張華東，郭學(xué)武，肖冬光*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457)

醋酸菌屬，革蘭氏陰性好氧菌，主要包括16個屬[1]，在白酒生產(chǎn)中最為常見的是醋酸桿菌屬和葡糖桿菌屬[2-3]。在釀酒過程中，醋酸菌多存在于堆積發(fā)酵階段和入池發(fā)酵的前期，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，氧氣耗盡，醋酸菌逐漸凋亡[4-5]。

醋酸菌在白酒生產(chǎn)過程中對白酒風(fēng)味的形成有一定的影響，醋酸菌產(chǎn)生的醋酸(又稱乙酸)能使酒醅呈酸敗味，酸度高會抑制釀酒酵母的生長，醋酸對微生物有較大的毒性[6]，但適量的醋酸對白酒的風(fēng)味有一定的促進(jìn)作用，醋酸是白酒的主要香味成分，同時也是酯的承受體[7]。有研究表明醋酸菌存在有利于釀酒酵母合成乙酸乙酯[8]，將酵母菌與醋酸菌混合發(fā)酵能使醋酸菌高產(chǎn)醋酸[9]。

白酒生產(chǎn)需要眾多微生物菌群的參與，主要包括霉菌、細(xì)菌和酵母菌3大類[10-11]，其中酵母菌負(fù)責(zé)酒精發(fā)酵，釀酒酵母是酒精發(fā)酵的主體菌；同時酵母菌代謝產(chǎn)生的乙酸酯類和高級醇是白酒中主要的呈香物質(zhì)[12-14]。白酒生產(chǎn)是微生物相互作用的結(jié)果，研究微生物相互作用對白酒釀造技術(shù)的進(jìn)步有著重要的意義[15]。實驗室前期通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建了1株高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15，該菌株不僅能夠高產(chǎn)乙酸乙酯和乙酸異戊酯，而且酒精發(fā)酵能力與普通釀酒酵母無異。將高產(chǎn)酯釀酒酵母與白酒生產(chǎn)中常見的醋酸菌(巴氏醋桿菌)同時接種混合發(fā)酵，研究醋酸菌對高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響，為白酒生產(chǎn)中高產(chǎn)酯釀酒酵母的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)，篩選自白酒酒醅；高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15(CGMCC No.5635)，天津市工業(yè)微生物重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

MgSO4、(NH4)2SO4、K2HPO4(均為分析純),天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；酵母膏(生化試劑),北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖(分析純),天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司；無水乙醇(分析純),天津市江天化工技術(shù)股份有限公司；耐高溫α-淀粉酶(酶活1×105U/mL)、糖化酶(酶活2.9×105U/mL)、酸性蛋白酶(酶活5×104U/mL),諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;玉米粉,超市購買;澳洲高粱,北京紅星二鍋頭有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

釀酒酵母種子培養(yǎng)基(玉米水解液)：玉米粉與水按照料液比1∶4(g∶mL)混合，添加耐高溫α-淀粉酶(10 U/g原料)在90 ℃水浴作用1 h，然后繼續(xù)加熱煮沸30 min，之后補水至原體積，立即降溫到60 ℃，添加糖化酶(250 U/g原料)在60 ℃水浴作用4 h，然后用4層紗布過濾，調(diào)節(jié)糖度為12 °Bx，添加(NH4)2SO46 g/L，MgSO41.2 g/L，K2HPO42.4 g/L，115 ℃高溫滅菌20 min備用。

高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基：高粱粉與水按照料液比1∶3(g∶mL)混合，液化糖化步驟同玉米水解液，糖化完成后降溫到40 ℃，添加酸性蛋白酶(30 U/g原料)水浴作用4 h，然后用4層紗布過濾，調(diào)節(jié)到所需糖度，115 ℃高溫滅菌20 min備用。

醋酸菌培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏15 g/L，接菌前添加體積分?jǐn)?shù)為3.5%的無水乙醇；固體培養(yǎng)基額外添加20 g/L瓊脂和20 g/L CaCO3。

1.2 儀器與設(shè)備

MS204S電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司；1200系列高效液相色譜儀、7890B型氣相色譜儀,美國安捷倫科技有限公司；XMTB型電熱恒溫水浴鍋,天津市中環(huán)實驗器材有限公司；H1650-W型高速冷凍離心機,湖南湘儀科技有限公司；BX43型生物顯微鏡,日本OLYMPUS會社；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 醋酸菌的培養(yǎng)

