羅宗洪，蔡圣寶，易俊潔*

1(昆明理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，云南 昆明，650500) 2(昆明理工大學(xué) 云南省食品安全研究院，云南 昆明，650500)

糖尿病是嚴(yán)重危害人類身體健康的慢性疾病之一，許多臨床研究證明氧化應(yīng)激與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)[1]。氧化應(yīng)激的標(biāo)志物主要為自由基，一般當(dāng)機體在遭受各種有害刺激時，自由基的產(chǎn)生和抗氧化防御之間嚴(yán)重失衡，從而導(dǎo)致機體組織損傷[2]。目前，通過應(yīng)用天然抗氧化劑清除自由基，治療可逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對機體的損傷，從而阻止或延緩糖尿病及其并發(fā)癥的出現(xiàn)，成為研究者們關(guān)注的熱點。

α-葡萄糖糖苷酶是位于小腸消化碳水化合物的關(guān)鍵酶，也是引起餐后血糖升高的主要酶之一[2]。有效抑制α-葡萄糖糖苷酶的活性，可以降低餐后血糖，調(diào)節(jié)糖脂代謝，緩解糖尿病及其并發(fā)癥的出現(xiàn)[3]。目前,在國內(nèi)糖尿病藥物市場中應(yīng)用的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要為通過生物合成或半生物合成的藥物，不僅種類少、副作用大，而且價格昂貴[4]。因此，從天然藥食同源植物中提取具有一定活性的小分子化合物，研發(fā)既經(jīng)濟又有良好治療效果的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有重要的意義。

八月瓜(Akebiatrifoliata)，俗稱“野香蕉”，在中醫(yī)學(xué)中稱為預(yù)知子，屬于三葉木通科木通屬木質(zhì)藤本半常綠纏繞植物，主要分布在云南、貴州、湖南、河南一帶，其中以云南昭通、貴州銅仁、湖南張家界、四川雅安居多[5]。農(nóng)歷八月到九月瓜熟開口，果皮呈紫色，種子可榨油。八月瓜營養(yǎng)豐富，富含三萜類皂苷(含有齊墩果酸，熊果酸等)、必需氨基酸(如纈基酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、賴氨酸等)、多糖、維生素C(VC)、甾醇和微量元素等[5-6]。張亞平等[7]報道八月瓜提取物對肝損傷具有一定的保護作用。任紅艷等[8]和LU等[9]均發(fā)現(xiàn)八月瓜提取物具有顯著的抑制肝癌細(xì)胞增長的功效，尤其是八月瓜籽。但對八月瓜的植物化學(xué)組成、抗氧化性以及對α-糖苷酶活性抑制效果的研究較少。因此，本研究以探究八月瓜活性成分抑制糖尿病為目的，首先通過超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀定性分析八月瓜果皮和種籽提取物中植物化學(xué)組成，并確定其總酚、總黃酮、總皂苷等功能性成分含量，另外，對比果皮和種籽提取物的抗氧化活性和α-糖苷酶活性抑制能力，為八月瓜資源的進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

八月瓜鮮果,云南省昭通市彝良縣市場;DPPH、ABTS自由基、蘆丁、沒食子酸,Sigma-aldrich公司;色譜乙腈和Folin-Ciocalteu,Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000超高效液相色譜儀、Q-Exactive Focus軌道離子阱高分辨質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；Reprospher 100 C18柱，德國Dr.Maisch公司。

1.3 原料前處理

將購買的新鮮八月瓜在陽光充足的條件下晾曬3～5 d，然后將曬干的八月瓜進行果皮與種籽分離，分別標(biāo)記裝袋。用食品級打粉機將曬干的果皮和種籽分別打成粉末，裝袋置于4 ℃冰箱內(nèi)保存待用。利用石油醚進行脫脂，用80%(體積分?jǐn)?shù))甲醇抽提。將抽提出的液體部分利用真空泵濃縮，將濃縮的提取物置于凍干機中凍干備用。

1.4 超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀定性分析提取物成分

用高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀檢測八月瓜果皮和種籽的酚類物質(zhì)組成。采用Reprospher 100 C18柱，以0.1%甲酸水為流動相A，乙腈為流動相B，流動相的體積濃度梯度為：0～5 min,10% B;5～15 min,10%～15% B;15～25 min,15%～35% B;25～30 min,35%～50% B；30～32 min,50%～100% B。進樣量為3 μL，流速為0.2 mL/min，柱溫設(shè)為30 ℃。

