測定[19]：利用DPPH溶液與上清液作用使DPPH紫色消退導(dǎo)致吸收光譜強(qiáng)度變化的原理，通過加入上清液前后吸光度的線性變化計算自由基清除率。

蕓豆幼苗硒含量測定[20]：從每個處理中隨機(jī)稱取烘干后的幼苗，用粉碎機(jī)粉碎，采用 HNO3∶H2O2=6∶2 在微波消解儀中消解，利用ICP-MS(電感耦合等離子體-質(zhì)譜法)測定硒含量。

發(fā)芽率(%)=(第7天發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子總粒數(shù))×100% ；

發(fā)芽勢(%)=(第4天發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子總粒數(shù))×100% ；

提高初中英語課堂互動有效性不是一件簡單的事情，要求英語老師一起努力，探索科學(xué)的教學(xué)措施，選擇合理的教學(xué)方式，切實有效地構(gòu)建和諧師生關(guān)系，更好地提升初中英語課堂互動的趣味性，提升同學(xué)們學(xué)習(xí)英語的效率。

發(fā)芽指數(shù)=∑(t時間發(fā)數(shù)芽/相應(yīng)發(fā)芽天數(shù))；

抑制率(%)=[(對照-處理)/對照]×100%；

簡化活力指數(shù)=第7天幼苗長×發(fā)芽率；

DPPH自由基清除率(%)=(1-As/A0)×100% (式中，As為樣品吸光值，A0為對照吸光值)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖制表，使用SPSS 16.0分析軟件的Duncan(新復(fù)極差)法(p<0.05)進(jìn)行顯著性檢驗。參考王艷青等[21]的方法計算各指標(biāo)隸屬函數(shù)值，并進(jìn)行綜合評價，計算公式：

U(ij)=(X(ij))-X(jmin))/(X(jmax)-X(jmin)) (1)

U(ij)=1-(X(ij)-X(jmin))/(X(jmax)-X(jmin)) (2)

式中，U(ij)為i濃度下j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，U(ij)∈[0,1]，X(ij)為i濃度下j指標(biāo)的測定值，X(jmin)和X(jmax)分別為j指標(biāo)的最小測定值和最大測定值；(1)式為正相關(guān)指標(biāo)隸屬函數(shù)值的計算公式，(2)式為負(fù)相關(guān)指標(biāo)隸屬函數(shù)值的計算公式。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種硒源對紅蕓豆種子發(fā)芽的影響

從表1可看出，2種硒源對紅蕓豆種子的萌發(fā)有顯著影響。隨著有機(jī)硒濃度的增加，紅蕓豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及活力指數(shù)均呈增高的趨勢，均在硒濃度45 mg·L-1下顯著高于對照(p<0.05)，而發(fā)芽指數(shù)在硒濃度45 mg·L-1下有下降的趨勢，在硒濃度37.5 mg·L-1下達(dá)到最大，且顯著高于對照(p<0.05)。此外，紅蕓豆種子有機(jī)硒濃度達(dá)到37.5 mg·L-1時第3天開始萌發(fā)，早于其余有機(jī)硒處理，說明一定濃度的有機(jī)硒可以促進(jìn)紅蕓豆種子萌發(fā)，結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，除發(fā)芽率外，其余各指標(biāo)在有機(jī)硒濃度37.5～45 mg·L-1間無顯著差異(p<0.05)。而隨著無機(jī)硒濃度的增加，紅蕓豆種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)均呈先增高后降低的趨勢，均在硒濃度30 mg·L-1處理下顯著高于對照(p<0.05)。而在硒濃度37.5～45 mg·L-1下紅蕓豆種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)有明顯下降趨勢，且紅蕓豆第5天時開始萌發(fā)，說明低濃度的無機(jī)硒可以促進(jìn)紅蕓豆種子萌發(fā)，而高濃度的無機(jī)硒抑制紅蕓豆種子萌發(fā)。此外，無機(jī)硒和有機(jī)硒處理下紅蕓豆種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)最大值相比對照分別提高了12.1%、17.1%、53.8%、103.2%，14.6%、16.6%、49.1%、102.6%，且紅蕓豆種子在無機(jī)硒濃度達(dá)到15 mg·L-1時第3天開始萌發(fā)。