醋酸菌種子液：從4 ℃冰箱保存的醋酸菌斜面上刮1環(huán)至裝有醋酸菌液體培養(yǎng)基的試管中，裝液量5 mL/20 mL,180 r/min,30 ℃培養(yǎng)24 h，得醋酸菌一級種子液。將一級種子液倒入裝有醋酸菌液體培養(yǎng)基的三角瓶中,裝液量100 mL/250 mL，8層紗布封口，180 r/min,30 ℃培養(yǎng)24 h，得醋酸菌二級種子液。

醋酸菌發(fā)酵液：取醋酸菌二級種子液10 mL接入裝有醋酸菌液體培養(yǎng)基的三角瓶中，裝液量100 mL/250 mL，8層紗布封口，180 r/min,30 ℃培養(yǎng)5 d，得醋酸菌發(fā)酵液。

1.3.2 高產(chǎn)酯釀酒酵母種子液的培養(yǎng)

從4 ℃冰箱保存的高產(chǎn)酯釀酒酵母斜面上刮1環(huán)至裝有玉米水解液的試管中，裝液量5 mL/20 mL,30 ℃培養(yǎng)24 h，得高產(chǎn)酯釀酒酵母一級種子液。將一級種子液倒入裝有玉米水解液的三角瓶中,裝液量100 mL/250 mL，棉塞加牛皮紙封口，30 ℃靜置培養(yǎng)16 h，得高產(chǎn)酯釀酒酵母二級種子液。

1.3.3 醋酸菌菌懸液對高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響

取醋酸菌二級種子液150 mL,在4 ℃下7 000 r/min離心5 min，棄上清液，然后向沉淀中加入16 °Bx高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基至總體積150 mL，振蕩混勻，制成醋酸菌懸液，然后按照5、10、15、20 mL的接種量接種到16 °Bx高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基，高產(chǎn)酯釀酒酵母接種量都為10 mL，發(fā)酵總體積為130 mL/250 mL，在30 ℃靜置發(fā)酵72 h。

1.3.4 醋酸菌發(fā)酵液對高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響

取醋酸菌發(fā)酵液350 mL，在4 ℃下7 000 r/min離心5 min,取上清液，上清液過膜除菌，采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測定醋酸含量(23 g/L)，然后用醋酸菌發(fā)酵上清液配制含有不同質(zhì)量濃度(2、4、6、8 g/L)的醋酸高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基(表1)，高產(chǎn)酯釀酒酵母接種量都為10 mL，發(fā)酵總體積為130 mL/250 mL，30 ℃靜置發(fā)酵72 h。

1.3.5 分析方法

乙酸檢測：將樣品離心并用0.22 μm的濾膜過濾到液相分析小瓶，使用Agilent 1200SL 液相色譜儀，色譜柱HPX-87H(300 mm×7.8 mm×9 μm)，紫外(ultra violet,UV)檢測器，流動相為5 mmol/L的H2SO4溶液，柱溫60 ℃，流速為0.6 mL/min，檢測時間23 min，進(jìn)樣量20 μL。

高級醇、乙酸酯檢測：將蒸餾后得到的樣品使用氣相色譜法測定，其色譜條件為Agilent 7890B氣相色譜儀，氫火焰離子檢測器(flame ionization detector,FID)，載氣為高純氮氣，LZP930白酒分析專用毛細(xì)管柱(50 m×0.32 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測器溫度230 ℃，氫氣流量40 mL/min,空氣流量300 mL/min，柱流量0.8 mL/min。程序升溫，50 ℃保持8 min，然后以5 ℃/min速率升溫到200 ℃保持5 min[16]。

殘?zhí)堑臏y定：斐林試劑法[17]。

酵母菌計數(shù)：血球計數(shù)板法[18-19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 醋酸菌菌懸液對高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響