ESI-HRMS/MS檢測時使用模式為陽離子模式，掃描范圍m/z150～2 000。果皮和種籽中酚類化合物的二級譜圖信息是由Q-Exactive Orbitrap mass spectrometer檢測器檢測得到。其余質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：分辨率70 000；鞘氣流速32 L/min；輔助氣體流速8 L/min；噴射源電壓3.3 kV；S-lens射頻水平50%；輔助氣體加熱器溫度350 ℃；毛細(xì)管溫度320 ℃。

1.5 總酚含量的測定

用福林酚法測定八月瓜果皮和種籽的總酚含量[10-11]。分別取樣品4 mg用8 mL 80%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶解并稀釋5倍。然后取0.5 mL樣品溶液，加入0.5 mL福林酚試劑。靜置1 min。隨后加入1.5 mL Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至10 mL?；靹颍?0 ℃水浴中孵育10 min，用酶標(biāo)儀測定765 nm處的吸光值?？偡拥臉?biāo)準(zhǔn)曲線以沒食子酸為當(dāng)量，將沒食子酸稀釋成5個不同濃度，按照以上步驟，測定反應(yīng)后的吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 總黃酮含量的測定

總黃酮的含量測定方法參照前人[12-14]研究方法并進行部分改動。分別取樣品4 mg溶于8 mL 80%甲醇并用80%甲醇稀釋5倍制得樣液。取1 mL配制好的樣液用70%乙醇定容至2.5 mL，加入0.15 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaNO2溶液，搖勻靜置5 min。再加入0.15 mL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Al(NO3)3溶液，搖勻靜置6 min，最后加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液。混勻，室溫下靜置3 min，用酶標(biāo)儀測定500 nm處吸光值?？傸S酮的測定用蘆丁作為參照物，將蘆丁稀釋成5個不同濃度，按照以上步驟測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 總皂苷含量的含量測定

總皂苷的測量方法參照前人測定三七皂苷的方法[15-16]。以空白試劑做參比，于548 nm處測定吸光度[8]，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 DPPH抗氧化能力測定

DPPH自由基清除能力測定的方法參考李安林等[17]的方法并稍作修改。首先取0.5 mL八月瓜樣品，然后加入2.0 mL的DPPH(0.1 mmol/L)試劑后，暗處放置30 min，然后在517 nm波長下測定反應(yīng)液的吸光值A(chǔ)1。同時，用0.5 mL甲醇替代樣品加入到2.0 mL DPPH 試劑中，于相同條件下測定其吸光值A(chǔ)2。實驗標(biāo)準(zhǔn)品選用VC做對照試驗，按照以上步驟進行實驗。八月瓜提取物對DPPH自由的清除能力按公式(1)計算：

(1)

1.9 ABTS自由基抗氧化能力測定

八月瓜ABTS自由基抗氧化能力測定方法參照文獻并稍作修改。ABTS自由基工作液配制：取7 mmol/L ABTS 5 mL加入 88 μL 40 mmol/L 的過硫化鉀溶液，混勻后，室溫避光放置12～16 h，形成ABTS自由基儲備液。使用時用乙醇稀釋，于734 nm處測定吸光值，工作液的吸光值應(yīng)為(0.7±0.02)。樣品前處理同 DPPH 相同，0.3 mL樣品，加入ABTS工作液2.7 mL：對照組為 0.3 mL甲醇和 ABTS工作液2.7 mL，混勻。在多功能酶標(biāo)板上于734 nm處測定吸光值。樣品組和對照組均設(shè)立空白對照。選用VC做標(biāo)準(zhǔn)品對照試驗，按照樣品提取物的實驗方法進行試驗。

1.10 α-葡萄糖苷酶的活性抑制測定

α-葡萄糖苷酶的活性抑制測定方法參照張麗等[19]的方法。八月瓜提取物對α-糖苷酶的活性抑制能力采用公式(2)計算，并用Origin軟件求出IC50值。

(2)