圖1 2種硒源對紅蕓豆POD、SOD、MDA含量的影響

表1 2種硒源對紅蕓豆種子發(fā)芽的影響

處理濃度/(mg·L-1)發(fā)芽勢/%發(fā)芽率/%發(fā)芽指數(shù)活力指數(shù)萌發(fā)天數(shù)ck79.6c80.8e20.4b1.15d47.580.4c82.2e20.7b1.28d415.082.6bc85.8d21.2b1.49cd4有機(jī)硒22.584.2b86.8cd21.6b1.82bc430.085.2b87.8c28.4a1.92abc337.588.6a90.0b31.1a2.11ab345.091.2a94.2a30.4a2.32a3ck79.6de80.8e20.4b1.15d47.581.0cd83.2d20.7b1.30d415.082.4bc85.8c27.5a1.61c3無機(jī)硒22.584.2b87.6b29.5a1.96b330.089.2a94.6a31.4a2.33a337.581.0cd84.6cd16.2b1.64c545.077.8e80.4e15.8b1.30d5

注：表中不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(p<0.05)。

2.2 2種硒源對紅蕓豆種子萌發(fā)的抑制率

由表2可知，2種硒源對紅蕓豆種子生長有不同程度抑制作用，各硒濃度下紅蕓豆苗鮮重、苗干重及苗長的抑制率均為負(fù)值，各生長量隨有機(jī)硒濃度增加抑制率降低，在45 mg·L-1處抑制率最低，而隨無機(jī)硒濃度增加各生長量抑制率先降低后增加，在30 mg·L-1處抑制率最低，此時，紅蕓豆種子活力最大。當(dāng)無機(jī)硒濃度大于30 mg·L-1時，紅蕓豆各生長量抑制率明顯升高，發(fā)芽率在45 mg·L-1時抑制率為正值，說明紅蕓豆幼苗出現(xiàn)明顯抑制生長情況。此外，還發(fā)現(xiàn)，除無機(jī)硒濃度7.5 mg·L-1、45 mg·L-1外，紅蕓豆各生長量抑制情況為：對苗干重的抑制率>對苗鮮重的抑制率>對苗長的抑制率。

表2 2種硒源對紅蕓豆種子萌發(fā)的抑制率

處理濃度/(mg·L-1)苗鮮重苗干重苗長發(fā)芽率ck0.00000.00000.00000.00007.5-0.0457-0.0425-0.0986-0.017315.0-0.1152-0.0324-0.2254-0.0619有機(jī)硒22.5-0.2194-0.0578-0.4789-0.074330.0-0.2571-0.0743-0.5352-0.086637.5-0.4685-0.0959-0.6479-0.113945.0-0.5260-0.1149-0.7465-0.16587.5-0.1435-0.0006-0.0986-0.029715.0-0.2885-0.0298-0.3239-0.0619無機(jī)硒22.5-0.3574-0.0406-0.5775-0.084230.0-0.4414-0.0648-0.7324-0.170837.5-0.2744-0.0279-0.3662-0.047045.0-0.1486-0.0152-0.14090.0050

2.3 不同硒源對紅蕓豆種子POD、SOD、MDA含量的影響

2.3.12種硒源對紅蕓豆POD活性的影響

從圖1 A可以看出，2種硒源浸種下紅蕓豆種子萌發(fā)期POD活性較對照有明顯變化，各硒浸種處理下紅蕓豆POD活性均顯著高于對照(p<0.05)。紅蕓豆POD活性隨有機(jī)硒濃度增加而增加，在45 mg·L-1下POD活性最大(為130.1 U·g-1)，相比對照提高了218.2%。 但在22.5～45 mg·L-1之間紅蕓豆POD活性無顯著差異。而隨著無機(jī)硒濃度增加，紅蕓豆POD活性呈先升高后降低的趨勢，在30 mg·L-1下POD活性最大，為141.7 U·g-1，相比對照提高了246.4%。

2.3.22種硒源對紅蕓豆SOD活性的影響

由圖1 B可以看出，2種硒源下紅蕓豆SOD活性變化趨勢與POD活性變化趨勢相似。在有機(jī)硒45 mg·L-1下紅蕓豆SOD活性最大(為219.1 U·g-1)，相比對照顯著提高了107.9%(p<0.05)，同樣發(fā)現(xiàn)在22.5～45 mg·L-1之間紅蕓豆SOD活性無顯著差異。在無機(jī)硒處理下，紅蕓豆SOD活性在7.5～30 mg·L-1之間呈上升趨勢，當(dāng)硒濃度大于30 mg·L-1時SOD活性降低，此時酶活性被抑制，在30 mg·L-1處SOD活性最大(為218.1 U·g-1)，相比對照顯著提高了107.0%(p<0.05)。