按照1.3.3的方法，醋酸菌菌懸液對高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵的影響見表2，對酯醇代謝的影響見圖1。由表2可知，發(fā)酵進(jìn)行到12 h時，與釀酒酵母單獨發(fā)酵相比，添加醋酸菌菌懸液的實驗組對酵母的生長有所抑制，添加20 mL時比釀酒酵母單獨發(fā)酵時酵母數(shù)下降了28%，可能跟醋酸菌與酵母競爭營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)；發(fā)酵進(jìn)行到24 h時，實驗組與對照組相比酵母菌數(shù)相差不大，因為醋酸菌是好氧菌[20]，隨著培養(yǎng)基內(nèi)氧氣的減少，醋酸菌生長受到抑制，酵母菌生長迅速?？梢姶姿峋鷳乙簩︶劸平湍傅纳L初期有一定的抑制，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，釀酒酵母取代醋酸菌成為優(yōu)勢菌。發(fā)酵結(jié)束后，添加醋酸菌菌懸液對釀酒酵母乙醇產(chǎn)量沒有影響，高產(chǎn)酯釀酒酵母都能發(fā)酵完全，殘?zhí)呛吭?.1 g/L左右。

從圖1可知，醋酸菌菌懸液與高產(chǎn)酯釀酒酵母共發(fā)酵，只有醋酸菌菌懸液接種量大時[20 mL(3×109CFU/mL)]對釀酒酵母乙酸乙酯的產(chǎn)量有所提高，乙酸乙酯最多增加12%，其他添加量下無顯著差異(P>0.05)。隨著醋酸菌菌懸液添加量的增加，乙酸異丁酯含量也逐漸升高，在醋酸菌菌懸液添加量達(dá)到20 mL時，乙酸異丁酯產(chǎn)量增加一倍。乙酸異戊酯含量在醋酸菌菌懸液添加量為20 mL時有明顯增高，增加33.8%，醋酸菌菌懸液其他添加量下對乙酸異戊酯產(chǎn)量無顯著差異(P>0.05)。醋酸菌菌懸液各添加量下對高產(chǎn)酯釀酒酵母高級醇代謝的影響不大。

2.2 醋酸菌發(fā)酵液對高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響

由表3可知，發(fā)酵進(jìn)行到12 h時，與培養(yǎng)基內(nèi)醋酸質(zhì)量濃度為0時相比，培養(yǎng)基內(nèi)醋酸質(zhì)量濃度為2、4、6、8 g/L時酵母菌數(shù)分別下降了20.00%、54.17%、73.33%、86.67%。發(fā)酵進(jìn)行到24 h時，隨著培養(yǎng)基內(nèi)醋酸質(zhì)量濃度升高酵母菌數(shù)都呈下降趨勢，2、4、6、8 g/L下酵母數(shù)比對照低18.42%、21.05%、63.16%、81.57%。發(fā)酵到72 h,在醋酸質(zhì)量濃度為2、4、6 g/L時，高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15乙醇產(chǎn)量與對照相比沒有顯著差異，殘?zhí)亲疃嘞嗖?.3 g/L。而當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)醋酸質(zhì)量濃度為8 g/L時，乙醇產(chǎn)量僅為11.34 g/L，殘?zhí)菫?50 g/L，說明釀酒酵母的生長及代謝被嚴(yán)重抑制。

向高粱汁培養(yǎng)基內(nèi)添加醋酸菌發(fā)酵液，配制不同醋酸濃度的培養(yǎng)基，探究培養(yǎng)基初始醋酸濃度對高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響。由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)基醋酸質(zhì)量濃度大于4 g/L時，乙酸乙酯就開始呈下降趨勢，當(dāng)醋酸質(zhì)量濃度為4 g/L時，乙酸乙酯下降7.91%，醋酸質(zhì)量濃度為6 g/L時，乙酸乙酯下降49.39%；當(dāng)醋酸質(zhì)量濃度為8 g/L時，乙酸乙酯下降88.26%。乙酸異丁酯和乙酸異戊酯都是隨著培養(yǎng)基內(nèi)醋酸質(zhì)量濃度的增加而降低，在培養(yǎng)基內(nèi)醋酸質(zhì)量濃度為8 g/L時，乙酸異丁酯最多下降99.18%。釀酒酵母正丙醇產(chǎn)量在醋酸質(zhì)量濃度為0、2、4、6 g/L時含量變化差異不顯著，但在醋酸質(zhì)量濃度為8 g/L時下降了92.99%。異丁醇在醋酸質(zhì)量濃度為2、4、6、8 g/L時分別下降2.22%、11.22%、11.33%、75.28%。異戊醇、苯乙醇和活性戊醇都是隨著醋酸質(zhì)量濃度的增加而降低，在醋酸質(zhì)量濃度為2、4、6、8 g/L時，異戊醇降低了18.55%、51.39%、71.05%、92.97%；苯乙醇降低了31.79%、76.02%、88.81%、97.93%；活性戊醇下降了51.62%、71.85%、79.12%、94.63%。