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，每組實驗進行3次平行。采用Tukey單因素方差分析(P<0.05)，均用Origin 8.5進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 八月瓜提取物組分質(zhì)譜定性分析

采用高分辨液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對八月瓜果皮和種籽提取物的組分進行定性分析。從圖1可看出，八月瓜果皮和種籽提取物的成分相似，出峰時間大致相同，但果皮提取物的峰高和峰面積總體低于種籽提取物，說明種籽的功能性成分高于果皮。表1列出了八月瓜果皮和種籽提取物的主要活性成分，其中酚類物質(zhì)有綠原酸和2,2’-亞甲基雙-(6-叔丁基-4-甲基苯酚)，皂苷類物質(zhì)有斛皮素-3-葡萄糖苷、羽扇豆異黃酮-O-葡萄糖苷、常春藤皂苷D、甾體皂苷F、常春藤皂苷C、常春藤皂甙元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖甙。從峰面積比可看出，這些組分中斛皮素-3-葡萄糖苷在果皮中含量較高，而甾體皂苷F、常春藤皂苷C、2,2’-亞甲基雙-(6-叔丁基-4-甲基苯酚)在種籽中含量更高，其余成分在果皮和種籽中含量無顯著差異。

2.2 八月瓜提取物總酚、總黃酮、總皂苷含量

八月瓜果皮和種籽提取物中總酚、黃酮、總皂苷含量如表2所示。

注：序號按出峰時間排列，與圖1中標(biāo)注序號對應(yīng)。

注：結(jié)果是以原料(果皮或種籽)干重計，并且數(shù)值均帶有SD值。表中同一列不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

實驗結(jié)果表明，八月瓜的總酚、總黃酮、總皂苷含量豐富。潘冬梅等[13]對8種藥食同源原料的總酚和總黃酮含量進行了研究，發(fā)現(xiàn)酚含量較高的為甘草、決明子、菊花(>20 mg/g)，較低的為梔子、羅漢果、酸棗仁、郁李仁、萊菔子；總黃酮含量較高的為決明子、菊花、梔子(>24 mg/g)，較低的為甘草、酸棗仁、郁李仁、羅漢果、萊菔子。與此相比，本實驗八月瓜中的總酚、總黃酮含量均顯著高于其他藥食同源植物。查閱部分文獻[14]中關(guān)于八月瓜的研究結(jié)果，云頂?shù)貐^(qū)的八月瓜總黃酮含量為3.81%，大定地區(qū)的含量為2.16%。云霧、都勻、王司等地區(qū)分別為2.05%、1.89%、2.86%。發(fā)現(xiàn)本實驗所測得的總酚、總黃酮含量都更高，可能是由于地區(qū)和季節(jié)性差異。八月瓜的總皂苷含量豐富，朱金段等[24]對預(yù)知子常春藤皂苷元的含量測量中得出，預(yù)知子中常春藤皂苷元的含量在0.10～28.53 mg/g，與本研究所測的總皂苷含量對比可知，八月瓜總皂苷中常春藤皂苷含量較高。從表2中還可看出，八月瓜的種籽中的總酚、總黃酮、總皂苷含量均顯著高于果皮，尤其是總酚含量，八月瓜種籽的總酚含量比果皮含量高出約50 mg/g。

2.3 八月瓜提取物DPPH自由基消除能力

八月瓜提取物的DPPH抗氧化活性如圖2所示。2種提取物都具有清除DPPH自由基的能力，且2種提取物對DPPH自由基的清除能力與其濃度存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)潘冬梅等[13]對8種藥食同源原料的DPPH抗氧化活性的研究發(fā)現(xiàn)，在10 mg/mL質(zhì)量濃度下，甘草、決明子的DPPH自由基的清除率低于80%，羅漢果、萊菔子、酸棗仁、郁李仁等的DPPH自由基的清除率低于50%。而八月瓜果皮提取物DPPH自由基清除能力的IC50值為53.56 μg/mL，種籽提取物的IC50值為47.24 μg/mL。對比可以看出，八月瓜的DPPH自由基的清除能力顯著高于其他藥食同源植物。在不同濃度下，八月瓜種籽提取物的DPPH自由基的清除能力均顯著大于果皮提取物。DPPH自由基清除能力可能與總酚、總黃酮含量有關(guān)[17]，由此推測，八月瓜種籽提取物表現(xiàn)出較高的清除DPPH自由基的能力主要是因為其總酚和總黃酮含量較高。