2.3.3不同硒源對紅蕓豆MDA含量的影響

從圖1 C可以看出，2種硒源能夠顯著降低紅蕓豆MDA含量。在有機(jī)硒處理下，紅蕓豆MDA含量隨硒濃度增加而降低，在45 mg·L-1時最低值為33.9 mmol·g-1，相比對照顯著降低了61.2%(p<0.05)，但與37.5 mg·L-1下MDA含量無顯著差異。在無機(jī)硒處理下，紅蕓豆MDA含量隨硒濃度增加呈先降低后增加的趨勢，在30 mg·L-1時最低值為36.4 mmol·g-1，相比對照顯著降低了58.3%(p<0.05)。

2.4 2種硒源對紅蕓豆DPPH自由基清除率的影響

DPPH自由基主要應(yīng)用于評價物質(zhì)的抗氧化活性[22]。由圖2可以看出，2種硒源都能有效提高紅蕓豆DPPH自由基清除率。在有機(jī)硒處理下，紅蕓豆DPPH自由基清除率隨硒濃度增加而升高，在45 mg·L-1處達(dá)到最高為81.9%，此時紅蕓豆抗自由基能力最強(qiáng)。在無機(jī)硒處理下，紅蕓豆抗自由基能力隨硒濃度增加先升高后降低，在30 mg·L-1處DPPH自由基清除率達(dá)到最高(為82.0%)，當(dāng)硒濃度大于30 mg·L-1時，紅蕓豆抗自由基能力下降，說明高濃度無機(jī)硒抑制紅蕓豆抗自由基能力。

圖2 2種硒源對紅蕓豆DPPH自由基清除率的影響

2.5 2種硒源對紅蕓豆硒含量的影響以及相關(guān)分析

由圖3可以看出，2種硒源相比對照有效提高了紅蕓豆硒含量。紅蕓豆硒含量隨硒濃度增加而增加，在45 mg·L-1處硒含量最高，有機(jī)硒處理下的最高硒含量為0.284 5 mg·kg-1，無機(jī)硒處理下的最高硒含量為0.319 2 mg·kg-1，分別比對照提高了17.5、19.7倍。從圖4可以看出，2種硒源下的硒濃度與紅蕓豆硒含量關(guān)系呈二次回歸(R2=0.972 9,R2=0.982 6)。

圖3 2種硒源對紅蕓豆硒含量的影響

圖4 不同硒源與紅蕓豆硒含量間線性關(guān)系

2.6 應(yīng)用隸屬函數(shù)法對2種硒源不同濃度下紅蕓豆各項指標(biāo)的綜合評價

由表3中紅蕓豆發(fā)芽指標(biāo)(苗鮮重、苗干重、苗長、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、簡化活力指數(shù))隸屬函數(shù)平均值以及生理指標(biāo)(POD活性、SOD活性、MDA含量、DPPH自由基清除率)、硒含量隸屬函數(shù)平均值可知，在有機(jī)硒45 mg·L-1下紅蕓豆各項指標(biāo)隸屬函數(shù)平均值最高(為0.995 2)，其次在無機(jī)硒30 mg·L-1下為0.967 6，因此綜合評價下有機(jī)硒45 mg·L-1處理效果最好。

表3 2種硒源不同浸種濃度下紅蕓豆各指標(biāo)隸屬函數(shù)平均值

指標(biāo)處理濃度 有機(jī)硒 無機(jī)曬 ck7.515.022.530.037.545.0ck7.515.022.530.037.545.0發(fā)芽指標(biāo)0.00000.12850.25680.44060.60730.83760.99040.06840.19870.49780.69511.00000.36710.1279生理指標(biāo)與硒含量0.00000.18730.48650.65200.75500.90181.00000.00000.24150.51060.80800.93520.85850.8011隸屬函數(shù)平均值0.00000.15790.37160.54630.68110.86970.99520.03420.22010.50420.75150.96760.61280.4645