2.3 醋酸菌對高產(chǎn)酯釀酒酵母轉(zhuǎn)錄水平的影響

以上結(jié)果說明，醋酸菌的代謝產(chǎn)物對高產(chǎn)酯釀酒酵母的酯醇代謝影響較大，特別是在培養(yǎng)基醋酸質(zhì)量濃度為6 g/L時，高產(chǎn)酯釀酒酵母能進(jìn)行完全的酒精發(fā)酵，但是酯醇代謝被抑制，乙酸酯類下降60%，高級醇下降50%，所以我們選取醋酸質(zhì)量濃度為6 g/L時為實驗組(編號Ace)，以培養(yǎng)基內(nèi)醋酸質(zhì)量濃度為0 g/L為對照組(編號MY-15)，培養(yǎng)至對數(shù)期取樣，將樣品送至諾禾致源生物有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

經(jīng)過數(shù)據(jù)質(zhì)控，參考基因組對比，差異分析得到圖3火山圖，如圖3所示，在培養(yǎng)基初始醋酸質(zhì)量濃度為6 g/L時，高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15共有394個基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，282個基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。

GO數(shù)據(jù)庫把基因的本體分為3種：生物過程(biological process,BP)，細(xì)胞組成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。由圖4可知，高產(chǎn)酯釀酒酵母差異基因主要富集在BP過程中的氧化還原過程(GO：0055114)、跨膜運輸(GO：0055085)；差異基因主要集中在細(xì)胞組成細(xì)胞壁(GO：0005618)、外部封裝結(jié)構(gòu)(GO：0030312)、細(xì)胞外圍(GO：0071944)、膜(GO：0016020)、膜的組成成分(GO：0016021)、膜的固有成分(GO：0031224)、氧化還原酶活性(GO：0016491)和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分(GO：0005199)；富集在分子功能上的主要是血紅素結(jié)合(GO：0020037)和四吡咯結(jié)合(GO：0046906)。這也印證了醋酸主要通過影響細(xì)胞膜的生理功能進(jìn)而影響微生物的生長及代謝[21]。

京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)是一個整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫。從KEGG富集結(jié)果中，選取最顯著的20個KEGG通路繪制成散點圖并進(jìn)行展示，如圖5所示。圖5中橫坐標(biāo)為注釋到KEGG通路上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標(biāo)為KEGG通路，點的大小代表注釋到KEGG通路上的基因數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小。

由圖5可知，在培養(yǎng)基醋酸質(zhì)量濃度為6 g/L時，高產(chǎn)酯釀酒酵母的多條代謝途徑受到影響，這些代謝途徑主要是抗生素的生物合成、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、碳代謝、TCA循環(huán)、氨基酸生物合成、精氨酸的生物合成、糖酵解、氧化磷酸化、乙醛酸和二元酸代謝、硫胺酸代謝、2-氧羥基水楊酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、丙酮酸代謝、類固醇生物合成、半胱氨酸與蛋氨酸代謝等。

編碼醇乙?；D(zhuǎn)移酶的ATF1和ATF2基因沒有檢測到轉(zhuǎn)錄水平的變化，而在醋酸質(zhì)量濃度為6 g/L時高產(chǎn)酯釀酒酵母的乙酸酯明顯下降，說明醋酸有可能使高產(chǎn)酯釀酒酵母醇乙?；D(zhuǎn)移酶的活性降低。