2.4 八月瓜提取物ABTS自由基清除能力

圖3為八月瓜提取物ABTS自由基清除能力。從圖3中可以看出，2種提取物均具有清除ABTS自由基的能力，并且可以明顯觀察到隨著提取物濃度的增加，其對ABTS自由基的清除能力逐漸增強，說明2種提取物的濃度對ABTS自由基的清除能力存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。白海娜等人[25]研究白藜蘆醇與黑木耳多糖對ABTS自由基清除的協(xié)同作用，得到白藜蘆醇和黑木耳多糖的IC50值分別為3.56和61.46 mg/L。李培源等[26]對雞眼草、白藜蘆醇與黑木耳多糖等對ABTS自由基的清除能力的研究發(fā)現(xiàn)雞眼草提取物在0.5 mg/mL時，ABTS自由基清除率最高的為雞眼草乙酸乙酯提取物，清除率為77.5%。八月瓜果皮提取物ABTS自由基清除率的IC50值為42.25 μg/mL，種籽提取物的IC50值為48.99 μg/mL，與文獻[25-26]結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，本文中八月瓜提取物對ABTS自由基的清除能力與黑木耳多糖相近，遠(yuǎn)高于雞眼草和白藜蘆醇，說明八月瓜提取物抗氧化能力顯著。由圖1和表1可看出，八月瓜提取物中富含綠原酸，八月瓜提取物的ABTS自由基抗氧化活性可能與其綠原酸含量有關(guān)系，使其具有較高的ABTS自由基抗氧化活性[27]。另外，八月瓜果皮提取物ABTS自由基清除率的IC50值為42.25 μg/mL，種籽提取物的IC50值為48.99 μg/mL，可以看出，八月瓜種籽提取物的ABTS自由基清除能力顯著高于果皮提取物。

2.5 八月瓜提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制能力

從圖4可以看出，八月瓜果皮提取物和種籽提取物都具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力，提取物對α-葡萄糖苷酶的活性抑制能力具有劑量效應(yīng)。與果皮提取物相比，八月瓜種籽提取物的抑制效果更高。

高小平等[28]對126種經(jīng)水煮醇沉提取的常用中藥進行α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選研究，其研究結(jié)果表明，在0.28 mg/mL反應(yīng)體系下，24種中藥提取物顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性，其中大黃、山茱萸、青果、地瑜、桑白皮等中藥提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率超過90%，虎杖、丹參、知母等中藥提取物抑制率在50%左右，而八月瓜果皮提取物對α-葡萄糖苷酶的活性抑制率IC50值為14.15 μg/mL，種籽提取物對α-葡萄糖苷酶的活性抑制率IC50值為15.54 μg/mL，說明八月瓜具有非常顯著的α-葡萄糖苷酶抑制能力。由于α-葡萄糖苷酶活性與糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，本實驗結(jié)果可以從側(cè)面反映八月瓜提取物可能對抑制或減緩糖尿病及其并發(fā)癥的出現(xiàn)具有積極的作用。

3 結(jié)論

本實驗研究了八月瓜果皮和種籽的化合物組成、總酚、總黃酮、總皂苷含量、抗氧化活性以及糖苷酶活性抑制能力。八月瓜果皮和種籽提取物中檢出9種化合物，多種為甾體皂苷和常春藤皂苷類化合物。八月瓜中富含多酚、黃酮和皂苷類物質(zhì)，而且種籽中的含量高于果皮。另外，八月瓜種籽提取物和果皮提取物的DPPH和ABTS自由基清除能力都比較突出，且具有明顯的劑量效應(yīng)，說明八月瓜具有良好的抗氧化活性。同時，本研究還測得其對α-葡萄糖苷酶的活性抑制效果良好，且八月瓜種籽提取物的抑制效果顯著優(yōu)于果皮提取物。本實驗結(jié)果為八月瓜相關(guān)功能性產(chǎn)品開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，可以進一步探究八月瓜具體活性成分對糖尿病及其并發(fā)癥抑制效果機制研究。