3 討論與結(jié)論

本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種硒源都能有效促進(jìn)紅蕓豆種子萌發(fā)，提高POD、SOD活性，降低MDA含量，提高DPPH自由基清除率以及幼苗硒含量。有研究表明，低濃度無機(jī)硒浸種能夠有效促進(jìn)種子萌發(fā)，而高濃度無機(jī)硒抑制種子萌發(fā)[23-25]。本試驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)無機(jī)硒濃度小于30 mg·L-1時能夠有效提高紅蕓豆發(fā)芽率、發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)等，而當(dāng)濃度大于30 mg·L-1時紅蕓豆種子萌發(fā)被抑制。而周大寨等研究發(fā)現(xiàn)，硒浸種(濃度0～15 mg·L-1)可以促進(jìn)蕓豆種子萌發(fā)，硒濃度大于15 mg·L-1時抑制蕓豆種子萌發(fā)[17]。蕓豆的萌發(fā)情況與環(huán)境條件，品種等多種因素有關(guān)，對此結(jié)果差異需進(jìn)一步試驗。本試驗還發(fā)現(xiàn)在有機(jī)硒45 mg·L-1下效果最好，但與37.5 mg·L-1下的紅蕓豆發(fā)芽情況相比沒有顯著差異。而在30～45 mg·L-1之間，紅蕓豆萌發(fā)的各生理指標(biāo)無顯著差異，因此，考慮資源浪費，建議有機(jī)硒濃度在30～37.5 mg·L-1范圍為宜。已有研究發(fā)現(xiàn)，硒能夠有效提高植物體內(nèi)POD、SOD等抗氧化酶活性，清除植物體內(nèi)自由基，提高抗氧化能力[26-28]，本試驗結(jié)果也有同樣發(fā)現(xiàn)。這是由于硒是GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物酶)的組成成分，而GSH可以清除自由基以及過氧化脂質(zhì)，同時植物體能夠?qū)o機(jī)硒轉(zhuǎn)化為人體能夠吸收利用的有機(jī)硒，有機(jī)硒又可以促進(jìn)新陳代謝，增加抗氧化能力[29-30]。本試驗還發(fā)現(xiàn)，2種硒源顯著提高了紅蕓豆幼苗中硒含量，且硒含量與硒浸種濃度呈二次回歸線性關(guān)系，2種硒源均在45 mg·L-1處硒含量最高，有機(jī)硒處理下最高硒含量為0.284 5 mg·kg-1，無機(jī)硒處理下的最高硒含量為0.319 2 mg·kg-1，參考國家糧食富硒含量標(biāo)準(zhǔn)，豆類作物，富硒豆類硒含量標(biāo)準(zhǔn)為0.02～0.30 mg·kg-1[31]，而本試驗中無機(jī)硒37.5～45.0 mg·L-1下幼苗硒含量均超過了籽粒標(biāo)準(zhǔn)含量，但目前未指出關(guān)于蕓豆幼苗硒含量標(biāo)準(zhǔn)，因此，還需進(jìn)一步研究硒浸種對紅蕓豆各個生育時期及籽粒硒含量、產(chǎn)量影響，確定安全硒浸種濃度。綜上所述，盡管無機(jī)硒效果優(yōu)于有機(jī)硒，見效快，但無機(jī)硒毒性大，攝入過量會引起中毒現(xiàn)象，且目前無機(jī)硒肥不能廣泛應(yīng)用市場，沒有特定限量標(biāo)準(zhǔn)。而有機(jī)硒一般以硒蛋氨酸形式存在，參與人體代謝以及蛋白的合成，容易被人體吸收利用，安全性高，不易發(fā)生中毒。在關(guān)于成人對無機(jī)硒和有機(jī)硒日攝入量的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人體攝入一定量的有機(jī)硒與無機(jī)硒，人體每毫升血液中有機(jī)硒上升濃度是無機(jī)硒的2倍，人體對有機(jī)硒的吸收是無機(jī)硒的20倍[32-33]。因此，開發(fā)出安全高效，能夠廣泛應(yīng)用于市場的有機(jī)硒肥對生產(chǎn)富硒作物及人體健康有重要意義。

本試驗結(jié)果表明，2種硒源浸種能夠有效促進(jìn)紅蕓豆種子萌發(fā)。無機(jī)硒在0～30 mg·L-1，有機(jī)硒在0～45 mg·L-1處可以有效促進(jìn)紅蕓豆種子發(fā)芽，提高POD、SOD活性、DPPH自由基清除率，降低MDA含量。2種硒源浸種能夠顯著提高紅蕓豆幼苗硒含量，且與硒濃度呈二次回歸關(guān)系，顯著相關(guān)，通過各項指標(biāo)隸屬函數(shù)綜合評價得出，在有機(jī)硒浸種濃度45 mg·L-1處理下效果最佳。