高級醇分解代謝途徑中密切相關(guān)的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)移酶ARO8、ARO9、ARO10基因和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶BAT2基因沒有檢測到有轉(zhuǎn)錄水平的變化，而在醋酸質(zhì)量濃度為6 g/L時高產(chǎn)酯釀酒酵母的高級醇明顯下降，說明醋酸有可能使氨基酸轉(zhuǎn)移酶的活性降低或者是高級醇分解代謝途徑?jīng)]有受到影響。推測釀酒酵母高級醇的合成代謝途徑受到的影響比較大，所以結(jié)合高級醇的合成代謝途徑來分析釀酒酵母高級醇降低的原因。苯乙醇的降低可能是因為醋酸影響了高產(chǎn)酯釀酒酵母的糖酵解過程，由糖酵解途徑生成的苯丙酮酸產(chǎn)量減少，進(jìn)而苯乙醇的產(chǎn)量下降。在正丙醇和活性戊醇這條代謝途徑中，檢測到ILV3基因表達(dá)上調(diào)2.42倍，這可能會使由α-酮丁酸產(chǎn)生的α-酮酸-β-甲基戊酸增多，那么相應(yīng)的由α-酮丁酸合成正丙醇的產(chǎn)量就有所下降；由α-酮酸-β-甲基戊酸到活性戊醇這條途徑中，關(guān)鍵基因有PDC1、PDC5、PDC6、ARO10和THI3，只有PDC6基因下調(diào)20.15倍，這有可能是活性戊醇下降的原因。由α-酮基異戊酸到異丁醇這條途徑中關(guān)鍵基因主要有PDC1、PDC5、PDC6，所以PDC6表達(dá)明顯下調(diào)，也可能是異丁醇下降的原因。在異戊醇這條代謝途徑中，關(guān)鍵的基因有LEU1、LEU2、LEU4、LEU5、THI3，而這些基因都沒有檢測到轉(zhuǎn)錄水平的變化，但是異戊醇的產(chǎn)量下降明顯，說明醋酸有可能使這些酶的酶活下降或者還有其他基因的表達(dá)水平的變化能影響到異戊醇的產(chǎn)量。

在培養(yǎng)基初始醋酸質(zhì)量濃度為6 g/L時，與對照組相比，高產(chǎn)酯釀酒酵母變化倍數(shù)最大的基因是DAL80，下調(diào)了53.34倍，DAL80是多種氮降解途徑的負(fù)調(diào)控基因，說明這個基因可能在高級醇調(diào)控中具有重要作用；其次變化大的基因為GAP1，下調(diào)了40.57倍，這個基因是通用型氨基酸通透酶，負(fù)責(zé)酵母氨基酸轉(zhuǎn)運；脯氨酸通透酶PUT4下調(diào)了27.18倍，這也可能跟高級醇的降低有關(guān)系。

3 結(jié)論

保持高產(chǎn)酯釀酒酵母接種量不變，添加醋酸菌菌懸液在發(fā)酵前期對釀酒酵母的生長有所抑制，醋酸菌菌懸液添加量為20 mL時，酵母數(shù)比單獨發(fā)酵下降了28%，乙酸乙酯增加了12%，醋酸菌菌懸液添加量下對釀酒酵母酒精發(fā)酵及高級醇代謝影響不大；但是培養(yǎng)基內(nèi)醋酸質(zhì)量濃度對釀酒酵母生長及代謝的影響很大，隨著培養(yǎng)基內(nèi)醋酸質(zhì)量濃度的增加(0～6 g/L)，高產(chǎn)酯釀酒酵母的乙酸酯類和高級醇含量逐漸降低，但是高產(chǎn)酯釀酒酵母的酒精發(fā)酵正常，72 h后乙醇產(chǎn)量在74 g/L左右。當(dāng)醋酸質(zhì)量濃度為8 g/L時，高產(chǎn)酯釀酒酵母的酒精發(fā)酵及酯醇代謝被完全抑制，乙醇產(chǎn)量僅為11.34 g/L，乙酸酯和高級醇比對照組下降約90%。

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)初始醋酸質(zhì)量濃度為6 g/L時，與對照組相比，高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15共有394個基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，282個基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，這些差異基因主要富集在高產(chǎn)酯釀酒酵母細(xì)胞膜的組成，其中高產(chǎn)酯釀酒酵母的碳代謝、TCA循環(huán)、氨基酸生物合成、糖酵解、氧化磷酸化、硫胺酸代謝、丙酮酸代謝等多條代謝途徑受到影響。

白酒生產(chǎn)是多菌種混合發(fā)酵，發(fā)酵過程中參與的微生物種類繁多，而且不同的微生物對釀酒酵母的影響各有不同，本實驗研究了醋酸菌(巴氏醋桿菌)對釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的表型差異與轉(zhuǎn)錄組差異，想要透徹了解相互作用機理，還需進(jìn)一步從基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行更深層次的研究。